Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô

phâm ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VÌ THỊ XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VÌ THỊ XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thái Nguyên, 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Các kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí khoa học - công nghệ, phần lại chưa công bố công trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2017 TÁC GIẢ Vì Thị Xuân Thủy ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh trực tiếp hướng dẫn thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để có tự tin lòng đam mê khoa học giúp hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà, PGS.TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ và tạo điều điều kiện tốt để tiến hành các thí nghiê ̣m Phòng Công nghệ tế bào thực vật Phòng công nghệ ADN ứng dụng Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Được học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, việc nhận đóng góp quý báu, có hội trang bị cho phương pháp nghiên cứu hiểu biết sâu sắc nhiều vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Sinh học, thầy cô giáo cán Bô ̣ phâ ̣n đào ta ̣o Sau đại học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư pha ̣m - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khoá học Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Tây Bắc, đồng nghiệp thầy cô giáo, cán Khoa Sinh - Hoá đơn vị chức tạo cho điều kiện thuận lợi mặt quản lý suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng tri ân người thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn đồng hành trình học tập Thái Nguyên, tháng năm 2017 TÁC GIẢ Vì Thị Xuân Thủy iii DANH MỤC NHỮ NG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid AS Acetylseringone bp base pairs cs Cặp bazơ nitơ Cộng Ct Threshold of Cycle DAB 3,3'-Diaminobenzidine Chu kỳ ngưỡng tetrahydrochloride Trình tự đánh dấu biểu EST Expressed Sequence Tag ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương giới GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh GM Germination Medium Môi trường nẩy mầm Gus β-Glucuronidase IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rZmDEF1 Recombinant ZmDEF1 protein Protein tái tổ hợp ZmDEF1 RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp - Chain Reaction phiên mã ngược T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine Các hệ chuyển gen T0, T1 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi T0 ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 nảy T1 X-gal Plasmid gây khối u mầm thành T1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactose-pyranoside ZmDEF1 Gen defensin1 ngô iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY NGÔ VÀ MỌT NGÔ 1.1.1 Giá trị ngô tác hại mọt ngô .5 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh ngô liên quan đến tính kháng mọt ngô 11 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN THỰC VẬT 16 1.2.1 Cấu trúc, chức defensin thực vật 16 1.2.2 Cơ chế ức chế α-amylase defensin thực vâ ̣t 21 1.2.3 Nghiên cứu defensin ngô .25 1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở NGÔ .27 1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A tumefaciens .27 1.3.2 Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ngô 30 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .39 2.1.1 Vật liệu thực vật 39 2.1.2 Các chủng vi khuẩ n và các loại vector 40 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 40 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu .41 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.3.1 Phương pháp đánh giá khả kháng mọt 42 2.3.2 Phương pháp tách dòng giải tự trình tự gen ZmDEF1 .44 2.3.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang gen chuyển ZmDEF1 47 2.3.4 Phương pháp tạo chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 50 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .61 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU61 3.1.1 Khối lượng hao hụt giống ngô nghiên cứu 61 3.1.2 Tỷ lệ tạo bột giống ngô nghiên cứu 62 3.1.3 Tỷ lệ nhiễm mọt giống ngô nghiên cứu .63 3.1.