Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1 2 của ký sinh trùng Trypanosoma evansi trong E.coli

Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1 2 của ký sinh trùng Trypanosoma evansi trong E.coli Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1 2 của ký sinh trùng Trypanosoma evansi trong E.coli luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THU HIỀN TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN RoTAT1.2 CỦA KÝ SINH TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI TRONG E.COLI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRƯƠNG QUỐC PHONG TS PHẠM THỊ TÂM Hà Nội - 2013 Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu chúng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn mà sử dụng chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền i Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tài, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn tận tình thầy giáo, giáo, tập thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trường Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Công nghệ Sinh học xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trương Quốc Phong, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm,Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp tơi hồn thành khóa học nâng cao chất lượng luận văn - Các thầy cô, đồng nghiệp khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiê cứu Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến người thân, gia đình động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền ii Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TIÊN MAO TRÙNG, BỆNH TIÊN MAO TRÙNG 1.2 TIÊN MAO TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI 1.2.1 Vị trí Tiên mao trùng hệ thống phân loại động vật nguyên sinh6 1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo, ni cấy, sinh học phân tử Trypanosoma evansi 1.2.2.1 Đặc điểm hình thái Trypanosoma evansi 1.2.2.2 Cấu tạo Trypanosoma evansi 1.2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy .11 1.2.2.4 Sinh học phân tử Trypanosoma evansi .11 1.2.3 Cấu trúc kháng nguyên Tiên mao trùng Trypanosoma evansi 11 1.3 NGHIÊN CỨU BỆNH DO TIÊN MAO TRÙNG 14 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh Tiên mao trùng 14 1.3.2 Phân bố địa lý bệnh Tiên mao trùng 14 1.3.3 Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 15 1.3.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 15 1.3.3.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 15 1.3.3.3 Phương pháp phát DNA tiên mao trùng phản ứng PCR (Polymerase Châm Reaction) 21 1.5 HỆ BIỂU HIỆN ESCHERICHIA COLI 22 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 26 iii Luận văn thạc sỹ khoa học 2.1.1 Chủng vi sinh vật 26 2.1.2 Hóa chất, enzyme, kháng thể 26 2.1.3 Thiết bị .27 2.1.4 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu 27 2.1.5 Các dung dịch môi trường sử dụng .27 2.1.5.1 Dung dịch 27 2.1.5.2 Môi trường 28 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Phương pháp vi sinh vật 29 2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 29 2.3.1.2 Phương phương giữ giống vi sinh vật 29 2.3.1.3 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH10b E.coli BL21(DE3) .29 2.3.1.4 Biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang gen tái tổ hợp mơi trường có chất cảm ứng IPTG 30 2.3.2 Phương pháp hóa sinh 31 2.3.2.1 Phương pháp điện di gel agarose 31 2.3.2.2 Phương pháp Tricine-SDS-PAGE .32 2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử 32 2.3.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số .32 2.3.3.2.Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .33 2.3.3.3 Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 35 2.3.3.4 Biến nạp vào tế bào E.coli 36 2.3.3.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 37 2.3.3.4 Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn 38 2.3.3.5 Phương pháp Western blot 39 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 THIẾT KẾ CẶP MỒI KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA KÝ SINH TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI 41 3.2 TÁCH CHIÊT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU HUYẾT THANH 41 iv Luận văn thạc sỹ khoa học 3.3 KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA KÝ SINH TRÙNG T EVANSI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 42 3.4 TÁCH DÒNG GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T EVANSI 43 3.4.1 Gắn đoạn gen mã hóa kháng ngun RoTAT1.2 vào vector tách dịng pJET1.2/blunt .43 3.4.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH10b 44 3.4.3 Tách chiết DNA plasmid 45 3.4.4 Kiểm tra mang gen vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT1.2 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 46 3.4.5 Kiểm tra mang gen vector tái tổ hợp phản ứng cắt với enzym EcoRI SalI 47 3.4.6 Giải trình tự đoạn gen RoTAT1.2 tách dịng .48 3.5 TẠO DÒNG E.COLI BL21(DE3)/pET22b-ROTAT1.2 49 3.5.1 Nối ghép gen RoTAT1.2 vào vector biểu pET22b(+) .49 3.5.2 Tác chiết DNA plasmid 50 3.5.3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 từ dòng tế bào E.coli BL21(DE3) 51 3.6 BIỂU HIỆN PROTEIN CỦA GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T EVANSI TRONG E.COLI BL21(DE3) 53 3.6.1 Kết biểu protein gen RoTAT1.2 E.coli BL21(DE3) 53 3.6.2 Kết Western blot 54 3.7 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CẢM ỨNG 55 3.7.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG .55 3.7.2 Khảo sát thời gian cảm ứng 56 3.7.3 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng .57 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 v Luận văn thạc sỹ khoa học CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU BLAST Basis local alignment search tool Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis dNTP Deoxynucleotid triphotphat ddNTP Dideoxynucletid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside MCS Multi clonding site PBS Phosphat Buffered Saline RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TAE Tris – axit acetic - EDTA VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein TMT Tiên mao trùng T evansi Trypanosoma evansi vi Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái T evansi kính hiển vi điện tử .8 Hình 1.2: Cấu tạo Trypanosoma evansi .10 Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vectơ pJET1.2/blunt 22 Hình 1.4: Bản đồ cấu trúc nhận biết vị trí vector pET-22b(+) .25 Hình 3.1: Kết tách chiết DNA tổng số .42 Hình 3.2: Kết sản phẩm PCR gel agarose 1,2% 43 Hình 3.3: Kết biến nạp plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 vào tế bào DH10b 45 Hình 3.4: kết tách chiết DNA plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 45 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 46 Hình 3.6: Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme EcoRI SalI 47 Hình 3.7: Kết tinh sản phẩm cắt enzyme EcoRI SalI 49 Hình 3.8: Kết biến nạp plasmid pET22b-RoTAT1.2 vào tế bào E.coli BL21(DE3) .50 Hình 3.9: Kết tách chiết DNA plasmid pET22-RoTAT1.2 .51 Hình 3.10: Kết PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 .51 Hình 3.11: Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 52 Hình 3.12: Kết điện di Tricine-SDS PAGE dịng plasmid tái tổ hợp 54 Hình 3.13: Kết Western blot .55 Hình 3.14: Kết khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG nồng độ khác 56 Hình 3.15: Kết khảo sát thời gian cảm ứng 57 Hình 3.15: Kết khảo sát nhiệt độ cảm ứng 58 vii Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Trình tự thơng số cặp mồi thiết kế 41 Bảng 3.2: Bảng tổng hợp trình tự NCBI .48 viii Luận văn thạc sỹ khoa học MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh Trypanosoma (Trypanosomiasis) bệnh truyền lây người gia súc ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae… Bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi thấy loài động vật, trâu, bị động vật mẫn cảm với động vật đơn bào Trâu, bị mắc bệnh thể cấp tính thường sốt cao 41 – 41,70C với triệu chứng thần kinh ngã quỵ, kêu rống, vòng tròn, thuỷ thũng hầu, ức, nách, chân, háng Trường hợp bệnh nặng, vật đột ngột sốt cao, bụng chướng to lăn chết Bệnh Tiên mao trùng ký sinh trùng T evansi gây phân bố rộng, từ phía Tây sang phía Đơng bán cầu Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đơng bán cầu trải dài từ châu Phi Philippine Theo Haridy F M cs (2011), bệnh phổ biến trâu, bò, ngựa nước nhiệt đới châu Phi, châu Á Nam Mỹ [19] Trâu, bị mắc bệnh thể cấp tính chết sau – 15 ngày Ở thể mãn tính, triệu chứng lâm sàng nhẹ bệnh kéo dài – tháng, vật ngày gầy, da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, đơi có chấm máu, chảy nước mắt mắt có nhiều dử đặc keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm Sức khoẻ trâu, bò suy yếu dần, ăn, nhai lại, phân táo có lẫn máu tháo phân lỏng, mùi thối khắm, có vật ỉa màng ruột, nát đoạn Theo số liệu Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân cs (2004), Phan Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất nhiều vùng nước, với tỷ lệ mắc cao: trâu 13 – 30%, bò – 14%, tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20% Nguyễn Thị Thu Hiền 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học 3.4.6 Giải trình tự đoạn gen RoTAT1.2 tách dòng Plasmid pJET1.2-RoTAT1.2-1 sau kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đăc hiệu phản ứng cắt enzyme giới hạn gửi giải trình tự Hàn Quốc Trình tự chúng tơi giải sau: Trình tự đoạn gen so sánh với trình tự được công bố ngân hàng gen Quốc tế phần mềm Blast Kết thể bảng sau: Bảng 3.2: Bảng tổng hợp trình tự NCBI Từ kết so sánh trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi cho với trình tự cơng bố Ngân hàng gen Quốc tế phần mềm blast cho thấy, đoạn gen khuếch đại cặp mồi thiết kế có độ tương đồng cao 100%, so với trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi công bố Ngân hàng gen Quốc tế Điều chứng tỏ việc tách dòng gen RoTAT1.2 mã hóa kháng ngun bề mặt T evansi thành cơng Nguyễn Thị Thu Hiền 48 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học 3.5 TẠO DÒNG E.COLI BL21(DE3)/pET22b-ROTAT1.2 3.5.1 Nối ghép gen RoTAT1.2 vào vector biểu pET22b(+) Muốn gen hoạt động biểu sản phẩm protein, gen phải nằm kết cấu hoàn chỉnh gồm: Promotor, vùng gắn ribosome, codon mở đầu, codon kết thúc vùng kết thúc phiên mã Vì vậy, để gen RoTAT1.2 biểu thành cơng, trình tự DNA mang mã di truyền gen RoTAT1.2 phải lắp ghép chiều vào đoạn khởi đầu đoạn kết thúc vector pET22b(+) Vector pET 22b(+) hãng Novagen có chiều dài 5493bp, sử dụng chủ yếu cho biểu gen tái tổ hợp tế bào E.coli Vector pET22b(+) mang gen lac I mã hóa cho protein lac repressor, can thiệp vào q trình điều hịa hoạt động promoter vector cảm ứng chất tổng hợp IPTG Chúng tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu RoTAT1.2F RoTAT1.2R từ plasmid pJET1.2-RoTAT1.2, cắt thơi gel thu lấy đoạn gen RoTAT1.2 có kích thước 205bp Sau đó, vector pET22b(+) đoạn gen RoTAT1.2 thu được tinh kit pureLinkTM