Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cho l lactate oxidase của chủng lactococcus lactis subsp lactis VLSH 12 trong escherichia coli

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGHUYÊN SINH VẬT -oOo LẠI THỊ HỒNG NHUNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO L-LACTATE OXIDASE CỦA CHỦNG LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP LACTIS VLSH12 TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 12/2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGHUYÊN SINH VẬT -oOo LẠI THỊ HỒNG NHUNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO L-LACTATE OXIDASE CỦA CHỦNG LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP LACTIS VLSH12 TRONG ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành Vi sinh vật Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Kim Thoa Hà Nội, Tháng 12/2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men truyền thống Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học hai chủng vi khuẩn lactic VLSH-12 25 VLSH-18 Bảng 3.3: Khả sử dụng chất Kit API 50 CHL hai chủng vi 28 khuẩn lactic VLSH-12 VLSH-12 Bảng 3.4: Kết so sánh trình tự gen Lox chủng L lactis subsp lactis 30 VLSH-12 với trình tự công bố Genbank 34 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc tổng thể L-lactate oxidase chủng A viridans Hình 1.2: Vị trí ion Zn hai tetramer L-lactate oxidase Hình 1.3: Cấu tạo biosensor………………………………………………… Hình 2.1: Sơ đồ tái tổ hợp gen Lox promoter gen α-amylase chủng B 10 subtilis 168M phương pháp Megarprimer Hình 3.1: Xác định vi khuẩn lactic nhờ vòng phân giải CaCO3 Hình 3.2: Hoạt tính L-lactate oxidase chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 22 25 mẫu thực phẩm lên men truyền thống Hình 3.3: Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn lactic VLSH-12 (trái) chủng 27 VLSH-18 (phải) kính hiển vi điện tử quét Hình 3.4: Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA hai chủng vi khuẩn lactic 29 VLSH-12 (1) VLSH-18 (2) Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn lactic VLSH-12 Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn lactic VLSH-18 Hình 3.7 Sản phẩm đoạn gen Lox khuếch đại từ chủng L lactic subsp lactic Hình 3.8: Plasmid pTZ57R/T mang đoạn gen ngoại lai Lox từ chủng L lactis 31 32 32 33 subsp lactis VLSH-12 cắt kiểm tra enzyme giới hạn HindIII EcoRI Hình 3.9: Trình tự gen protein LOX từ chủng L lactic subsp lactic 34 VLSH-12 Hình 3.10: Sản phẩm PCR1a Hình 3.11: Sản phẩm PCR trình nhân gen PCR1b PCR2 Hình 3.12: Plasmid pTZ57R/T[Bspr.Lox] cắt HindIII EcoRI để 35 36 38 kiểm tra đoạn DNA ngoại lai Hình 3.13: Plasmid pHV33 mang tổ hợp [Bspr.Lox] cắt kiểm tra 38 EcoRI HindIII Hình 3.14 Bản đồ giới hạn gen Lox tái tổ hợp với vector pHV33 Hình 3.15: Ảnh hưởng nồng độ glucose lên trình biểu L-lactate 40 40 oxidase Hình 3.16: Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình biểu L-lactate oxidase Hình 3.17: Ảnh hưởng tốc độ lắc lên trình biểu L-lactate oxidase Hình 3.18: Sản phẩm trình tinh protein L-lactate oxidase 42 43 44 45 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lactate tiêu phân tích quan trọng nhiều lĩnh vực y tế, thể thao, công nghiệp thực phẩm, sản xuất rượu vang Trong thể người động vật có vú, gen L-lactate oxidase có chức mã hóa cho enzyme tương ứng nhằm điều hòa nồng độ lactate thể Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác nhau, hoạt động gen bị kìm hãm dẫn đến rối loạn chuyển hóa lactate thể gây bệnh lý liên quan đến cường lactate hay bệnh lý thiếu hụt oxy suy tim, suy hô hấp, suy thận, thiếu máu cấp, nhồi máu tim… Bởi vậy, y học số lactate máu thường dùng để phát đánh giá tình trạng bệnh Vì vậy, việc kiểm soát nồng độ lactate số sinh hóa đóng vai trò vô quan trọng Sự tích lũy lactate thể nhiều lí khác trình chuyển hóa axit pyruvic sinh trình đường phân tế bào từ thức ăn, đặc biệt sản phẩm thực phẩm lên men Cơ thể người đồng hóa L-lactate giới hạn định, D-lactate không đồng hóa bị đào thải qua nước tiểu Việc đào thải lactate qua nước tiểu nguyên nhân tích đọng thận, gây bệnh sỏi thận L-lactate oxidase từ lâu ứng dụng làm kit sinh hóa, biosensor để phát lactate chẩn đoán lâm sàng sản xuất công nghiệp Hơn nữa, enzyme có khả làm giảm nồng độ lactate, nên có tiềm ứng dụng điều trị bệnh có liên quan đến rối loạn lactate