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu 63 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 66 3.2.1 Đặc điểm gen ZmDEF1 (cDNA) phân lâ ̣p từ giống ngô nghiên cứu .66 3.2.2 Đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ DNA .71 3.2.3 Sự đa dạng về trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ngô .73 3.3 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 75 3.3.1 Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 .75 3.3.2 Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc nhờ A tumefaciens 78 3.3.3 Phân tích thuốc chuyển gen 80 3.4 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN .89 3.4.1 Kết chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99 89 3.4.2 Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A tumefaciens 93 3.4.3 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 hệ ngô chuyển gen T0 97 3.4.4 Phân tích biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 101 3.4.5 Kiểm tra chức sinh học protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 102 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .105 Kết luận .105 Đề nghị 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO .108 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Mối tương quan thành phần hoá học với tính kháng mọt hạt ngô 14 Bảng 1.2 Các protein mã hóa gen từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chuyển vào ngô 32 Bảng 2.1 Các giố ng ngô sử dụng nghiên cứu 39 Bảng 2.2 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu .40 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với Master Mix .45 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen ZmDEF1 vào vector tách dòng pBT .46 Bảng 2.5 Thành phần môi trường LB lỏng LB đặc 46 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid enzyme giới hạn BamHI 47 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid pDON201-SLHEP-HA SalI HindIII .49 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng trao đổi LR 49 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid HindIII 50 Bảng 2.10 Thành phần môi trường tái sinh thuốc lá………………………… 51 Bảng 2.11 Thành phần môi trường tái sinh ngô chuyển gen .53 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng cắt DNA tổng số SalI 57 Bảng 2.13 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR .59 Bảng 2.14 Chu trình nhiệt độ phản ứng Real-time RT-PCR .59 Bảng 3.1 Khối lượng hao hụt hạt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm mọt 61 Bảng 3.2 Tỷ lệ bột ngô tạo giống nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm mọt 62 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm mọt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm 63 Bảng 3.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm 64 Bảng 3.5 Chỉ số mẫn cảm mọt tương đối (Sn) giống ngô nghiên cứu 65 Bảng 3.6 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng mã hóa gen ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu 69 Bảng 3.7 Sự sai khác trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA giống ngô địa phương SLvà giống ngô lai LVN99 73 Bảng 3.8 Một số trình tự gen ZmDEF1 để phân tích đa dạng di truyền 74 Bảng 3.9 Kết biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc C9-1… 78 Bảng 3.10 Kết phân tích chu kỳ ngưỡng tỷ lệ biểu gen ZmDEF1 thuốc chuyển gen hệ T1 84 Bảng 3.11 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein ZmDEF1 tái tổ hợp từ hạt thuốc chuyển gen T1 .87 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ A tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩ n đế n hiê ̣u quả chuyể n gen gus .90 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của tuổi phôi đế n hiê ̣u suất biểu gen gus tạo mô sẹo giống ngô LVN99 .91 Bảng 3.14 Nồng độ kanamycin (mg/l) cho ngưỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang gen gus .92 Bảng 3.15 Kết tái sinh chuyển gen ZmDEF1 giống ngô LC1 LVN99 .96 Bảng 3.16 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt ngô chuyển gen T1 103 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Quý Dương (2010), “Nghiên cứu thành phần mọt hại đậu bảo quản, đặc điểm hình thái, sinh vật học, sinh thái học loài mọt đậu cô ve (mọt đậu nành) (Acanthoscelides obtectus Say) biện pháp phòng trừ chúng Việt Nam”, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), “Nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn công nghệ gen”, Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ nhất, tr 405-411 Trương Thu Hằng (2013), “Chọn tạo dòng ngô chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 29 (3), tr 17-29 Nguyễn Kim Hoa, Nguyễn Văn Liêm, Trần Thị Hường, Nguyễn Thị Hiền (2008), "Đặc điểm sinh học chủ yếu mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch (Col.: Curculionidae) mọt bột sừng Gnathocerus cornutus Fabr (Col.: Tenebrionidae)", Hội