Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) ngũ cốc có suất cao giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống 30% dân số giới Ngày nay, giới ngô đứng thứ ba diện tích, đứng thứ hai sản lượng đứng đầu suất Ngô dùng để sản xuất khoảng 650 mặt hàng khác ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược phẩm9 công nghiệp nhẹ Ngô góp phần vào việc ổn định sản lượng ngũ cốc giới có vai trò quan trọng kinh tế thương mại quốc tế Ở Việt Nam, việc phát triển ngô thời gian qua đạt nhiều thành tựu, tăng nhanh diện tích, suất sản lượng; nhiên gặp nhiều thách thức, có vấn đề sâu hại Đã có nhiều giống ngô lai có suất cao đưa vào sản xuất, song xuất hạn chế khả bảo quản, dễ bị nấm, mọt… xâm hại nhiều giống ngô địa phương truyền thống suất thấp khả bảo quản sau thu hoạch lại tốt Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) loại đa thực, chúng ăn hầu hết loại ngũ cốc, loại đậu, hạt có dầu nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp với mọt ngô hạt ngô Năng suất chất lượng ngô bị ảnh hưởng nhiều mọt ngô, chúng làm giảm sản lượng sau thu hoạch trung bình 20%, có trường hợp phá hại chúng lên đến 90% vòng sáu tháng Ngăn chặn công mọt với ngô vấn đề cấp bách bảo quản ngô góp phần bảo đảm an ninh lương thực toàn giới Một số biện pháp bảo quản ngô sau thu hoạch sử dụng phổ biến sấy nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, dùng thảo mộc,… Tuy vậy, biện pháp tốn nhiều công sức, hiệu thấp, giá thành cao Mặt khác, biện pháp dùng thuốc hoá học gây nhiều mối lo ngại ô nhiễm môi trường, độc hại tới vật nuôi người Defensin thực vật phân bố rộng rãi giới thực vật, có cấu trúc không gian nhỏ, bền, hình cầu với thành phần khoảng 45 - 54 amino acid giàu cysteine Defensin protein đa chức năng, chúng ức chế trình dịch mã, ảnh hưởng đến chức của kênh màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxy hoá khử ascorbic acid, ức chế protease đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase của côn trùng Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, defensin phân lập từ đậu xanh, đậu đũa có khả ức chế hoạt động α-amylase ấu trùng mọt đậu xanh đậu đũa Nhưng ức chế defensin với α-amylase từ động vật có xương sống thấp Vì vậy, có nhiều tác giả tập trung nghiên cứu tăng cường khả kháng mọt đậu, đỗ sử dụng protein defensin đạt kết cao Tuy nhiên, cho đế n chưa có những công trình nghiên cứu mở rộng ứng dụng protein defensin với nhiều đối tượng nông sản khác bị thiệt hại lớn mọt hại ngô Trong năm gần đây, biế n đổ i di truyề n đã trở thành mô ̣t công cu ̣ quan tro ̣ng nghiên cứu về quá trình bản ở thực vâ ̣t và cải tiế n giống trồ ng Kỹ thuâ ̣t ta ̣o chuyể n gen phát triể n nhanh chóng kể từ thành công đầ u tiên viê ̣c đưa gen ngoa ̣i lai vào thực vâ ̣t nhờ A tumefaciens Cây chuyển gen có những đă ̣c điể m đă ̣c biê ̣t, có thể cải tiế n giá tri ̣ về dinh dưỡng, tăng sản lượng, tăng khả chống chịu và nhiề u đă ̣c tính ưu viê ̣t khác Việc ứng dụng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen để tạo giống ngô có khả kháng mọt cao là vấ n đề thực tiễn đặt nghiên cứu bảo quản ngô hạt sau thu hoạch Xuất phát từ lý trên, xây dựng đề tài luận án là: “Nghiên cứu đặc điểm biểu gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ ngô” Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ số giống ngô có khả kháng mọt ngô khác Biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp (rZmDEF1) chuyển gen 3 Nội dung nghiên cứu (i) Đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu điều kiện lây nhiễm mọt ngô nhân tạo (ii) Phân tích đặc điểm gen ZmDEF1 giống ngô có khả kháng mọt ngô khác (iii) Thiết kế vector chuyển gen chứa ZmDEF1 đánh giá hoạt động vector chuyển gen thuốc hệ T0 T1, phân tích khả ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô protetin rZmDEF1 (iv) Nghiên cứu tạo ngô chuyển gen ZmDEF1 từ giống LC1 LVN99 Phân tích sự biể u hiê ̣n gen ZmDEF1 ngô chuyể n gen ở thế hệ T1 đánh giá hoạt động ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô protein rZmDEF1 Những đóng góp luận án Luận án công trình nghiên cứu có hệ thống, từ đánh giá khả kháng mọt ngô giống ngô đến phân lập, tách dòng, giải trình tự gen, thiết kế vector chuyển gen và phân tích biể u hiê ̣n gen ZmDEF1 thuốc ngô chuyển gen Cụ thể là: 1) Đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu xác định giống ngô SL có khả kháng mọt ngô tốt hai giống LC1 LVN99 có khả kháng mọt ngô 2) Gen ZmDEF1 (DNA) phân lập từ giống ngô nghiên cứu có 345 bp, cấu trúc hai exon intron với 102 bp; gen ZmDEF1 (cDNA) có 243 bp mã hóa cho 80 amino acid 3) Gen ZmDEF1 biểu thành công thuốc lá, ngô chuyển gen Protein rZmDEF1 tách chiết từ thuốc ngô chuyển gen có khối lượng phân tử gần 10 kDa biểu chức ức chế hoạt động α-amylase ấu trùng mọt ngô Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Kết đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn tiếp cận nghiên cứu tăng cường khả kháng mọt ngô kỹ thuật chuyển gen Về mặt khoa học Kết nghiên cứu đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen ZmDEF1 phân lập từ giống ngô địa phương giống ngô lai LVN99, góp phần xác định cấu trúc gen ZmDEF1 ngô thông qua so sánh trình tự nucleotide phân lập từ cDNA DNA Phát triển thành công cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 biểu chức ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt ngô protein rZmDEF1 chuyển gen sở khoa học cho ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả kháng mọt ngô ngô Các báo đăng tải tạp chí khoa học - công nghệ quốc tế nước với trình tự gen công bố Ngân hàng Gen tư liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu và giảng da ̣y Về mặt thực tiễn Dịch chiết protein hạt dòng thuốc lá, ngô chuyển gen ZmDEF1 có khả ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt ngô góp phần giải sở lý luận vấn đề nâng cao khả kháng mọt theo cách tiếp cận tăng cường biểu gen ZmDEF1 phương pháp chuyển gen Kết sở khoa học vững cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyể n gen nâng cao khả kháng mọt ngô, mở triển vọng ứng du ̣ng mới thực tiễn tạo giống ngô kháng mọt cao Cấu trúc luận án: Luận án có 122 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (22 trang); Chương 3: Kết thảo luận (45 trang); Kết luận đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang) Luận án có 30 bảng, 33 hình tham khảo 130 tài liệu 5 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu tiếng Việt; 122 tài liệu tiếng Anh để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) (2) Đặc điểm defensin thực vật; (3) Nghiên cứu chuyển gen ngô Mọt ngô loài gây hại phổ biến dịch hại nguyên phát, phân bố phổ biến hầu khắp nước giới, gây hại lớn vùng ấm áp, Châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) Bắc Mỹ Ở nước ta, gặp mọt hại ngô tất địa phương, chúng có mặt 100% kho bảo quản ngô Tác hại mọt hại đến sản lượng chất lượng ngô lớn Trung bình mọt hại làm giảm 20% khối lượng ngô sau thu hoạch Tuy nhiên, với kho bảo quản tốt mức độ thiệt hại thường 20%, kho bảo quản thường thiệt hại 20% số trường hợp tổn thất mọt hại gây với ngô lên đến 90% Hạt ngô có đặc điểm vỏ dày, độ cứng cao, hàm lượng phenolic acid cao, chất ức chế tripsin, ức chế αamylsae hàm lượng chất sơ hạt ngô cao khả kháng mọt cao Defensin peptide cation với vùng chức chứa từ 45-55 amino acid với phân tử cystein (Cys) tạo nên cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc không gian ba chiều ổn định với dạng CSαβ đặc trưng cho defensin thực vật Cấu trúc không gian ba chiều defensin gồm phiến gấp β chuỗi xoắn α Trong đó, nếp gấp β thứ thứ có vùng loop 3, vùng có chức quan trọng ức chế hoạt động α- amylase mọt Do có liên kết gữa loop (VrD1) với trung tâm hoạt động αamylase ấu trùng mọt lực hút tĩnh điện, ngăn cản tinh bột vào trình tiêu hóa tinh bột mọt bị ngừng trệ làm mọt suy yếu dần, dẫn đến chết (Feng Lin Cs 2007) Sự ức chế biể u hiê ̣n thấp αamylase động vật, có sai khác về độ dài loop trung tâm hoạt động α-amylase động vật dài hơn, dẫn đến ngăn cản loop defensin (VuD1) không liên kết vào trung tâm hoạt động α-amylase (Pelegrini cs (2008) Phôi non đã chứng tỏ là mô ̣t nguồ n nguyên liê ̣u vươ ̣t trô ̣i cho chuyển gen ngô nhờ A tumefaciens Sản lượng giá trị dinh dưỡng ngô ngày tăng lên sử dụng giống ngô chuyển gen vào sản xuất Đến nay, hàng loạt gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại gen Cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis chuyển thành công vào ngô (Liliana cs 2013) Các giống ngô có khả chịu hạn cao đưa vào sản xuất (Qiudeng cs 2014) Nhiều giống ngô chuyển gen cho suất cao tăng số lượng hạt ngô bắp hay tăng trọng lượng hạt (Zhang cs 2016) Ngô chứa đa vitamin tạo chuyển đa gen (Shaista cs 2009)…Tuy nhiên, thành tựu quan trọng ngô chuyển gen, hướng nghiên cứu tạo ngô chuyển gen nhằm tăng cường khả kháng mọt hại chưa quan tâm nhiều Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Sử dụng giống ngô địa phương với ký hiệu giống SL, LC1, LC2, LC3 giống ngô lai LVN99 Trung tâm giống trồng Lào Cai, Sơn La cung cấp Giống thuốc Nicotinana tabacum C9-1 Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Việt Nam cung cấ p Các chủng vi khuẩn loại vector sử dụng nghiên cứu cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, A tumefaciens CV58; vector pBT tách dòng gen, p201- SLHEP- HA, pBetaPhaso-dest (nhập từ công ty MCLAB, Mỹ) 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hoá chất, KIT mua hãng tiếng Thế giới Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen ; Các thí nghiệm đánh giá khả kháng mọt kiểm tra chức sinh học gen chuyển tiến hành phòng thí nghiệm Khoa Sinh - Hoá, Trường Đại học Tây Bắc Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen vào thuốc phân tích chuyển gen, tiến hành phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ Tế bào thực vật Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các thí nghiệm chuyển gen vào ngô thực phòng Tế bào Sinh học đại, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Công trình hoàn thành Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp nghiên cứu chia thành nhóm chính: (1) nhóm phương pháp đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu, (2) nhóm phương pháp tách dòng xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (4) nhóm phương pháp tạo chuyển gen, (5) nhóm phương pháp phân tích chuyển gen Các thí nghiệm tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả hình 2.2 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1 Phương pháp đánh giá khả kháng mọt Hạt giống ngô nghiên cứu, loại bỏ hạt sâu, bệnh, sấy khô đến đo độ ẩm máy đạt 13%, tiến hành chia thành lô thí nghiệm lô đối chứng Lô thí nghiệm, cân 50g hạt ngô thả 15 cặp mọt ngô vào bình có nắp, lô đối chứng không thả mọt Các tiêu đánh giá thời điểm 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày 60 ngày gây nhiễm mọt nhân tạo, xác định tiêu: Khối lượng hạt hao hụt lô thí nghiệm, tỷ lệ nhiễm mọt, tỷ lệ tạo bột ngô, hệ số gia tăng quần thể (r) mọt 2.3.2 Phương pháp tách dòng giải tự trình tự gen ZmDEF1 Phân lập gen ZmDEF1 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế ZmDEF1F_SalI /ZmDEF1R_HindIII khuôn mẫu từ DNA tổng số tách chiết lá; từ RNA tổng số tách chiết hạt ngâm ủ với ABA qua tổng hợp cDNA Tách dòng giải trình tự gen qua bước: i) Tinh sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc colony PCR; v) Tách chiết plasmid cắt kiểm tra BamHI; vi) Xác định phân tích trình tự nucleotide Kết nghiên cứu trình tự gen, amino acid xử lý phần mềm BioEdit, DNA Star 2.3.