thể Hiện giới, L-lactate oxidase tinh chế thương mại hóa công ty hóa chất Sigma, Genzyme Diagnostic… Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu L-lactate oxidase lactate biosensor Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng biểu gen mã hóa cho L-lactate oxidase của chủng Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 Escherichia coli” với nội dung nghiên cứu sau: Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp L-lactate oxidase - Tách dòng gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Tái tổ hợp gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Biểu gen mã hóa cho L-lactate oxidase của chủng tuyển chọn Escherichia coli Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn lactic nhóm không đồng vi sinh vật sinh axit lactic sản phẩm cuối trình lên men carbohydrates [1] Axit lactic sinh dạng đồng phân D(-), L(+) DL phụ thuộc vào gen lactate dehydrogenase (LDH) chế hoạt động ứng với loài vi sinh vật Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc Eubacteriales Nhóm vi khuẩn không đồng mặt hình thái (gồm hình que hình cầu), chúng tương đối đồng mặt sinh lý Đặc điểm chung vi khuẩn lactic vi khuẩn Gram (+), kỵ khí vi hiếu khí, không sinh bào tử, không di động, cytochrome, catalase âm tính, có khả chịu axit Vi khuẩn lactic thường có mặt thực phẩm giàu dinh dưỡng sữa, sản phẩm lên men từ sữa, thịt, đồ uống, số khác tìm thấy niêm mạc miệng, ruột âm đạo động vật có vú hay xác động – thực vật phân hủy Trừ số loài, phần lớn vi khuẩn lactic không gây bệnh công nhận an toàn Các vi khuẩn lactic điển hình thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella Việc phân loại vi khuẩn lactic vào chi khác chủ yếu dựa hình thái, chế lên men glucose, nhiệt độ sinh trưởng, dạng đồng phân axit lactic tạo thành, khả chịu muối, chịu axit, chịu kiềm…Tuy nhiên, ngày phương pháp phân loại đại trình tự 16S rRNA, PCR, mẫu protein hòa tan sử dụng song song với phương pháp truyền thống Các vi khuẩn lactic khác có nhu cầu dinh dưỡng không giống nhau, nhìn chung chúng có đòi hỏi cao dinh dưỡng, đặc biệt loại vitamin nguồn nitơ Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại carbohydrate, từ loại đường (glucose, fructose, mannose, galactose, saccharose, lactose, maltose) cho Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ đến polysaccharide (tinh bột, dextrin) Trong đó, nguồn chất quan trọng vi khuẩn lactic monosaccharide disaccharide Các nguồn carbon dùng để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào sinh axit hữu khác axit lactic, axit acetic, axit pyruvic, axit malic, axit fumaric axit formic [2] Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ sản phẩm thực phẩm, sử dụng axit gluconic axit galactorunic tạo thành CO 2, axit acetic axit lactic Trong trình lên men chất, vi khuẩn lactic sử dụng axit amin axit glutamic, arginine, tyrosine làm nguồn cung cấp lượng, xảy trình decarboxyl tạo CO2 Vi khuẩn lactic loài hô hấp tuỳ tiện, chúng có khả oxy hoá nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử Điều thực nhờ hệ enzyme FAD Quan hệ với oxy loài khác khác Chẳng hạn loài Pediococcus sp, Lactobacillus plantarum đồng hoá glycerin điều kiện hiếu khí Một vài loài Leuconostoc cần có mặt oxy giai đoạn đầu để đồng hoá hexose Loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri cần oxy để oxy hoá hexose, gluconate Sự ảnh hưởng oxy phụ thuộc vào nhiệt độ, ví dụ vài chủng loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt 30oC điều kiện yếm khí, 37 oC phát triển điều kiện hiếu khí [3, 4, 5] Quá trình oxy hoá vi khuẩn lactic thường kèm theo việc tạo thành H 2O2 đồng thời số vi khuẩn lactic Streptococcus faecalis, Streptococcus brevis, Leuconostoc mesenteroides khử H2O2 thành nước với tham gia số chất bị oxy hoá [4] 1.1.