nghị Côn trùng học lần thứ 6, tr 560-569 Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo trình ngô, Nxb Nông nghiệp Trần Thị Lương, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Đức Thành (2014), “Chuyển gen Shrunken (Sh2) mã hóa enzyme ADP-glucose pyr ophosphorylase vào số dòng ngô phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Sinh học, 36(1), tr 99-109 Phạm Thị Lý Thu (2007), “ Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô”, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Đinh Văn Trình, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Thu Về, Nguyễn Văn Toàn, Phạm Văn Đồng (2009), “Nghiên cứu chuyển gen nguyên ngô”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(2), tr 221-227 109 TIẾNG ANH Aaron J C (2005), “Factors that affect the nutritional value of maize for broilers”, Animal Feed Science and Technology,119, pp 293–305 10 Abebe F T., Mugo S., Beyene Y., Vidal S (2009), “Resistance of maize varieties to the maize weevil, Sitophilus zeamais (Motsch.) (Coleoptera: Curculionidae) ”, African Journal of Biotechnology, (21), pp 5937-5943 11 Adedire C O., Akinkurolere R O., Ajayi O O (2011), “Susceptibility of some maize cultivars in Nigeria to infestation and damage by aize weevil, Sitophilus zeamais (Motsch.) (Coleoptera: Curculionidae)”, Nigerian Journal of Entomology, 28, pp 55-63 12 Aerts A M., Bammens L., Govaert G., Carmona-Gutierrez D., Madeo F., Cammue B P., Thevissen K (2011), “The antifungal plant defensin HsAFP1 from Heuchera sanguineainducesa poptosis in Candida albicans”, Front Microbiol, 2, pp 47 13 Ali Q., Ali A., Tariq M., Abbas M A., Sarwar B., Ahmad M., Awaan M F., Ahmad S., Nazar Z A., Akram F., Shahzad A (2014), “Gene action for various grain and fodder quality traits in Zea mays”, Journal of Food and Nutrition Research, 2(10), pp 704-717 14 Aluru M., Xu Y, Guo R., Wang Z., Li S., White W (2008), “Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content”, J Exp Bot, 59, pp 3551–3562 15 Anami S E., Mgutu A J., Taracha C., Coussens G., Karimi M., Hilson P., Lijsebettens M V., Machuka J (2010), “Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 102, pp 285-295 16 Aytug T., Thomas W O (2013), “Improving starch yield in cereals by overexpression of ADPglucose pyrophosphorylase: Expectations and unanticipated outcomes”, Plant Science 211, pp 52–60 17 Baosheng W., Jingjuan Y., Dengyun Z., Qian Z (2011), “Maize defensin ZmDEF1 is involved in plant response to fungal phytopathogens”, African 110 Journal of Biotechnology, 10 (72), pp 16128-16137 18 Baum J A., Bogaert T., Clinton W., Heck G R., Feldmann P., Ilagan O (2007), “Control of coleopteran insect pests through RNA interference, Nature Biotechnology”, 25(11), pp 1322-1326 19 Bergvinson D J., García-Lara S (2004), “Genetic approaches to reducing losses of stored grain to insects and diseases”, Curr Opin Plant Biol, 7, pp 480–485 20 Bernardi D., Salmeron E., Horikoshi R.J., Bernardi O., Dourado P M., Carvalho R A., Martinelli S., Head G P., Omoto C (2015), “Crossresistance between Cry1 Proteins in fall armyworm (Spodoptera frugiperda) may affect the durability of current pyramided Bt maize hybrids in Brazil”, PLoS One, 16(10), pp 140- 153 21 Bernfeld P (1955), “Amylase α and β”, Methods Enzymol, 1, pp 149–154 22 Binott J.J., Songa J., Ininda J., Njagi E.N., Machuka J (2005),“Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids though somatic embryogenesis”, Afri Crop Sci Conf Prod, 7, pp 1305 - 1310 23 Brewer M J, Odvody G N., Anderson D J., Remmers J C (2014), “A comparison of Bt transgene, hybrid background, water stress, and insect stress effects on corn leaf and ear injury and subsequent yield”, Environ Entomol, 43(3), pp 828-839 24 Bruix M., Gonzalez C., Santoro J., Soriano F., Rocher A., Mendez E (1995), “1H-NMR studies on the structure of a new thionin from barley endosperm”, Biopoly-mers, 36, pp 751–763 25 Carvalho A O., Gomes V M (2011), “Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications”, Curr Pharm Des, 17(38), pp 4270–4293 26 Chen K C., Lin C Y., Kuan C C., Sung H Y., Chen C S (2002), “Anovel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid”, J Agric Food Chem; 50, pp 7258-7263 111 27 Chen J J., Chen G H., Hsu H C., Li S S., Chen C S (2004), “Cloning and functional expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris”, J Agric Food Chem, 52, pp 2256-2261 28 Chen G H., Hsu M P., Tan C H., Sung H Y., Kuo C