PCR purification hãng Invitrogen cắt xử lý enzyme giới hạn EcoRI SalI Hình 3.7: Kết tinh sản phẩm cắt enzyme EcoRI SalI Giếng 1: pET22b(+) sau tinh Giếng 2: Marker 100bp Giếng 3: Đoạn gen RoTAT1.2 sau tinh Nguyễn Thị Thu Hiền 49 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Qua ảnh điện di ta thấy vector pET22b(+) đoạn gen RoTAT1.2 sau tinh có băng rõ nét, kích thước tính toán lý thuyết Trước thực phản ứng nối ghép gen vào vector, đoạn gen RoTAT.2 vector pET22b(+) tiến hành đo nồng độ máy đo nồng độ (nanodrop) từ tính tỷ lệ lai vector đoạn gen Tỷ lệ vector pET22b(+) : gen RoTAT1.2 sử dụng 5:1 Phản ứng nối thực nhờ enzyme T4-DNA ligase, ủ 22°C qua đêm Sản phẩm lai sau biến nạp vào tế bào khả biến E.coli BL21(DE3) phương pháp sốc nhiệt cấy trải đĩa LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin 100µg/ml Đĩa biến nạp nuôi cấy 37°C, qua đêm Kết biến nạp thể hình sau: Hình 3.8: Kết biến nạp plasmid pET22b-RoTAT1.2 vào tế bào E.coli BL21(DE3) 3.5.2 Tác chiết DNA plasmid Trên đĩa biến nạp chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng để tiến hành tách chiết DNA plasmid Kết tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 1,2% Nguyễn Thị Thu Hiền 50 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.9: Kết tách chiết DNA plasmid pET22-RoTAT1.2 Giếng 1-9: Sản phẩm tách plasmid từ khuẩn lạc 1-9 3.5.3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 từ dòng tế bào E.coli BL21(DE3) Sau tiến hành tách plasmid từ khuẩn lạc mọc đĩa biến nạp, chọn plasmid tách từ khuẩn lạc số đến khuẩn lạc số để tiến hành phản ứng PCR plasmid với cặp mồi RoTAT1.2R RoTAT1.2F Đồng thời sử dụng đối chứng âm plasmid pET22b(+) Kết trình bày hình sau: Hình 3.10: Kết PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 Giếng 1: Marker 100bp Giếng 2-7: Sản phẩm PCR plasmid pET22b-RoTAT1.2 từ dòng 1-6 Giếng 8: Sản phẩm PCR plasmid pET22b Nguyễn Thị Thu Hiền 51 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Qua ảnh điện di ta thấy, từ giếng thứ đến giếng thứ có xuất băng sáng có kích thước 205bp, kích thước trùng với kích thước lý thuyết gen RoTAT1.2 Giếng sản phẩm PCR mẫu đối chứng âm pET22b không thấy xuất sản phẩm khuếch đại, điều chứng tỏ cặp mồi RoTAT.2F, RoTAT1.2R thiết kế đặc hiệu Để khẳng định chắn plasmid pET22bRoTAT1.2 plasmid tái tổ hợp, chọn plasmid pET22b-RoTAT1.2 dòng số để tiến hành cắt kiểm tra cặp enzyme giới hạn EcoRI, SalI pstI, NcoI Hình 3.11: Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 Giếng 1, 2:Sản phẩm cắt pET22b-RoTAT.2 dòng số 1, 2bằng enzyme EcoRI SalI Giếng 3: Marker 100bp Giếng 4, 5: Sản phẩm cắt pET22b-RoTAT.2 dòng số 1, enzyme NcoI pstI Giếng 6: Sản phẩm cắt pET22b enzyme NcoI pstI Theo lý thuyết sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp phải văng đoạn có kích thước tương ứng với kích thước gen vector giếng plasmid pET22b-RoTAT1.2 dòng số 1, cắt enzyme EcoRI SalI kích thước gen RoTAT1.2 (205bp) nhỏ so sới kích thước vector pET22b(+) Nguyễn Thị Thu Hiền 52 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học (5493bp) nên sản phẩm cắt sau điện di gel agarose 1,2% có băng tương ứng với kích thước vector, băng tương ứng với kích thước gen mờ chúng tơi tiếp tục cắt plasmid pET22b-RoTAT1.2 dòng số 1, enzyme NcoI, pstI cắt plasmid pET22b(+) enzyme để làm đối chứng Trên đồ vector pET22b(+) vị trí cắt enzyme giới hạn NcoI pstI 220 4353 nên plasmid pET22b-RoTAT1.2 có mang gen RoTAT1.2 cắt enzyme văng băng có kích thước 1500bp băng có kích thước tương ứng với kích thước vector pET22b(+) Ở giếng số có băng sáng, băng 1500bp băng có kích thước khoảng 5,5kp Ở giếng đối chứng số có băng băng có kích thước 1500bp