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic Với phạm vi ứng dụng vô rộng lớn, từ lâu vi khuẩn lactic sử dụng công nghiệp hóa chất, thực phẩm, nông nghiệp, vật liệu, môi trường Hơn thế, vi khuẩn lactic có giá trị to lớn sức khỏe người, giúp điều hòa hệ miễn dịch, tăng cường chức tiêu hóa, bảo vệ đường ruột, kháng lại số tác Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhân gây bệnh [6] Chính lí này, mà số chủng vi khuẩn lactic sử dụng chế phẩm prebiotic bổ sung dạng vi khuẩn chức vào thực phẩm [7] Không dừng lại ứng dụng truyền thống, nhà khoa học tìm kiếm thử nghiệm hướng cho vi khuẩn lactic Một hướng đầy triển vọng sản xuất nhựa sinh học (bio-plastic) Đây loại vật liệu có nguồn gốc từ nông nghiệp ngô, củ cải, lúa mì, tổng hợp từ sản phẩm lên men lactic Nhựa sinh học dự đoán dùng để thay cho vật liệu tương ứng có nguồn gốc dầu mỏ tương lai Ngoài ra, hệ, phức hệ enzyme vi khuẩn lactic đường chuyển hóa chất khác quan tâm nghiên cứu, với mục đích ứng dụng công nghiệp dược phẩm y sinh học 1.2 L-lactate oxidase 1.2.1 L-lactate Trải qua nghiên cứu nhiều thập kỷ qua, lactate coi tiêu phân tích quan trọng y tế lâm sàng, y học thể thao công nghiệp chế biến thực phẩm L-lactate chất chuyển hóa hình thành từ trình trao đổi chất kị khí bắp Quá trình sản sinh lactate kèm với gia tăng proton tế bào, lượng lactate tạo đủ cao để làm thay đổi nồng độ proton tế bào, pH tế bào giảm Điều gây tượng nhiễm toan tế bào (cell acidosis) cản trở hoạt động bắp [8] Trong thể người, nồng độ L-lactate máu dao động khoảng 0.5 – 1.5 mM trạng thái nghỉ ngơi tăng đến 12 mM vận động [9], chí đạt mức 25 mM tập tập toàn thân điều kiện đặc biệt [10] Nồng độ lactate huyết tương đòi hỏi kết hợp cách hài hòa yếu tố có ảnh hưởng đến cân lượng lactate tạo lượng lactate bị đào thải Nếu cân bị phá vỡ gây tượng nhiễm toan lactic Lượng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Công nghệ sinh học) Kết đọc trình tự cho thấy tái tổ hợp thành công hai đoạn gen Bspr Lox, khoảng cách từ promoter đến mã khởi đầu gen Lox dịch mã không bị ngắt quãng, đảm bảo cho trình phiên mã dịch mã sau tiến hành thuận lợi Khả tái tổ hợp xác đoạn gen mong muốn ưu điểm phương pháp megaprimer so với phương pháp sử dụng enzyme cắt hệ vector biểu có chứa promoter 3.5.5 Tái tổ hợp [Bspr.Lox] vào vector thoi pHV33 Để đưa gen Lox từ chủng VLSH-12 Bspr vào biểu E coli BL21(DE3), đoạn DNA tái tổ hợp [Bspr.Lox] chuyển từ vector pTZ57R/T sang vector pHV33.Vector pTZ57R/T[Bspr.Lox] cắt HindIII EcoRI, tách đoạn DNA [Bspr.Lox] gel điện di, làm gắn vào điểm cắt tương ứng loại phosphate vector pHV33 Vector tái tổ hợp mới, ký hiệu pHV33[Bspr.Lox] biến nạp trực tiếp vào E coli BL21(DE3) phương pháp xung điện 1800V Plasmid từ khuẩn lạc chủng E coli BL21(DE3).tái tổ hợp tách cắt kiểm tra HindIII EcoRI (Hình 3.13), plasmid có chứa đoạn gen kích thước khoảng 1400 bp thu nhận kiểm tra hoạt tính Kết kiểm tra hoạt tính cho thấy khuẩn lạc có hoạt tính, plasmid có chứa đoạn DNA ngoại lai, khuẩn lạc đối chứng plasmid đoạn DNA Các kết cho phép khẳng định hoạt tính khuẩn lạc tái tổ hợp gen Lox ngoại lai vector định Tế bào E coli BL21(DE3) tái tổ hợp thu có hoạt độ LOX đạt 63 U/ml, cao chủng dại có 51,3 U/ml tương đương với hoạt tính enzyme từ chủng nấm men Yarrowia lipolytica [10], nguồn LOX điển hình gen mã hóa cho LOX từ chủng nấm men biểu tinh chế để ứng dụng rộng rãi sản phẩm thương mại ngành dược phẩm y sinh Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ M 7273 bp 8000 bp 6000 bp 1335 bp 1000 bp Hình 3.13: Plasmid pHV33 mang tổ hợp [Bspr.Lox] cắt kiểm tra EcoRI HindIII 1: Plasmid pHV33 mang tổ hợp [Bspr.Lox] cắt EcoRI HindIII; M: Marker 1kb (NEB) Chủng E coli tái tổ hợp thu nhận mang vector tái hợp pHV33[Bspr.Lox.] có cấu trúc sau: Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.14 Bản đồ giới hạn gen Lox tái tổ hợp với vector pHV33 3.6 Biểu LOX chủng tái tổ hợp mang gen Lox Chủng E coli tái tổ hợp thu nhận mang gen Lox với promoter từ chủng B subtilis 168M Promoter nhiễm sắc thể cảm ứng tinh bột, trường hợp nằm plasmid nên không cần đến tinh bột để cảm ứng, mà trình điều hòa biểu phụ thuộc hoàn toàn vào trình sinh trưởng chủng tái tổ hợp Trong nồng độ glucose, phosphate yếu tố giới hạn ảnh hưởng đến trình biểu gen, nhiên glucose vừa chất vừa yếu tố giới hạn nên ảnh hưởng nhiều đến trình biểu gen Vì lựa chọn glucose làm yếu tố điều hòa trình tổng hợp biểu gen Hơn nữa, E coli B subtilis có yếu tố điều khiển trình biểu gen gen Lox tái tổ hợp hoàn toàn biểu E coli Do đó, tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên trình biểu gen Lox sau: 3.6.1 Ảnh hưởng nồng độ glucose lên biểu L-lactate oxidase chủng tái tổ hợp Glucose yếu tố điều hòa trình biểu L-lactate oxidase, việc khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến trình biểu L-lactate oxidase