G., Fan M J (2005), “Cloning and characterization of a plant defensin VaD1 from azuki bean”, Agric Food Chem, 53, pp 982-988 29 Castle L A., Siehl D L., Gorton R , Patten P A., Chen Y H., Bertain S., Lassner M W (2004), “Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene”, Science, 304 (5674), pp 1151-1154 30 Castiglioni P., D Warner R J., Bensen D C., Anstrom J., Harrison M., Stoecker M., Abad G., Kumar S., Salvador R., D’Ordine S., Navarro S., Back M., Fernandes J., Targolli S., Dasgupta C., Bonin M., Luethy J.E (2008), “Bacterial RNA chaperones confer abiotic stress tolerance inplants and improved grain yield in maize under water-limited conditions”, Plant Physiology, 147, pp 446-455 31 Chuong Tran Van, Thuy Nguyen Kim (2003), “Demonstration for corn- corb storage at Farm scale in Vietnam”, Proceeding of the Scientific Meeting of the ACIAR project PHT 1998/137, pp 07-08 32 Demissie G., Tefera T., Abraham T (2008), “Efficacy of Silicosec, filter cake and wood ash against the maize weevil, Sitophilus zeamais Motsch, (Coleoptera: Curculionidae) on three maize genotypes”, Journal of Stored Products Research, 40, pp 227-231 33 Devi V.S., Sharma H.C., Rao P.A (2013), “Influence of oxalic and malic acids in chickpea leaf exudates on the biological activity of CryIAc towards”, Helicoverpa armigera, J Insect Physiol, 59(4), pp 394-399 34 Dias S C., Silva M C M., Teixeira F R., Figueira E L Z., Oliveira-Neto, O B., Lima L A (2010), “Investigation of insecticidal activity of rye α- amylase inhibitor gene expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) toward cotton boll weevil (Anthonomus grandis)”, Pesticide Biochemistry and Physiology, 98(1), pp 39-44 112 35 Edgertom M D (2009), “Increasing crop productivity to meet Global needs for feed, food and fuel”, Plant Physiol, 149, pp 7-13 36 Emma W G., Jose C., Ade´.P.K´., Lamine.M., Simeon O K (2012), “Structural characterization of plant defensin protein superfamily”, Mol Biol Rep 39:4461–4469 37 Farias J R., Horikoshi R J., Santos A C., Omoto C (2014), “Geographical and temporal variability in susceptibility to Cry1F toxin from Bacillus thuringiensis in spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) populations in Brazil”, J Econ Entomol 107(6), pp 2182-2189 38 Frame B R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T., Pegg SE., Li B., Nettleton D., Pei P., Wang K (2002), “Agrobacterium-mediated ransformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Physiol., 129: 13-22 39 Frame B R., McMurray J M., Fonger T N., Main M L., Taylor K W., Torney F J, Paz M M., Wang K (2006), “Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts”, Plant Cell Rep, 25(10), pp 1024-1034 40 Frame B., Main M., Schick R., Wang K (2011), “Genetic transformation using maize immature zygotic embryos”, Plant Embryo Culture: Methods and Protocol, Methods in Moleculer Biology, 710 (22), pp 327-341 41 Frank D L., Kurtz R., Tinsley N A., Gassmann A J., Meinke L J., Moellenbeck D., Gray M E., Bledsoe L W., Krupke C H., Estes R E., Weber P., Hibbard B E (2015), “Effect of seed blends and soil-Insecticide on Western and Northern corn rootworm emergence from Cry3A+eCry3,1Ab Bt Maize”, J Econ Entomol, 108 (3), pp 1260-1270 42 French B W., Hammack L., Tallamy D W (2015), “Mating success, longevity, and fertility of diabrotica virgifera leconte (Chrysomelidae: Coleoptera) in relation to body size and Cry3Bb1-resistant and Cry3Bb1susceptible genotypes”, Insects, 6(4), pp 943-960 43 Jefferson R A., Kavanagh T A., Bevan M W (1987), “GUS fusion: β- 113 glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO, 6, pp 3901-3907 44 Garcia S., Bergvinson D J., Burt A J., Ramputh A I., Diaz-Pontones D M., Arnason J T (2004), “The role of pericarp cell wall omponents in maize weevil resistance”, Crop Science, 44, pp 1546-1552 45 Gordon-Kamm W J., Spencer T M., Mangano M L., Adams T R., Daines R J., Start W G., Lemaux P G (1990), “Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants”, The Plant Cell Online, 2(7), pp 603618 46 Gorji A H., Zolnoori M., Jamasbi A., Zolnoori Z (2011), “In vitro plant generation of tropical maize genotypes International Conference on Enviromental”, Biomedical and Biotechnology IPCBEE, 16, IACSIT Press, Singapore 47 Greene T W., Hannah L C (1998), “Enhanced stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase is gained through mutants that alter subunit interactions”, Proc Natl Acad Sci, 95, pp 13342-13347 