Chúng tơi khẳng định chèn thành cơng gen RoTAT1.2 vào vector pET22b(+) Chúng chọn plasmid để tiến hành biểu protein 3.6 BIỂU HIỆN PROTEIN CỦA GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T EVANSI TRONG E.COLI BL21(DE3) 3.6.1 Kết biểu protein gen RoTAT1.2 E.coli BL21(DE3) Biểu protein gen RoTAT.2 Ecoli BL21(DE3) bước đầu phân tích phương pháp Tricine-SDS-PAGE Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 14kDa Các dòng E.coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET22-RoTAT1.2 nuôi cấy lắc môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100µg/ml, 37°C, qua đêm Từ dịch nuôi cấy qua đêm tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có bổ sung Amp100µg/ml, ni lắc Sau bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối 1mM Tiến hành nuôi cấy với tốc độ 200 vòng/phút giờ, thu sinh khối, xử lý điện di gel polyacrylamide có SDS Tricine Kết điện di thể hình đây: Nguyễn Thị Thu Hiền 53 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.12: Kết điện di Tricine-SDS PAGE dòng plasmid tái tổ hợp Giếng 1, 3: Mẫu không bổ sung chất cảm ứng IPTG Giếng 2, 4: Mẫu có bổ sung chất cảm ứng IPTG Kết phân tích Tricine-SDS PAGE hình 3.12 cho thấy có xuất băng protein đậm có kích thước khoảng 14kDa giếng Bên cạnh giếng mẫu không bổ sung chất cảm ứng IPTG khơng thấy có xuất protein Như vậy, bước đầu biểu thành công vector tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 tế bào E.coli BL21(DE3) Để tiếp tục khảo sát điều kiện cảm ứng tối ưu cho việc tổng hợp protein chúng tơi chọn dịng số (giếng số 2) 3.6.2 Kết Western blot Sự biểu protein gen RoTAT1.2 khẳng định phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT.2 Mẫu sau phân tích gel acrylamide chuyển lên màng lai nitrocellulose, phản ứng với kháng thể đặc hiệu (kháng thể kháng RoTAT1.2) Sau gắn với kháng thể bậc (kháng thể kháng kháng thể đặc hiệu) có gắn enzyme peroxidase, màu TMB Nguyễn Thị Thu Hiền 54 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.13: Kết Western blot Giếng 1: E.coli/pET22b-RoTAT1.2 Giếng 2: Kháng nguyên RoTAT1.2 đối chứng Kết hình 3.13 cho thấy, giếng số tương ứng với plasmid mang vector tái tổ hợp có băng sáng kích thước 14kDa tương ứng với kháng nguyên RoTAT1.2 đối chứng giếng số Như vậy, biểu thành công protein gen RoTAT1.2 3.7 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CẢM ỨNG 3.7.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG Chất cảm ứng sử dụng nồng độ thích hợp có khả cảm ứng biểu protein mục tiêu Trong trình khảo sát nhằm tối ưu điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG dựa tiêu chí, sử dụng nồng độ chất cảm ứng mà lượng protein biểu lớn Để xác định nồng độ IPTG tối ưu cho việc biểu gen RoTAT.2, tiến hành thử nghiệm với nồng độ IPTG tương ứng 0mM; 0,1mM; 0,3mM; 0,5mM; 0,7mM; 1mM; 1,3mM; 1;5mM Cùng với thay đổi Nguyễn Thị Thu Hiền 55 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học nồng độ IPTG, điều kiện khác cần cho cảm ứng protein khơng thay đổi: ni lắc với tốc độ 200 vịng/phút, nhiệt độ nuôi lắc 37°C, thời gian cảm ứng Hình 3.14: Kết khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG nồng độ khác Giếng 1: Mẫu không bổ sung IPTG Giếng 2: 0,1mM Giếng 3: 0,3mM Giếng 4: 0,5mM Giếng 5: 0,7mM Giếng 6: 1mM Giếng 7: 1,3mM Giếng 8: 1,5mM Kết điện di hình 3.14 cho thấy giếng số tương ứng với nồng độ IPTG 0,1mM, băng protein biểu xuất đậm Như vậy, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,1mM thích hợp số nồng độ khảo sát cho việc biểu protein gen RoTAT1.2 3.7.2 Khảo sát thời gian cảm ứng Thời gian cảm ứng yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thu nhận protein Với nồng độ IPTG tối ưu 0,1mM khảo sát trên, thời gian cảm ứng tiến hành khảo sát với khoảng thời gian sau: giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, Mẫu ni lắc với tốc độ 200 vịng/phút, nhiệt độ 37°C, dịch ni cấy sau lấy thời điểm giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, Nguyễn Thị Thu Hiền 56 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Kết điện di hình 3.15 cho thấy giếng số tương ứng với thời gian cảm ứng băng protein xuất đạm Hình 3.15: Kết khảo sát thời gian cảm ứng Giếng 1: Giếng 2: Giếng 3, 4: Giếng 5: Giếng 6: Giếng 7: 3.7.3 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả biểu protein gen RoTAT1.2 Với điều kiện khảo sát trên: nồng độ chất cảm ứng 0,1mM, thời gian cảm ứng giờ, tốc độ lắc 200 vịng/phút, chúng tơi tiến hành nuôi lắc nhiệt độ khác 20°C, 30°C 37°C Kết điện di thể hình 3.16: Nguyễn Thị Thu Hiền 57 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.15: Kết khảo sát nhiệt độ cảm ứng Giếng 1: 20°C Giếng 2: 30°C Giếng 3: 37°C Ở giếng số tương ứng với nhiệt độ 30°C, băng protein đậm nên khả tổng hợp protein gen RoTAT1.2 nhiệt độ tốt nhất, chúng tơi chọn nhiệt độ nhiệt độ tối ưu Nguyễn Thị Thu Hiền 58 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu RoTAT1.2F, RoTAT1.2R để khuếch đại đoạn gen RoTAT1.2 mã hóa kháng ngun T evansi có kích thước 205bp Tách dịng thành cơng giải trình tự gen RoTAT1.2 mã hóa kháng nguyên T Evansi So sánh với trình tự gen Ngân hàng gen Quốc tế có độ tương đồng 100% Tạo cấu trúc biểu biểu thành công kháng nguyên RoTAT1.2 tái tổ hợp E.coli BL2(DE3) Khảo sát số điều kiện cảm ứng IPTG: nồng độ 0,1mM, thời gian giờ, nhiệt độ 30°C protein biểu lớn KIẾN NGHỊ Tiếp tục tinh kháng nguyên RoTAT1.2 tái tổ hợp để ứng dụng chế tạo kít chẩn đốn có khả phát đặc hiệu bệnh Tiên mao trùng gia súc Việt Nam tính tương đồng kháng nguyên Nguyễn Thị Thu Hiền 59 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 112-134 Khuất Hữu Thanh (2006), “Kỹ thuật gen-nguyên lý ứng dụng”, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lương Văn Huấn, Lê Hữu Khương (1997), Giáo trình Ký sinh bệnh ký sinh gia súc, gia cầm, Nhà xuất Đại học Quốc gia – TP.HCM Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học T evansi (Steel, 1885), bệnh học chúng gây ra, quy trình bảo quản sử dụng giống T evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sỹ nơng nghiệp, Hà Nội Hồng Quy (2008), Một số đặcđiểm dịch tễ bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi trâu, bò Lạng Sơn biện pháp phòng trị, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Phạm Sỹ Lăng (1982), Một số đặcđiểm dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trâu, bò Trypanosoma evansi tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Thú y Trịnh Văn Thịnh (1982) Cơng trình nghiên cứu ký sinh trùng Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Phạm Sỹ Lăng, Hoàng Văn Năm, Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Văn Diên (2008) “Một số bệnh quan trọng gây hại cho trâu bò” Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Lê, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Văn Quang (2008), Giáo trình ký sinh trùng thú y (Dành cho bậc cao học), Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hiền 60 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học Tài liệu tham khảo tiếng Anh 10 Hoare C.A, Sulsby Lymphoceutosis E.J (1972) Bovins Trypanosomiasis and parellet studies Biol, Haemat, 36, pp 504 - 517 11 Lorh, K.F (1986) Trypanosoma evansi infection a frequent cause of abortion in buffaloes (Thailand), International Conference Kuala Lampur 12 Chen Qijun (1992) Study on cross immunity of antibodies