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang chuyển ZmDEF1 Vector chứa gen ZmDEF1 chuyển gen vào thực vật phát triển theo hai bước bản: (1) Ta ̣o cấu trúc mang gen chuyển pDON201-SLHEPZmDEF1 (2) Gắn cấu trúc gen mang gen chuyể n ZmDEF1 vào vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 2.3.4 Phương pháp tạo chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Biến nạp pBetaPhaso-ZmDEF1 vào tế bào A tumefaciens CV58 xung điện, chọn lọc colony PCR nhân dòng vector chuyển gen để tạo chủng vi khuẩn mang vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 phục vụ biến nạp 9 Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào thuốc N tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A tumefaciens tạo thuốc chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả Topping - 1998 Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào phôi ngô giống LC1 LVN99 nhờ vi khuẩn A tumefaciens Quy trình tạo ngô chuyển gen thực dựa nghiên cứu Frame cs 2002 Trần Thị Lương cs 2014 Hiệu suất chuyển gen (%) = Số mang gen chuyển × 100 Tổng số mẫu biến nạp 2.3.5 Phương pháp phân tích chuyển gen Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII, kỹ thuật lai Southern Kiểm tra có mặt sản phẩm phiên mã gen ZmDEF1 RT-PCR Đánh giá mức độ biểu phiên mã gen chuyển Real-time RT-PCR theo phương pháp R=2-∆∆Ct Livak - 2001 Kiểm tra có mặt protein rZmDEF1 lai Western Đánh giá biểu chức sinh học gen chuyển khả ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt protein rZmDEF1 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU Để xác định giống ngô nghiên cứu khả kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) đồng thời để có lựa chọn giống ngô có khả kháng mọt tốt nhất, phục vụ phân lập gen nhằm cung cấp nguyên liệu cho việc phát triển vector chuyển gen, thực đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu điều kiện gây nhiễm mọt nhân tạo của giống địa phương: SL, LC1, LC2, LC3 và giố ng ngô lai LVN99 Các tiêu đánh giá bao gồm: khối lượng ngô hao hụt, tỷ lệ bột ngô tạo ra, tỷ lệ nhiễm mọt hệ số gia tăng quần thể mọt Số 10 liệu phân tích trình bày bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 luận án kết cho thấy giống SL có khả kháng mọt tốt nhất, giống thấp LVN99 LC1 có khả kháng mọt Bảng 3.5 Chỉ số mẫn cảm mọt tương đối (S) giống ngô nghiên cứu Giống SL S 1754,19 LC1 3515,75 LC2 LC3 2594,27 2128,14 LVN99 6088,71 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 3.2.1 Đặc điểm gen ZmDEF1 (cDNA) phân lâ ̣p từ giống ngô nghiên cứu 3.2.1.1 Tách dòng cDNA xác định trình tự gen ZmDEF1 Dựa trình tự gen ZmDEF1 ngô công bố Ngân hàng Gen quốc tế mang mã số JF797205, cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI /ZmDEF1R_HindIII chứa điểm cắt enzyme giới hạn SalI HindIII để thiết kế vector Sản phẩm PCR khuếch đại gen ZmDEF1 từ cDNA kiểm tra gel agarose nhận băng DNA kích thước khoảng 0,25kb phù hợp với kích thước dự đoán thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2A) Gen ZmDEF1 tách dòng với bước: gắn vào vector pBT; biến nạp vào E.coli DH5α sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích tái tổ hợp cặp mồi M13_F/M13_R (Hình 3.2-C) Trước đọc trình tự, plasmid tái tổ hợp mang gen ZmDEF1 cắt kiểm tra BamHI cho kết dương tính 5/5 mẫu thử Việc giải trình tự máy tự động thực lặp lại lần/mẫu Kết phân tích cho thấy đoạn mã hoá gen ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu có kích thước 243 bp, mã hoá 80 amino acid, có đô ̣ tương đồ ng của các trình tự gen này là 98,8 % đến 99,6% Như khẳng định phân lâ ̣p và tách dòng thành công gen ZmDEF1 (cDNA) từ giống ngô nghiên cứu 11 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 (A); Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp BamHI (B) colony-PCR chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp (C) (SL, LC1, LC2, LC3: giống ngô địa phương, LVN99 giống ngô lai LVN99; - 21: dòng vi khuẩn chọn lọc colony-PCR với cặp mồi M13; (-): đối chứng âm PCR từ nước cất; ĐC: plasmid tái tổ hợp không cắt BamHI; M: thang DNA 1kb plus; M1: thang DNA 1kb) 3.2.1.2 Phân tích trình tự nucleotide vùng mã hoá gen ZmDEF1 Kết so sánh trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ giống ngô địa phương nghiên cứu giống ngô lai LVN99 với trình tự mang mã số JF797205 Ngân hàng gen quốc tế cho thấy trình tự gen ZmDEF1 có vi ̣trí nucleotide sai khác vi ̣trí nucleotide thứ 43, 53, 101, 161 195 Trình tự amino acid suy diễn từ vùng mã hóa gen ZmDEF1của giống ngô nghiên cứu JF797205 