tế bào E coli BL21(DE3) cần thiết Chủng tái tổ hợp nuôi lắc tốc độ 200 rpm/phút, 37ºC 48 giờ, môi trường TB-ampicillin có bổ sung glucose với nồng độ 0, , 4, 6, g/l Kết trình bày hình 3.15 cho thấy, bổ sung glucose với nồng độ g/l, hoạt tính LOX tăng mạnh, gấp khoảng lần so với glucose Ở nồng độ g/l hoạt tính thu cao (84,7 U/ml) Như vậy, nồng độ 6g/l nồng độ glucose tối ưu để biểu L-lactate oxidase Hình 3.15: Ảnh hưởng nồng độ glucose lên trình biểu L-lactate oxidase Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên biểu L-lactate oxidase chủng tái tổ hợp Nhiệt độ yếu tố điều hòa trình biểu gen Lox chủng tái tổ hợp Ảnh hưởng nhiệt độ lên biểu gen chủng tái tổ hợp khác nhau, phụ thuộc vào mối tương quan chủng chủ vector mang gen ngoại lai Với chủng chủ, gen tái tổ hợp vector khác có nhiệt độ tối ưu cho trình biểu gen khác Chính vậy, việc xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên trình biểu gen nghiên cứu bắt buộc để tối ưu trình biểu gen chủng tái tổ hợp, với mục địch thu nhận enzyme nói chung LOX nói riêng Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên trình biểu gen Lox, chủng tái tổ hợp nuôi lắc tốc độ 200 rpm/phút 48 giờ, môi trường TB + ampicillin + glucose (6 g/l) nhiệt độ 20, 25, 30 37 oC Kết thể hình 3.16 cho thấy, chủng tái tổ hợp phát triển tốt nhiệt độ 30 37 oC Kết hoàn toàn hợp lý, chủng chủ phát triển dải nhiệt độ tối ưu 30 ÷ 37 oC Có thể thấy, khả biểu gen Lox chúng tái tổ hợp phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Ở nhiệt độ 20 25oC, gen Lox biểu yếu, hoạt lực LOX đạt tối đa 47,3 58,5 U/ml Trong nhiệt độ 30 37 oC hoạt lực LOX lại cao, 30 oC hoạt lực LOX đạt giá trị cao 110 U/ml Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.16: Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình biểu L-lactate oxidase 3.6.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên biểu L-lactate oxidase chủng tái tổ hợp L-lactate oxidase monooxygenase nên đòi hỏi có mặt oxy phân tử chuỗi truyền điện tử Hơn nữa, nồng độ oxy bão hòa môi trường biểu ảnh hưởng nhiều đến trình biểu gen Để khảo sát mức độ ảnh hưởng này, tiến hành nghiên cứu biểu gen Lox điều kiện lắc 100 ml bình tam giác 500 ml, với tốc độ 100 rpm, 150 rpm 200 rpm Kết hình 3.17 cho thấy, tốc độ lắc cao 200 rpm, hoạt tính LOX cao nhất, đạt 130 U/ml Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.17: Ảnh hưởng tốc độ lắc lên trình biểu L-lactate oxidase 3.7 Tinh protein L-lactate oxidase Quá trình tinh LOX mô tả phần 2.3.9 Theo đó, LOX kết tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 nồng độ bão hòa 30% 70% trước chuyển lên hệ thống cột sắc ký Mười lăm phân đoạn (4,5 ml/phân đoạn) có hoạt tính LOX cao thu nhận sau cột trao đổi ion DEAE-Sepharose tiếp tục tinh qua cột HAP Tiếp tục thu nhận 10 phân đoạn có hoạt tính LOX cao (1,5 ml/phân đoạn) để đưa lên cột lọc gel Sau qua cột Superdex 75, thu phân đoạn có hoạt tính LOX cao (0,5 ml/phân đoạn) Cuối cùng, dịch protein cô lại đạt thể tích cuối ~ 500 µl Kết trình tinh protein thể hình 3.18 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.18: Sản phẩm trình tinh protein L-lactate oxidase M: Protein marker (NEB); 1:Dịch thu sau phá tế bào sóng siêu âm; 2: Sản phẩm protein LOX sau qua cột DEAE – Sepharose; 3: Sản phẩm protein LOX sau qua cột HAP; 4: Sản phẩm protein LOX sau qua cột lọc gel Superdex 75 Kết hình 3.18 cho thấy sản phẩm protein L-lactate oxidase băng có kích thước khoảng 41 kDa Kết phù hợp với công bố Toda Nishiya LOX từ chủng Lactococcus lactis [23] Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƯƠNG KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp L-lactate oxidase cao chủng VLSH-12 VLSH-18 với hoạt độ 51,3492 U/ml enzyme 40,3549 U/ml enzyme - Từ đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, Kit phân loại API 50 CHL trình tự gen 16S rRNA định tên chủng VLSH-12 Lactococcus lactis subsp lactis VLSH12 chủng VLSH-18 Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii VLSH-18 - Đã nhân dòng giải trình tự gen Lox chủng Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 Gene có kích thước 1152 bp, mã hóa cho 384 amino acid, có độ tương đồng 98 - 100 % so với gene Lox chủng Lactococcus lactis subsp lactis khác công bố GenBank - Đã tái tổ hợp thành công hệ biểu gen Lox pHV33 sử dụng promoter