against different strains of Trypanosoma evansi, Seminar Paris, (10), pp 152 13 Vickerman, K (1974a) The ultastructure of pathogenic flagellates.In "Trypanosomiasis and Leishmaniasis with special reference to chagus disease" Ciba found Symp N.20 (new ser), (K.Ellott, M.O Connor, and G.E.W Wolstenholme, eds), Assoc Sci Publ, Amsterdam 14 Lapage G (1968) Parasitology of medical and veterinary, London 15 Killick-kendrick, R (1964) The apparent loss of the kinetoplast of Trypanosoma evansi after treatment of experimentally infected horse with Berenil, Annales Trop Med Parasite, (58),pp 481 16 Hernmers, R., Bajyanasoma, E., Wabacha, J and Gajendran, N Molecular biology of Trypanosoma evansi Seminar Paris, 1992, 10:110 17 Qu.L.H., Yu, X.Q Z.L.Lun Sequencing and comparative analysis LsrARN from Trypanosoma evansi, T brucei and T congolense Seminar Paris, 1992, 10:120 18 Barry J D., Tumer C M R (1991), The diamics of antigenic variation and growth of African trypanosomes, Parasitology Today, 7, pp 207 - 21 19 Haridy F M., El-Metwally M T., Khalil H H., Morsy T A (2011), “Trypanosoma evansi in dromedary camel: with a case report of zoonosis in greater Cairo, Egypt”, J Egypt Soc Parasitol 20 Urakawa T, Phelix AO Majiwa , Bruno Goddeeris, Philip, Magda Radwanska (2001), Variable Surface Glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections Nguyễn Thị Thu Hiền 61 2011-2013 Luận văn thạc sỹ khoa học 21 Bhopale G.M., Nanda R.K (2005) Recombinant DNA expression products for human therapeutic use Curr Sci., 89(4), pp 614-622 22 New England BioLabs (2006), “IMPACTTM-TWIN: Purification, ligation and cyclization of reconbiant proteins using self-cleavable affinity tags, Instruction Manual; Version 1.4 New England BioLabs Inc 23 Liu Y., Li Q., Zhu H., Yang J (2009) High soluble expression of D-amino acid oxidase in Escherichia coli regulated by a native promoter Appl Biochem Biotechnol., 158(2); pp.313-322 24 Lin L., Chien H.R., Wang W., Hwang T., Fu H., Hsu W (2000) Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase gene in Escherichia coli and characterization of its inactive mutant Enzyme Microbiol Technol., 27, pp 482-491 25 Marc Desquesnes, Philippe Holzmuller, De Hua Lai, Alan Dargantes, Zhao Rong Lun and Sathaporn Jittaplapong (2013) Trypanosoma evansi and Surra: A Review and Perspectives on Origin, History, Distribution, Taxonomy, Morphology, Hosts, and Pathogenic Effects BioMed Research International 26 Brosch R, Pym AS, Gordon SV, Cole ST (2001), The evolution of mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics Frends Microbiol; 9: 452-458 27 Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications, BioTechniques, 14, pp 748–751 28 Raper J., Portela Molina M P., (2002), Natural immunity to human African trypanosomiasis: Trypanosomelytic factor and the blood incubation infectivity test Trans R Soc Trop Med Hyg, Apr, 96 Nguyễn Thị Thu Hiền 62 2011-2013 ... MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA KÝ SINH TRÙNG T EVANSI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 42 3.4 TÁCH DÒNG GEN ROTAT1. 2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T EVANSI 43 3.4.1 Gắn đoạn gen mã hóa kháng. .. pET22b -RoTAT1. 2 từ dòng tế bào E.coli BL21(DE3) 51 3.6 BIỂU HIỆN PROTEIN CỦA GEN ROTAT1. 2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T EVANSI TRONG E.COLI BL21(DE3) 53 3.6.1 Kết biểu protein gen. .. đoạn gen RoTAT1. 2 mã hóa kháng nguyên T evansi - Tạo cấu trúc biểu biểu kháng nguyên RoTAT1. 2 tái tổ hợp tế bào E.coli Điểm đề tài - Đề tài xác định gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1 .2 tiên mao trùng