48 Guedes R N C., Oliveira E., EGuedes N M P, Ribeiro B., Serra J E (2006), “Cost and mitigation of insecticide resistance in the maize weevil, Sitophilus zeamais”, Physiological Entomology, 31, pp.30-38 49 Guy R (1987), “Maize”, Tropical Agriculturist, C.T.A., Macmillan, London, pp 22- 36 50 Gwinner J., Harnisch R., Muck O (1996), “Manual on theprevention of post harvest seed losses, post harvest project, GTZ, D-2000”, Hamburg, FRG, pp 294 51 Hannah L C., Futch B., Bing J., Shaw J R., Boehlein S., Stewart J.D., Beiriger R., Georgelis N., Greene T (2012), “A shrunken-2 transgene increases maize yield by acting in maternal tissues to increase the frequency of seed development”, Plant Cell, 24(6), pp 2352-2363 52 Harjes C E., Rocheford T R , Bai L., Brutnell T P., Kandianis C B., Sowinski S G (2008), “Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase 114 tapped for maize biofortification”, Science, 319, pp 330-333 53 Harwood J D., Wallin W G., Obrycki J J (2005), “Uptake of Bt endotoxins by non-target herbivores and higher order arthropod predators: molecular evidence from a transgenic corn agroecosystem”, Molecular Ecology, 14(9), pp 2815-2823 54 Hitchon A J., Smith J L., French B W., Schaafsma A W (2015), “Impact of the Bt corn proteins Cry34/35Ab1 and Cry3Bb1, alone or pyramided, on western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) beetle emergence in the fieldz”, Econ Entomol, 108(4), pp 1986-1993 55 Horikoshi R J., Bernardi O., Bernardi D., Okuma D M., Farias J R., Miraldo L L., Amaral F.S., Omoto C (2015), “Near-Isogenic Cry1F-Resistant strain of spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) to investigate fitness cost associated with resistance in Brazil”, Econ Entomol, 30, pp 382-387 56 Huang G J., Lai H C., Chang Y S., Sheu M J., Lu T L., Huang S S (2008), “Antimi-crobial, dehydroascorbate reductase, and monodehydroascorbate reductase activities of defensin from sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam ‘tainong 57’] storage roots”, J Agric Food Chem, 56, pp 2989-2995 57 Hythum M S., Nasser K B., Gizawy E (2012), “Importance of micronutrients and its application methods for improving maize (Zea mays L.) yield grown in clayey soil, american-eurasian”, J Agric & Environ Sci, 12 (7), pp 954-959 58 Ichiro M., Tomiko A., Toshiaki O., Tomoko T., KeikoA (2009), “Cathepsin D-like aspartic proteinase occurring in a maize weevil, Sitophilus zeamais, as a candidate digestive enzyme”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 73 (10), pp 2338-2340 59 Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T (1996), “High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Nature Biotechnology, 14(6), pp 745-750 60 Ishida Y., Hiei Y., Komari T (2007), “Agrobacteium-mediated transformation of maize”, Nature Protocol (7): 1614-1621 61 Ishida Y., Hiei Y., Komari T (2007), “Agrobacteium-mediated transformation 115 of maize”, Nature Protocol, (7), pp 1614-1621 62 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci, 12, pp 69-72 63 Kant P., Liu W Z., Pauls K P (2009), “PDC1, a corn defensin peptide expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris inhibits growth of Fusarium graminearum”, Peptides, 30, pp 1593-1599 64 Kumar R (1984), “Insect pest control with special reference to African agriculture”, Edward Arnold Publishers Ltd, Great Britain 65 Feng Lin K., Tian R L., Ping H T., Ming P H., Ching S C., Ping C L (2007), “Structure-based protein engineering for α-amylase inhibitory activity of plant defensin, PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics, 68, pp 530–540 66 Kushmerick C., Castro M S., Cruz J S., Bloch J C., Beira P S L (1998), “Functional and structural features of ɤ-zeathionins, a new class of sodium channel blockers”, FEBS Lett, 440, pp 302-306 67 Lay F T., Anderson M A (2005), “Defensins – components of the innate immune system in plants”, Current Protein and Peptide Science, 6, pp 85101 68 Lay F T., Schirra H J., Scanlon M J., Anderson M A., Craik D J (2003), “The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application to a homology model of the crop defense protein alfAFP”, J Mol Biol,325, pp 175-188 69 Liliana P L M S., Alejandra B (2013), “Bacillus thuringiensis insecticidal three-domain Cry toxins: mode of action, insect resistance and consequences for crop protection”, FEMS Microbiol Rev, 37, pp 3-22 70 Livak K J., Schmittgen T D (2001), “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the (-Delta Delta C (T)) Method”, Methods, 25, pp 402-408 71 Liu Y., Cheng C , Lai S., Hsu M., Chen C., Lyu P (2006), “Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung beanand its possible role in insecticidal 116 activity against bruchids”, Proteins: Structure, Function and Genetics, 63(4), pp 777-786 72 Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J (2011), “Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize”, Planta, 233, pp 241-250 73 Li J (2013), “Enhancing sucrose synthase activity results in increased levels of starch and ADP-glucose in maize (Zea mays L.) seed endosperms”, Plant Cell Physiol, 54, pp 282-294 74 Liu Y J., Cheng C S., Lai S M., Hsu M P., Chen C., Lyu P C (2006), “Solution strucure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids”, Proteins, 63, pp 777-786 75 Lobo D.S., Pereira I.B., Fragel-Madeira L., Medeiros L.N., Cabral L.M., FariaJ., Bellio M., Campos R.C., Linden R., Kurtenbach E (2007), “Antifungal Pisum sativum defensin interacts with Neurospora crassacyclin Frelated to the cell cycle”, Biochemistry, 46 (4), pp 987- 996 76 Luke C N., Chris O A., Emmanuel O O (2015), “Screening for new sources of resistance to Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera:Curculionidae) infestatuon in stored maize genotypes”, J.Crop Prot, (3), pp 277-290 77 Maceljski M., Korunic Z (1973), “Contribution to the morphology andecology of Sitophilus zeamais Motsch in Yugoslavia”, J Stored Prod Res, 9, pp 225234 78 Mahesh B C., Kenneth J B., Timothy C.H (2003), “Module-specific regulation of the β-phaseolin promoter during embryogenesis”, Plant J 33: 853-866 79 Maite B., Joaquín R., Elisa G., Luis M.M., Antonio M., Gregorio H (2005), “A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region”, Plant Molecular Biology, 58, pp 269-282 80 Makanjuola W A., Isong I U., Omoloye A A., Kemabonta K A., Ogunyadeka A O (2009), “Inherent susceptibility of elite rice varieties to post 117 harvest damage by Sitophilus zeamais Motsch, (Coleoptera: Curculiondae) ”, Nigerian Journal of Ecology, 10, pp 11-15 81 Măruţescu A (2012), “A brief survey regarding fate of Bt proteins synthesized by transgenic maize in soil, JOURNAL of Horticulture”, Forestry and Biotechnology, 16(2), pp 126-130 82 Melo F R., Rigden D J., Franco O L., Mello L V., Ary M B., Grossi-deSa´M F., Bloch C (2002), “Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling and docking”, Proteins, 48, pp 311-319 83 Mendez E., Rocher A., Calero M., Girbes T., Citores L., Soriano, F (1996), “Primary structure of ω-hordothionin, a novel member of a family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems”, J Biochem, 239, pp 67-73 84 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), “Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch,(Coleoptera: Curculionidae) ”, Neotrop Entomol, 41 (5), 404-408 85 Morton R L., Schroeder H E., Bateman K S., Chrispeels M J., Armstrong E., Higgins T J V (2000), “Bean alpha-amylase inhibitor in transgenic peas (Pisum sativum) provides complete protection from pea weevil (Bruchus pisorum) under field conditions”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 97(8), pp 3820-3825 86 Munyiri S W., Mugo S N., Otim M., Mwololo J K., Okori, P (2013), “Mechanisms and sources of resistance in tropical maize inbred lines to Chilo partellusstem borers”, Journal of Agricultural Sciences, (7), pp 51-60 87 Murray M G., Thompson W F (1980), "Rapid isolation of high molecular weight plant DNA", Nucleic Acids Res., 8(19), pp 4321-4325 88 Mwololo J K., Mugo S., Okori P., Tefera T., Otim M., Munyiri S W (2012), “Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamais in Tropical Maize”, Journal of Agricultural Science, 4(11), pp 206- 212 89 Nicole L V W., Marilyn A A (2013), Plant defensins: Common fold, multiple functions, Fungal biology reviews, 26, pp.121-131 118 90 Nguyen Q D., Dang T D (2009), “Some research result on alien invasive species Bean weevil Acanthosscelides obtectus Say (Coleoptera, Bruchidae) in Vietnam”, Sience Journal, (37), pp 105-114 91 Nwosu L C., Nwosu U I (2012), “Assessment of maize cob powder for the control of weevils in stored maize grain in Nigeria”, Journal of tomological Research, 36 (3), pp 21-24 92 Nwosu L C (2015), “Integrating host resistance with plant materials in the management of Sitophilus zeamais infestation in stored maize”, Ph.D Thesis, ederal University of Technology