gen alpha amylase từ chủng Bs 168M biểu E coli BL21(DE3) - Lựa chọn số yếu tố để nâng cao khả biểu chủng E coli tái tổ hợp môi trường TB có bổ sung glucose nồng độ 6g/l; nhiệt độ 30 oC tốc độ lắc 200 rpm, hoạt tính LOX đạt 130 U/ml - Đã tinh enzyme tái tổ hợp từ chủng tái tổ hợp E coli BL21(DE3) pHV33[Bspr.Lox] Protein tinh có kích thước khoảng 41 kDa 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu biểu L-lactate oxidase chủng Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 Bacillus với mục đích thu nhận enzyme công nghiệp, làm nguyên liệu sản xuất lactate bioensor Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Carr F.J.,Chill D., Maida N (2002) The lactic acid bacteria: A literature survey Crit Rev Microbiol 28: 281-370 Kleerebezem M., Hugenholtz J (2003) Metabolic pathway engineering in lactic acid bacteria Curr Opin Biotechnol 14(2):232-7 Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn, Phạm Việt Cường (2005), Tách dòng, đọc trình tự 16S rRNA khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus HN02, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Trường Đại học Y Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 1432-1434 Yoo DK, Kim D (2006) Synthesis of lactide from oligomeric PLA: effect of temperature, pressure and catalyst Macromol.Res 5:510-516 Bo L (2008) Synthesis of polylactic acid J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res 12(23):4594-4596 Vaughan E.E., Heilig H.G., Ben-Amor K., de Vos W.M (2005) Diversity, vitality and activities of intestinal lactic acid bacteria and bifidobacteria assessed by molecular approaches FEMS Microbiol Rev 29:477-490 Ljungh A., and Wadström T (2006) Lactic acid bacteria as probiotics Curr Issues Intest Microbiol 7:73-89 Kemp G (2005) Lactate accumulation, proton buffering, and pH change in ischemically exercising muscle Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289(3):R895-R901 CrossRef Stanley WC., Gertz EW., Wisneski JA., Morris DL., Neese RA., Brooks GA (1985) Systemic lactate kinetics during graded exercise in man Am J Physiol 249(6 Pt 1):E595-E602 10 Goodwin ML., Harris JE., Hernandez A., Gladden LB (2007) Blood lactate measurements and analysis during exercise: a guide for clinicians J Diabetes Sci Technol 1(4):558-569 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 Valenza F, Aletti G, Fossali T, Chevallard C, Sacconi F, Irace M, Gattioni L (2005) Lactate as a marker of energy failure in critically ill patients: hypothesis Crit Care 9(6):588-593 CrossRef 12 Rassaei L., Olthuis W., Tsujimura S., Sudhölter E J R., van den Berg A (2013) Lactate biosensors: current status and outlook Analytical and Bioanalytical Chemistry Online publication date: 14-Sep-2013 13 Naylor E., Aillon D.V., Barrett B.S., Wilson G.S., Johnson D.A., Harmon H.P., Gabbert S., Petillo P.A (2012) Lactate as a biomarker for sleep Sleep 2012 35:1209-22 14 Lloret A., Boido D., Lorenzo D., Medina K., Carrau F., Dellacassa E., Versini G (2002) Aroma variation in Tannat wines: effect of malolactic fermentation on ethyl lactate level and its enantiomeric distribution 2002 Ital J Food Sci 14, 175 15 Stekelenburg F.K., Kant-Muermans M.L.T (2001) Effects of sodium lactate and other additives in a cooked ham product on sensory quality and development of a strain of Lactobacillus curvatus and Listeria monocytogenes INT J F MIC 66(3):97-203 16 Udaka S., Koukol J., and Vennesland B (1959) Lactic oxidase of pneumococcus J Bacteriol 78:714-725 17 Biryukova EN., Stupar YO., Arinbasarova AY., Medentsev AG (2009) Yarrowia lipolytica, a producer of L-lactate oxidase Microbiology 78(5):650-652 18 Sztajer H., Wang W., Lundsford H., Stocker A (1996) Purification and some properties of a novel microbial lactate oxidase Appl Microbiol Biotechnol 45:600-606 19 Yorita K., Aki K., Ohkuma-ST., Kokubo T., Misaki H., Massey V (1996) Conversion of L-lactate oxidase to a long chain α-hydroxyacid oxidase by sitedirected mutagenesis of alanine 95 to glycine J Biol Chem 271:28300-28305 20 Gu J., Xu P., Qu Y (2002) A biocatalyst for pyruvate preparation from DL-lactate: lactate oxidase in a Pseudomonas sp J Mol Catal B: Enzyme., 18: 299-305 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 21 Seki M., Iida K., Saito M., Nakayama H., Yoshida