có 80 amino acid hình 3.4 Hình 3.4 cho thấy, vùng chức giống ngô nghiên cứu có vị trí amino acid sai khác vị trí 3, 23 Đặc biệt vị trí amino acid thứ giống ngô địa phương SL, LC1, LC2, LC3 trình tự JF797205 cystein (C) để tạo cầu nối disulfide với Cys thứ 49, giống ngô lai LVN99 vị trí thứ tyrorine (Y) Vì cấu trúc protein ZmDEF1 giống ngô lai LVN99 có cầu nối disulfide 12 Hình 3.4 Trình tự amino acid suy diễn protein ZmDEF1 giống nghiên cứu JF797205 Ngân hàng gen Quốc tế 3.2.2 Đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ DNA So sánh trình tự gen ZmDEF1 phân lập từ DNA tổng số với trình tự phân lập từ cDNA cho thấy, ZmDEF1 hệ gen dài 345 bp gồm exon intron xen kẽ với 102 bp (Hình 3.6) Intron – 102 bp Exon1- 64 bp 65 Exon2- 179 bp 166 345 Hình 3.6 Sơ đồ cấu trúc gen ZmDEF1 ngô 3.2.3 Sự đa dạng về trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ngô Để xác định mức độ đa dạng trình tự nucleotide gen ZmDEF1, thực so sánh vùng mã hoá gen ZmDEF1 14 trình tự công bố Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy 14 trình tự vùng mã hóa của gen ZmDEF1, chia sơ đồ thành hai nhóm lớn, với khoảng cách di truyề n là 2,8% 3.3 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 3.3.1 Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 Trình tự nucleotid gen ZmDEF1 giống SL sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật thông qua A tumefaciens Vector chuyển gen mang gen ZmDEF1 phát triển qua hai bước: (1) Ta ̣o cấu trúc mang gen chuyển pDON201-SLHEP-ZmDEF1, pDON201-SLHEP-ZmDEF1 chứa trình tự trao đổi chéo attL; (2) Gắn cấu trúc gen mang gen chuyể n ZmDEF1 vào vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 bẳng cách phản ứng LR với 13 pBetaPhaso-dest có trình tự attR trao đổi với attL để tạo vector chuyển gen nhị thể pBetaPhaso-ZmDEF1 dòng hóa vào tế bào khả biến E coli DH5α Phản ứng colony-PCR thực cặp mồi ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR sử dụng tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhasoZmDEF1 cắt enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra có mặt ZmDEF1 vector tái tổ hợp (Hình 3.8-A) Kết cắt plasmid cắt enzyme giới hạn HindIII thu băng DNA với kích thước khoảng 1,85 kb, 2,4 kb và 11,5 kb Các kích thước này hoàn toàn phù hơ ̣p với tính toán theo lý thuyết Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp Hind III (A) hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR cặp mồi ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII từ khuẩn lạc A tumefaciens CV58 (B) (M1: Thang DNA chuẩn 1kb; M2: Thang DNA chuẩn 1kb plus; 1, 2: Sản phẩm cắt HindIII plasmid tái tổ hợp dòng khuẩn lạc; 1, 2, 3: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc A.tumefaciens; (-):Đối chứng âm dòng khuẩn lạc không biến nạp; (+): Đối chứng dương sản phẩm PCR gen ZmDEF1; ĐC: plasmid tái tổ hợp không cắt HindIII) Sau kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc pBetaPhasoZmDEF1 biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens CV58 kỹ thuật xung điện Phản ứng colony-PCR cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII thực (Hình 3.8-B) cho thấy 14 dòng vi khuẩn A tumefaciens CV58 mang vector chứa cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 chúng sử dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật qua lây nhiễm 3.3.2 Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc nhờ A tumefaciens Tiến hành chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc N tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens với hai lần biến nạp qua giai đoạn: đồng nuôi cấy, tái sinh đa chồi, chọn lọc giai đoạn kéo dài chồi, rễ, bầu đất nhà lưới (hình 3.10) Hình 3.10 Kết tái sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc C9-1 (A: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường chọn lọc; C: Các chồi màu xanh tách môi trường chọn lọc; D: Chồi chuyển gen sau tuần môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ thuốc chuyển gen môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen hoa) Sau lần biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh thuốc với 30 mảnh lá/lần, kế t quả đươ ̣c trình bày ở bảng 3.9 với 18 dòng chuyển gen nhà lưới 15 Bảng 3.9 Kết biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh thuốc C9-1 Lô thí Số mảnh Số Số cụm nghiệm biế n na ̣p mảnh chồi tạo sống sót thành Số dòng Số dòng cây trồng sống bầu đất nhà Số sót Thí lưới x 30 = 60 32 68 98 36 18 ĐC0 30 - - - - ĐC1 30 30 72 102 10 10 nghiệm (ĐC0: thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1: thuố c lá không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh) 3.3.3 Phân tích thuốc chuyển gen 3.3.3.1 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 thuốc chuyển gen hệ T0 Để kiểm tra có mặt gen chuyển ZmDEF1 18 dòng thuốc chuyển gen hệ T0 Chúng tiến hành tách DNA tổng số 18 dòng chuyển gen trồng nhà lưới để thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen ZmDEF1 thuốc chuyển gen (M: thang chuẩn DNA 1kb; - 18: dòng thuốc chuyển gen; (-): đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ cấu trúc chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1) 16 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.11 với 13/18 dòng dương tính với phản ứng PCR Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn 13/60= 21,67% 3.3.3.2 Phân tích biểu ZmDEF1 thuốc chuyển gen T1 Phân tích biểu ZmDEF1 thuốc chuyển gen T1 mức độ phiên mã phản ứng RT- PCR Hạt dòng dương tính với phản ứng PCR sử dụng thực phản ứng RT- PCR (Hình 3.12) Hình 3.12 Kết điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 dòng thuốc chuyển gen (M: thang chuẩn DNA 1kb; - 18: dòng thuốc chuyển gen; (-): đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1) Hình 3.14 Biểu đồ mức độ biểu gen ZmDEF1 từ dòng thuốc chuyển gen hệ T1 (T1-1, T1-3, T1-10, T1-17: dòng thuốc chuyển gen hệ T1;Thanh đứng mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn) 17 Đánh giá mức độ phiên mã gen ZmDEF1 thuốc chuyển gen T1 Real-time RT-PCR: Hạt thuốc dòng T1-1, T1-3, T1-10, T1-17 không chuyển gen (đối chứng âm) sử dụng thực phản ứng Real-time RT-PCR với cặp mồi qDEF1-F/qDEF1-R Chu kỳ ngưỡng (Ct) đối chứng âm gen ZmDEF1 sau chu kỳ thứ 40, nghĩa giống kiểm tra gen ZmDEF1 Kết phân tích cho thấy, tỷ lệ biểu gen ZmDEF1 dòng chuyển gen số T1-1, T1-10,T1-17 cao dòng T1-3 tương ứng 1,17 lần, 1,22 lần 1,44 lần (Hình 3.14) Phân tích biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp lai Western: Hình 3.15 Kết lai Western thuốc chuyển gen hệ T1 (M: thang chuẩn protein 10-180 kDa Thermo Scientific, 1, 3, 10, 17: protein thuốc chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17; (+): đối chứng dương protein có kích thước khoảng 35 kDa có chuỗi c-myc phía đầu C; (-): đối chứng âm protein thuốc không chuyển gen) Hình 3.15 cho thấy, màng lai nitrocellulose dòng thuốc chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17 xuất băng protein vị trí kích thước khoảng10 kDa Điều chứng tỏ, dòng thuốc chuyển gen có protein rZmDEF1 3.2.3 Đánh giá biểu chức sinh học gen ZmDEF1 hạt thuốc hệ T1 Kiểm tra chức sinh học protein rZmDEF1 xác định khả ức chế hoạt động α -amylase mọt Kết thể bảng 18 3.11 Bảng 3.11 cho thấy, với hiệu suất hoạt động α-amylase hỗn hợp gồm α-amylase từ ấu trùng mọt protein không chuyển gen hoạt độ α-amylase mẫu gồm hỗn hợp protein dòng thuốc chuyển gen giảm, 28,19 % đến 37,58% Bảng 3.11 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt thuốc chuyển gen T1 Chỉ có Mẫu ĐC Hỗn hợp α-amylase mọt protein hạt α -amylase dòng thuốc chuyển gen T1 T1-1 Hoạt α- 7,18  0,29 độ amylase 7,13  2,26 0,36 0,46 T1-3  2,01 T1-10 T1-17  2,68  0,73 2,15  0,68 0,58 (ĐVHĐ/mg) Hiệu suất 100 31,69 28,19 37,58 30,15 hoạt động αamylase (%) (ĐC: Hỗn hợp α -amylase mọt protein không chuyển gen) 3.4 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN 3.4.1 Kết chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99 Ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ A tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩ n, tuổi phôi ngô đế n hiê ̣u quả chuyể n gen gus và ngưỡng chọn lọc phôi mang gen chuyển kanamycin giống ngô LVN99 xác định, để làm sở cho chuyển thành công gen đích ZmDEF1 vào phôi ngô Các kết trình bày bảng 3.12, 3.13, 3.14 luận án cho thấy, quy trình chuyể n gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A tumefaciens chủng C58 đã xây dựng và tố i ưu với mật độ vi khuẩn A tumefaciens thích hơ ̣p ở giá tri ̣ OD660nm = 0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tố i ưu là 30 phút, AS bổ sung 150M tuổi phôi từ 10 - 12 ngày tuổi (tương ứng với kích thước 0,9 – 1,3 mm) tuổi phôi tối ưu cho khả tiếp nhận gen sự tái sinh Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đố i với phôi chuyển gen 50mg/l 19 3.4.2 Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A tumefaciens Giống ngô lai LVN99 giống ngô địa phương LC1 làm vật liệu để nhận gen chuyển ZmDEF1 Quá trình biến nạp, tái sinh tạo ngô chuyển gen minh hoạ hình 3.17 Hình 3.17 Hình ảnh tái sinh ngô chuyể n gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giố ng LVN99 vụ hè - thu năm 2016 (A1: Phôi sau nhiễm khuẩn nuôi môi trường đồng nuôi cấy; A2: Phôi nuôi trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 50mg/l, chọn phôi mang gen chuyển lần 1; A3: Phôi nuôi môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 25mg/l, chọn lọc phôi mang gen chuyển lần 2; A4: Phôi nuôi môi trường phục hồi mô sẹo; A5: Phôi nuôi môi trường tái sinh chồi; A6: Phôi nuôi môi trường rễ; Ra cây: Cây trồng trời) Sau hai lần biến nạp sử dụng phôi non ngô vụ đông - xuân (tháng 11 năm 2015 đến năm 2016) vụ hè - thu (tháng 5- tháng năm 2016) thu kết biến nạp tái sinh chuyển gen hai giống ngô LC1 LVN99 bảng 3.15 với chuyển gen từ giống LC1, chuyển từ giống LVN99 bầu đất 20 Bảng 3.15 Kết tái sinh chuyển gen ZmDEF1 giống ngô LC1 LVN99 Số mô Lô thí nghiệm Số phôi biến nạp sẹo Số mô Số sẹo tái bầu chọn sinh đất Số kết hạt lọc Vụ đôngxuân (20152016) LC1 136 0 LVN99 147 0 LC1 158 22 LVN99 167 23 Vụ hè - thu ĐC0- LC1 30 0 (2016) ĐC0- LVN99 30 0 ĐC1- LC1 30 22 16 10 10 ĐC1- LVN99 30 20 13 10 10 (ĐC0- LC1: phôi ngô giống ngô LC1 không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC0- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1- LC1: phôi ngô giống LC1 không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC1- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh) 3.3.3 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 hệ ngô chuyển gen T0 3.3.3.1 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 hệ ngô chuyển gen T0 phản ứng PCR DNA tổng số từ ngô chuyển gen hai giống LC1 (5 cây) LVN99 (4 cây) sau tinh sạch, thực phản ứng PCR hình 3.18 Kết cho thấy, chuyển gen giống LC1 cho kết có băng DNA với kích thước khoảng 0,25 kb 0,35 kb tương ứng với kích thước ước tính cho gen ZmDEF1 nội gen ZmDEF1 ngoại lai Hiệu suất 21 chuyển gen giống LC1 đến giai đoạn đánh giá 5/158=3,16% Các chuyển gen giống LVN99 có dương tính Hiệu suất chuyển gen giống LVN99 đến giai đoạn xác định có mặt gen chuyển phản ứng PCR 3/167= 1,79% Hình 3.18 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 ngô chuyển gen (C1- C5: Các ngô chuyển gen giống LC1thế hệ T0; L1- L4: Các ngô chuyển gen giống LVN99 hệ T0; M: Thang chuẩn DNA 1kb; (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen ZmDEF1; (-): Sản phẩm PCR từ nước cất; WT: Sản phẩm PCR từ DNA ngô không chuyển gen) 3.3.3.2 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 hệ ngô chuyển gen T0 lai Southern Các ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 dương tính với phản ứng PCR tiến hành kiểm tra có mặt gen chuyển số copy genome phương pháp lai Southern, kết thể hình 3.19 Kết cho thấy, chuyển gen giống LC1 dương tính với lai Southern Hiệu suất chuyển gen giống đến thời điểm phân tích lai Southern 5/158=3,16% Giống LVN99 có dương tính với PCR (T0L1, T0-L3, T0-L4) lai Southern kết cho thấy chuyển gen dương tính với lai Southern, với có copy Hiệu suất chuyển gen giống LVN99 