Akure, Ondo State, Nigeria 93 Ombori O., Muoma J V O., Machuka J (2013), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines”, Plant Cell Tiss, 113 (1), pp 11-23 94 Osborn R W., De Samblanx G W., Thevissen K., Goderis I., Torrekens S., Van Leuven F., Attenborough S., Rees S B., Broekaert W F (1995), “Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae”, FEBS Lett, 368, pp 257-262 95 Osipitan A A., Odebiyi, J A (2007), “Laboratory evaluation of twenty maize (Zea mays L.) varieties for resistance to the larger grain borer, Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera; Bostrichidae) in Ibadan, Oyo State, Nigeria”, Nigerian Journal of Entomology, 24, pp 54-67 96 Ostrem J S., Pan Z., Flexner J L., Owens E., Binning R., Higgins L S (2016), “Monitoring Susceptibility of Western Bean Cutworm (Lepidoptera: Noctuidae) Field Populations to Bacillus thuringiensis Cry1F Protein”, J Econ Entomol, 9, pp 376-383 97 Pelegrini P B., Franco O L (2005), “Plant gamma-thionins: novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense pro-teins”, Int J Biochem Cell Biol, 37, pp 2239-2253 98 Pelegrini B P., Lay F T., Murad M A., Anderson M A., Franco L.O (2008), “Novel insights on the mechanism of action of α-amylase inhibitors from the plant defensin family”, Proteins, 73, pp 719-729 119 99 Peng W K., Lin H.C., Wang C.H (2003), “DNA identification of two laboratory colonies of the weevils, Sitophilus oryzae (L.) and S zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) in Taiwan”, Journal Of Stored Products Research, 39(2), pp 225-235 100 Proctor D.L (1971), “An additional aedeagal character for distinguishing Sitophilus zeamais Motsch from Sitophilus oryzae (L.) (Coleoptera: Curculionidae) ”, Journal of Stored Products Research, 6, pp 351-352 101 Qiudeng Q., Sivamani E., Xianggan L., Heng Z., Samson N., Michael S., Xiaoyin F., Michael N., Timothy K., Weining G., Zhongying C., Mary-Dell M C (2014), “Maize transformation technology development for commercial event generation”, Plant Sience, 5, pp 379-398 102 Sakulsingharoj C.(2004), “Engineering starch biosynthesis for increasing rice seed weight: the role of the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase”, Plant Sci, 167, pp 1323-1333 103 Sambrook J., Russell D W (2001), “Molecular Cloning”, A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, NY 104 Santos-Amaya O F., Rodrigues J V., Souza T C., Tavares C S., Campos S O., Guedes R N., Pereira E J (2015), “Resistance to dual-gene Bt maize in Spodoptera frugiperda: selection, inheritance, and cross-resistance to other transgenic events”, Sci Rep, 17(5), pp.18243 105 Schuppener M., Mühlhause J., Müller A K., Rauschen S (2012),“Environmental risk assessment for the small tortoiseshell aglais urticae and a stacked Bt-maize with combined resistances against Lepidoptera and Chrysomelidae in central European agrarian landscapes”, Mol Ecol, 21, pp 4646-4662 106 Shaista N., Changfu Z., Gemma F., Koreen R., Ludovic B., Ju¨rgen Breitenbach., Dario P C., Gaspar R., Gerhard S., Teresa C., Paul C (2009), “Transgenic multivitamin corn through biofortification of endosperm with three vitamins representing three distinct metabolic pathways”, PNAS, 106, pp 7762-7767 120 107 Shohael A.M., Akanda M A L., Parves S., Mahfuja S., Alam M F., Islam R., Joarder N (2003), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo derived callus of inbred maize (Zea mays L.) ”, Biotechnol, 2(2), pp 154-161 108 Silverio G L., David J B (2015), “Phytochemical and Nutraceutical Changes during Recurrent Selection for Storage Pest Resistance in Tropical Maize”, Crop science, 54, pp 2423-2432 109 Silva E M., Valencia A., Grossi-de-Sá, M F., Rocha T L., Freire E., Paula J E (2009), “Inhibitory action of cerrado plants against mammalian and insect α-amylases”, Pesticide Biochemistry and Physiology, 95(3), pp 141146 110 Siebert M W., Nolting S P., Hendrix W., Dhavala S., Craig C., Leonard B R., Stewart S D., All J., Musser F R., Buntin G D., Samuel L (2012), “Evaluation of corn hybrids expressing Cry1F, cry1A.105, Cry2Ab2, Cry34Ab1/Cry35Ab1, and Cry3Bb1 against southern United States insect pests”, J Econ Entomol, 105(5), pp 1825-1834 111 Solis J., Medrano G., Ghislain M (2007), “Inhibitory effect of a defensin gene from the Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora infestans”, J Plant Physiol, 164, pp 1071-1782 112 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol 98, pp:503-517 