S (2004) Hydrogen peroxide production in Streptococcus pyogenes: Involvement of lactate oxidase and coupling with aerobic utilization of lactate J Bacteriol 186(7):2046-2051 22 Taniai H., Iida K., Seki M., Saito M., Shiota S., Nakayama H., Yoshida S (2008) Concerted action of lactate oxidase and pyruvate oxidase in aerobic growth of Streptococcus pneumoniae: Role of lactate as an energy source J Bacteriol 190(10):3572-3579 23 Toda A and Nishiya Y (1998) Gene cloning, purification, and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp cremoris IFO3427 J Ferment Bioeng 85(5):507-510 24 Kupletskaya M.B., Sukhacheva M.V., Kurakov A.V., Netrusov A.I (2007) Poisk mikroorganizmov-produtsentov laktatoksidazy Prikl Biokhim Mikrobiol 4(2):199-202 25 Duncan J.D., Wallis J.O., Azari M.R (1989) Purification and properties of Aerococcus viridans lactate oxidase Biochem Biophys Res Commun 164:919926 26 Dong J.M., Taylor J.S., Latour D.J., Iuchi S., Lin E.C.C.C (1993) Three overlapping lct genes involved in L-lactate utilization by Escherichia coli J Bacteriol 175:6671-6678 27 Maeda-Yorita K., Aki K., Sagai H., Misaki H., Massey V (1995) L-lactate oxidase and L-lactate monooxygenase: Mechanistic variations on a common structural theme Biochimie 77:631-642 28 Minagawa H., Nakayama N., Nakamoto S (1995) Thermostabilization of lactate oxidase by random mutagenesis Biotechnol Lett 17:975-980 29 Llanos R.M., Hillier A.J., Davidson B.E (1992) Cloning, nucleotide sequence, expression, and chromosomal location of ldh, the gene encoding L-(+)-lactate dehydrogenase, from Lactococcus lactis J Bacteriol 174:6956-6964 30 Griffin H.G., Swindell S.R., Gasson M.J (1992) Cloning and sequence analysis of the gene encoding L-lactate dehydrogenase from Lactococcus lactis: evolutionary relationships between 21 different LDH enzymes Gene 122:193-197 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 31 Urbach E., Daniels B., Salama M.S., Sandine W.E., Giovannoni S.J (1997) The ldh phylogeny for environmental isolates of Lactococcus lactis is consistent with rRNA genotypes but not with phenotypes Appl Environ Microbiol 63:694-702 32 Toda A and Nishiya Y (1998) Gene cloning, purification, and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp cremoris IFO3427 J Ferment Bioeng 85(5):507-510 33 Morimoto Y., Yorita K., Aki K., Misaki H., Massey V (1998) Biochimie.80: 309– 312 34 Leiros I, Wang E,Rasmussen T, Repo H, Oksanen E, Petersen E.B, Heikinheimo P, Hough E (2006) The 2.1 Å structure of Aerococcus viridans L-lactate oxidase (LOX) Acta Cryst F62, p 1185-1190 35 Leland C., Clark Jr., C.L (1962) Electrode systems for continous monitoring in cardiovascular surgery Annals of the New York Academy of Sciences, 102 (Automated and Semi-Automated Systems in Clinical Chemistry):29-45 36 Turner A; Wilson G., Kaube I (eds.) (1987) Biosensors:Fundamentals and Applications Oxford, UK: Oxford University Press p.770 37 Enzyme Technology written by Martin Chaplin and Christopher Bucke., Cambridge University Press, 1990 38 Grieshaber D., MacKenzie R., Vörös J., Reimhult E (2008) Biosensors-Sensor Principles and Architectures SensorsVol: 8(3):1400-1458 39 Parra A., Casero E., Vazquez L., Pariente F., Lorenzo E (2006) Design and characterization of a lactate biosensor based on immobilized lactate oxidase onto gold surfaces.AnalChimActa 555:308–315 40 Marzouk S.A.M., Cosofret V.V., Buck R.P., Yang H., Cascio W.E., Hassan S.S.M (1997) A conducting salt-based amperometric biosensor for measurement of extracellular lactate accumulation in ischemic myocardium Anal Chem 69:2646– 2652 41 Haccoun J., Piro B., Tran L.D., Dang L.A., Pham M.C (2004) Reagentless amperometric detection of L-lactate on an enzyme-modified conducting copolymer Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ poly(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone-co- 5-hydroxy-3-thioacetic acid-1,4-naph- thoquinone) Biosens Bioelectron 19:1325–1329 42 Palmisano F., Rizzi R., Centonze D., Zambonin P.G (2000) Simultaneous monitoring of glucose and lactate by an interference and cross-talk free dual electrode amperometric biosensor based on electropolymerized thin films Biosens Bioelectron 15:531–539 43 Suman S., Singhal R., Sharma A.L., Malthotra B.D., Pundir C.S (2005) Development of a lactate biosensor based on conducting copolymer bound lactate oxidase Sensors and Actuators B: Chemical 107 (2): 768-772 44 Trojanowicz M., Geschke O., Krawczyk T.K.V., Cammann K (1995) Biosensors based on oxidases immobilized in various conducting polymers Sens Actuat B 28:191–199 45 Park T.M., Iwuoha E.I., Smyth M.R., Freaney R., McShane A.J (1997) Sol-gel based amperometric biosensor incorporating an osmium redox polymer as mediator for detection of L-lactate.Talanta.44:973–978 46 Lowinsohn D., Bertotti M (2007) Flow injection analysis of blood L-lactate by using a Prussian Blue-based biosensor as amperometric detector Anal Biochem 365:260–265 47 Palmisano F, Quinto M, Rizzi R, Zambonin P.G (2001) Flow injection analysis of L-lactate in milk and yogurt by on-line microdialysis and amperometric detection at a disposable biosensor Analyst 126:866–870 48 Turner A.P.F, Karube I, Wison G.S (1987) Biosensors: Fundamentals and Applications Oxford University Press, Oxford science, oxford, UK, pp:770 49 Rahman M.M (2010) Fabrication of L-lactate biosensor based on redox species mediated lactate oxidase using micro-device Int J Biol Med Res 1(3): 09-14 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 Chen J., Jin Y.L (2011) Sensitive lactate determination based on acclimated mixed bacteria and palygorskite co-modified oxygen electrode Bioelectrochemistry 80(2):151-154 CrossRef 51 Sambrook, J, Fritsch, EF, Maniatis, T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Press NY 18.47-18.59 52 Seidman C E., Struhl K., Sheen J., Jessen T (1997), Current Protocols in Molecular Biology 1.8.1-1.8.10 53 Minagawa H., Jiro Shimada J., Kaneko H (2003) Effect of mutations at Glu160 and Val198 on the thermostability of lactate oxidase European Journal of Biochemistry Vol 270(17):3628–3633 54 Barré O., Mourlane F., Solioz M (2007) Copper induction of lactate oxidase of Lactococcus lactis: a novel metal stress response J Bacteriol 189:5947–5954 55 Taurino I., Reiss R., Richter M., Fairhead M., Thöny-Meyer L., Giovanni D.M, Carrara S (2013) Comparative study of three lactate oxidases from Aerococcus viridans for biosensing applications Electrochimica Acta 93:72–79 56 Nawawi A.R., Baiano C.F.J., Kvennefors E C., Barnes C.A (2009) Appl Environ Microbiol 75(9): 2908–2919 57 Gibello A., Collins M D., Domínguez L., Fernández-Garayzábal J F., Richardson P T (1999) Cloning and analysis of the L-Lactate utilization genes from Streptococcus iniae Appl Environ Microbiol 65:4346-4350 58 Walker J E., and B Miroux (1999) Selection of Escherichia coli hosts that are optimized for the overexpression of proteins Manual of industrial microbiology and biotechonlogy, 2nd ed ASM Press, Washington, D.C p 575-584 59 Samuelson J.C (2011) Recent developments in difficult protein expression: a guide to E coli strains, promoters, and relevant host mutations Methods Mol Biol 705:195-209 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 60 Bron S., Meima R., van Dijl J.M., Wipat A., Harwood C R (1998) Molecular biology and genetics of Bacillus species., In, Molecular Biology of Industrial Microorganisms ASM press Washington D.C.pp 392-416 61 Khosla C, Curtis J.E, Bydalek P, Swartz J.R, Bailey J.E (1990) Expression of recombinant proteins in Escherichia coli using an oxygen-responsive promoter Biotechnology 8(6):554-8 62 Upender M (1995) Megaprimer method for in vitro mutagenesis using parallel templates Biotech 18(1):29-30 63 Laemmli U.K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259):680-685 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...]... chỉ có 6 chủng (VLSH- 05, VLSH- 06, VLSH- 12, VLSH- 15, VLSH- 18 và VLSH- 25) có hoạt tính LOX cao hơn 30 U/ml Từ đó, chúng tôi chọn được 2 chủng có hoạt tính LOX cao nhất l chủng VLSH- 12 và VLSH- 18, với hoạt tính l n l ợt l 51,3492 U/ml và 40,3549 U/ml Hoạt tính của chủng VLSH- 12 l cao nhất trong số 27 chủng vi khuẩn lactic phân l p, tương đương với hoạt tính enzyme từ chủng nấm men Yarrowia lipolytica... 