3/167= 1,79% 22 Hình 3.19 Kết lai Southern ngô chuyển gen ZmDEF1 (M: Marker 1kb, (+): Vector pBetaPhaso-ZmDEF1 mang gen nptII; (-): Cây ngô LVN99 không chuyển gen; C1- C5: Các ngô chuyển gen giống LC1 hệ T0; L1, L3, L4: Các ngô chuyển gen giống LVN99 hệ T0) 3.3.4 Phân tích biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 Cây ngô chuyển gen giống LC1 có kết hạt (T1-C1, T1-C3, T1C5) Giống LVN99 có kết hạt T1-L1 T1-L3 số không mang gen chuyển Hạt ngô chuyển gen tách protein để thức lai Western kiểm tra hoạt động gen chuyển mức độ dịch mã, hình 3.20 Hình 3.20 Kết lai Western ngô chuyển gen ZmDEF1 hệ T1 (M: Thang chuẩn protein 10-180 kDa Thermo Scientific; C1,C3,C5: Các ngô chuyển gen giống LC1ở hệ T1; L1, L3: Các ngô chuyển gen giống LVN99 hệ T1 ; (+): Protein chứa đuôi c myc kích thước khoảng 35 kDa; (-): Protein ngô LVN99 không chuyển gen) 23 Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã với giống LC1 3/158 = 1,89% giống LVN99 = 2/167 = 1,19% 3.3.4 Kiểm tra chức sinh học protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 Đánh giá khả ức chế hoạt động α-amylase ấu trùng mọt hạt ngô chuyển gen hệ T1 bảng 3.16 So với không chuyển gen giống LC1, protein rZmDEF1 T1-C1 có hiệu suất ức chế α-amylase ấu trùng mọt ngô 63,09%, T1-C3 56,45% T1-C5 với 58,79% Ở giống LVN99 protein rZmDEF1 T1-L1 với hiệu suất ức chế α-amylase ấu trùng mọt ngô 54,52%, T1-L3 đạt 55,20% Bảng 3.16 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt ngô chuyển gen T1 Mẫu Chỉ có Hỗn hợp gồm α -amylase mọt Hỗn hợp α -amylase α- protein giống ngô LC1 mọt protein giống amylases mọt Hoạt độ α-amylase LVN99 ĐC Cây chuyển gen T1-C1 T1-C3 T1-C5 ĐC Cây chuyển gen T1-L1 T1-L3 7,98  5,12 1,89  2,23  2,11  5,87  2,67 2,63 0,67 0,59 0,62 0,37 0,47 0,65 0,29 0,43 100 36,91 43,55 41,21 100 45,48 44,80 63,09 56,45 58,79 54,52 55,20 (ĐVHĐ/mg) Hiệu suất hoạt động α amylase (%) Hiệu suất ức chế hoạt động α - amylase rZmDEF1 (%) (ĐC: Cây không chuyển gen) 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Giống ngô địa phương SL có khả kháng mọt tốt nhất, số mẫn cảm mọt 1754,19; giống LVN99, LC1 có khả kháng mọt kém, số mẫn cảm với mọt 6088,71 3515,75 1.2 Gen ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu tách dòng thành công xác định trình tự nucleotide Gen ZmDEF1 có hai exon có kích thước 243 bp, mã hóa cho 80 amino acid intron chứa 102 bp 1.3 Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 thiết kế chuyển vào thuốc N tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens CV58 Protein rZmDEF1 biểu dòng chuyển gen (T1-1, T1-3, T1- 10, T1-17) có khả ức chế hoạt động α-amylase ấu trùng mọt ngô 1.4 Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được chuyển thành công tạo ngô chuyển gen hệ T1 từ giống ngô địa phương LC1 LVN99 với hiệu suất chuyển gen 1,89% 1,19% 1.5 Protein rZmDEF1 có kích thước gần 10 kDa biểu dòng từ giống LC1 (T1-C1, T1-C3, T1-C5) dòng từ giống LVN99 (T1-L1, T1L3) Protein rZmDEF1 biểu ức chế hoạt động α-amylase ấu trùng mọt ngô So với protein không chuyển gen, protein rZmDEF1 dòng chuyển gen có hiệu suất ức chế α-amylase cao từ 54,52% đến 63,09% Đề nghị Tiế p tu ̣c phân tích các ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 chuyể n gen qua các thế ̣ T2, T3, nhằm chọn, tạo dòng ổn định khả ức chế hoạt độ α-amylase mọt ngô, bồi dưỡng tạo giống ngô chuyển gen kháng mọt  ... Nghiên cứu đặc điểm biểu gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ ngô Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ số giống ngô có khả kháng mọt ngô khác Biểu protein ZmDEF1 tái... Đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu xác định giống ngô SL có khả kháng mọt ngô tốt hai giống LC1 LVN99 có khả kháng mọt ngô 2) Gen ZmDEF1 (DNA) phân lập từ giống ngô nghiên cứu có 345 bp,... (rZmDEF1) chuyển gen 3 Nội dung nghiên cứu (i) Đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu điều kiện lây nhiễm mọt ngô nhân tạo (ii) Phân tích đặc điểm gen ZmDEF1 giống ngô có khả kháng mọt ngô khác