113 Spelbrink R.G., Dilmac N., Allen A., Smith, T.J., Shah, D.M., Hockerman, G.H (2004), “Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related plant defensins”, Plant Physiol, 135 (4), pp 20552067 114 Tadele T., Stephen M., Paddy L (2011), “Effects of insect population density and storage time on grain damage and weight loss in maize due to themaize weevil Sitophilus zeamais and the larger grain borer Prostephanus truncatus”, African Journal of Agricultural Research, 6(10), pp 2249-2254 115 Takava S., Rahnama H., Rahimian H., Kazemitabar K (2010), 121 “Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.) ”, Journal of Sciences, 21(1), pp 21-29 116 Tadele T., Girma D., Stephen M., Yoseph B (2013), “Yield and agronomic performance of maize hybrids resistant to the maize weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae)”, Crop Protection, 46, pp 94-99 117 Terras F R., Torrekens S., Van Leuven F., Osborn R W., Vanderleyden J., Cammue B P., Broekaert W F (1993), “A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species”, FEBS Lett, 316 (3), pp 233-240 118 Thevissen K., de Mello T P, Xu D., Blankenship J., Vandenbosch D., Idkowiak-Baldys J., Govaert G., Bink A., Rozental S., de Groot P W., Davis T R., Kumamoto C A., Vargas G., Nimrichter L., Coenye T., Mitchell A., Roemer T., Hannun Y A., Cammue B P (2012), “The plant defensin RsAFP2 induces cellwall stress, septin mislocalization and accumulation of ceramides in Candida albicans”, Mol Microbiol, 84 (1), pp 166-180 119 Topping J F (1998), “Tobacco transformation”, Methods of Mol Biol, 81, pp 365-372 120 Tongjura J D C., Amuga G A., Mafuyai H B (2010), “Laboratory assessment of the susceptibility of some varieties of Zea mays infested with Sitophilus zeamais, Motsch, (Coleoptera: Curculionidae) in Jos, Platue State, Nigeria”, Science World Journal, (2), pp 55-57 121 Vain P., Yean H., Flament P (1989), “Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L by AgN03”, Plant Cell Tiss, 18, pp 143-153 122 Wang Z (2007), “Increasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants”, Plant Cell Tiss Org, 88, pp 83-92 123 Wang T T., Ji J., Wang G., Guan C F., Zhang L., Jin C (2012), “Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy Gene into Shoot Meristem of 122 Maize”, China Biol, 32(8), pp 36-40 124 Wang Y., Hu Z., Wu W (2015), “Different Effects of Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ab on Midgut Cell Transmembrane Potential of Mythimna separata and Agrotis ipsilon Larvae”, Toxins (Basel), 7(12), pp 5448-5458 125 Watrud L S., Lee E H., Fairbrother A., Burdick C., Reichman J R., Bollman M., Water P K V (2004), “Evidence for landscape-level, pollenmediated gene flow from genetically modified creeping bentgrass with CP4 EPSPS as a marker”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(40), pp.14533-14538 126 Wong J H., Zhang X Q., Wang H X , Ng T B (2006), “A mitogenic defensin fromwhite cloud beans (Phaseolus vulgaris) ”, Peptides, 27, pp 20752081 127 Yamaguchi-Shinozaki K., Sakuma Y., Ito Y., Shinozaki K (2006), “The DRE-DREB regulon of gene expression in Arabidopsis and rice in response to drought and cold stress, In: J.-M Ribaut (Ed.) Drought adaptation in cereals”, Haworth, NY pp 583-598 128 Zahida Q., Khadija A., Idrees A N., Abdul M F., Bushra T., Qurban A., Arfan A., Mudassar F A., Muhammad T., Tayyab H (2015), “An overview of genetic transformation of glyphosate resistant gene in Zea mays”, Nature and Science, 13(3), pp 81-90 129 Zhang L., Shen W., Fang Z., Liu B (2016), “Cry1ab/c in different stages of growth in transgenic rice Bt- shanyou”, Front Biosci, 1(21), pp 447-454 130 Zhao Z U., Cai1 T., Tagliani L., Miller M., Wang N., Pang H., Rudert M., Schroeder S., Hondred D., Seltzer J., Pierce D (2000), “Agrobacteriummediated sorghum transformation”, Plant Mol Biol, 44, pp 789-798 ... Nghiên cứu đặc điểm biểu gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ ngô Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ số giống ngô có khả kháng mọt ngô khác Biểu protein ZmDEF1 tái... quan tâm đến nghiên cứu khả kháng mọt hại ngô để tìm mối quan hệ đặc điểm hạt ngô với tính kháng mẫm cảm với mọt ngô [12], [88] Một số tác giả khẳng định khả kháng mọt ngô ngô liên quan đến đặc. .. lệ nhiễm mọt giống ngô nghiên cứu .63 3.1.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu 63 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 66 3.2.1 Đặc điểm gen ZmDEF1