99,4% so với chủng Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii BCRC12195 (NR_043183.1) Từ kết quả này, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại của 2 chủng vi khuẩn lactic này (Hình 3.5, Hình 3.6) và hai chủng vi khuẩn VLSH- 12 và VLSH- 18 được đặt tên l Lactococcus lactis subsp lactis VLSH- 12 và Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii VLSH- 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/... định của cả hai chủng ở mức rất tốt (% ID ≥ 99,0 và T ≥ 0,5) Kết hợp với khóa phân loại vi khuẩn của Bergey cho thấy chủng vi khuẩn VLSH- 12 có các đặc điểm tương tự với loài Lactococcus lactis subsp lactis và chủng vi khuẩn VLSH- 18 có đặc điểm tương tự với loài Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii Bảng 3.3: Khả năng sử dụng các cơ chất trong Kit API 50 CHL của hai chủng vi khuẩn lactic VLSH- 12 và. .. VLSH- 12 và VLSH- 18 stt 0 1 2 3 4 Phép thử Control Glycerol Erythritol D-Arabinose L- Arabinose Chủng VLSH- VLSH1 2 18 + - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu stt 25 26 27 28 29 Phép thử Esculine Salicine Cellobiose Maltose Lactose Chủng VLSH- VLSH1 2 18 + + + ± + ± + + + + http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 6 7 8 Ribose D-Xylose L- Xylose Adonitol β-Methylxyloside Galactose D-Glucose D-Fructose D-Mannose L- Sorbose... Đây l một trong những nguồn LOX điển hình và gen mã hóa cho LOX từ chủng nấm men này đã được tách dòng, biểu hiện và tinh chế để ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm L- lactate oxidase activity (U/ml enzyme) thương mại trong ngành dược phẩm hoặc y sinh 60 50 40 30 20 10 0 6 4 5 1 2 4 7 8 1 2 3 3 9 -10 -0 -1 -0 -0 -0 -0 -0 -1 -0 -0 -0 -1 -1 SH LS H LSH LSH LSH LSH LS H LSH LSH LSH LSH LSH LSH LSH L V... dòng gen Lox Tách dòng gen l quá trình tách một đoạn gen cần quan tâm ra khỏi DNA nhiễm sắc thể của sinh vật và nhân đoạn gen này l n thành dòng với số l ợng l n Các vi sinh vật được dùng l m chủng chủ để tách dòng gen rất đa dạng [51], [52] Đối với gen Lox chủng chủ được sử dụng để tách dòng chủ yếu l E coli (Top10F’, DH5α, DH10b… [22, 23, 53, 54, 55], bởi những ưu điểm của E coli mang l i: Số hóa. .. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ L- lactate oxidase activity (U/ml enzyme) 60 50 40 30 20 10 0 5 8 6 7 9 0 2 3 4 1 27 25 -26 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -2 -2 -1 -2 HHS H LSH LSH LS H LSH LSH SH LS SH LS H LSH LS H LS VL V V V V V V V V V V VL VL Hình 3.2: Hoạt tính L- lactate oxidase của các chủng vi khuẩn lactic phân l p từ các mẫu thực phẩm l n men truyền thống 3.3 Phân loại hai chủng. .. khuẩn lactic VLSH- 12 và VLSH- 18 3.3.1 Đặc điểm sinh học và sinh hóa của hai chủng vi khuẩn VLSH- 12 và VLSH- 18 Hai chủng vi khuẩn lactic có hình dạng khuẩn l c tương đối đồng nhất khi nuôi cấy trên môi trường MRS thạch, hình tròn l i, có mầu trắng sữa Khi quan sát hình dạng tế bào của chúng dưới kính hiển vi quang học cho thấy chủng VLSH- 12 có dạng hình oval còn chủng VLSH- 18 có dạng hình que, cả 2 chủng. .. tự gen Lox trên Genbank của các chủng vi khuẩn L lactis để khuếch đại đoạn gen Lox có chiều dài khoảng 1,1 kb DNA tổng số của chủng vi khuẩn L lactis VLSH- 12 được dùng l m khuôn để nhân đoạn gen Lox và hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị như sau: Đệm Taq polymerase (10x): dNTPs (10 mM): Dream Taq polymerase (5000 U/ml): Mồi LOXF (10 pmol): Mồi LOXR (10 pmol): DNA khuôn (20 ng): Nước: Σ= 5 l 2 l 0,5 l. .. cả E coli, B subtilis và nhiều loại vi sinh vật khác có thể liên kết với RNA polymerase tăng cường phiên mã của gen [58] Để tạo chủng tái tổ hợp mang gen Lox trong E coli người ta thường l a chọn các hệ vector biểu hiện như pET, pRSET với T7 promoter và T7 terminator từ bacteriophage ở trước và sau điểm đa tách dòng của các vector hoặc các vector con thoi có thể biểu hiện trong cả E coli và Bacillus ... VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGHUYÊN SINH VẬT -oOo LẠI THỊ HỒNG NHUNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO L-LACTATE OXIDASE CỦA CHỦNG LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP LACTIS. .. nghiên cứu đề tài: Tách dòng biểu gen mã hóa cho L-lactate oxidase của chủng Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 Escherichia coli với nội dung nghiên cứu sau: Số hóa Trung tâm Học liệu... chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp L-lactate oxidase - Tách dòng gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Tái tổ hợp gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Biểu gen