Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ cây đậu tương (glycine max (l ) merill)” tt

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Lê ThỊ HỒng Trang NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI1A LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine ma Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2020 Cơng trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN – TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3:……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Vào hồi ……………………… năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Ngun CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Huu Quan Nguyen, Thi Hong Trang Le, Thi Ngoc Lan Nguyen, Thu Giang Nguyen, Danh Thuong Sy, Quang Tan Tu, Thi Thu Thuy Vu, Van Son Le, Hoang Mau Chu, Thi Kim Lien Vu (2020), “Overexpressing GmCHI1A increases the isoflavone content of transgenic soybean (Glycine max (L.) Merr.) seeds“, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, (SCIE, Q2) https://doi.org/10.1007/s11627-02010076-x Lê Thị Hồng Trang, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Hữu Quân (2019), “Chuyển gen Glycine max chalcone isomerase 1A vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Một mơ hình cho tăng cường biểu gen GmCHI1A đậu tương”, Tạp chí Khoa học&Công nghệ Đại học Thái Nguyên 207(14), tr 195-200 Lê Thị Hồng Trang, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2018), “Thiết kế vector chuyển gen mang gen GmCHI phân lập từ đậu tương”, Proceedings Hội nghị CNSH toàn quốc 2018, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ tr 83-87 Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đặc điểm gen GmCHI phân lập từ giống đậu tương khác hàm lượng isoflavone”, TAP CHI SINH HOC 38(2), tr 236-242 Các trình tự gen đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Le,T.H.T., Ho,T.M., Hoang,H.P., Le,S.V and Chu,M.H.(2016), “Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase(CHI) gene), cultivar DT26”, GenBank: LT594994.1 Le,T.H.T., Ho,T.M., Hoang,H.P., Le,S.V and Chu,M.H.(2016), “Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar DT51”, GenBank: LT594995.1 Le,T.H.T., Ho,T.M., Hoang,H.P., Le,S.V and Chu,M.H.(2016), “Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar DT84”, GenBank: LT594993.1 Le,T.H.T., Ho,T.M., Hoang,H.P., Le,S.V and Chu,M.H.(2016), “Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase (CHI) gene), cultivar DT2008”, GenBank: LT594996.1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Flavonoid sản phẩm tự nhiên quan trọng có vai trò bảo vệ thực vật sức khỏe người Isoflavone thuộc nhóm flavonoid chứa nhiều hạt đậu tương, biểu đặc tính chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn chống viêm Isoflavone hạt đậu tương dễ sử dụng cho người, số hợp chất có thành phần tương tự isoflavone cỏ ba lá, cỏ linh lăng, dong, … lại khó sử dụng Isoflavone tổng hợp từ nhánh đường phenylpropanoid Q trình chuyển hóa tổng hợp isoflavone có nhiều enzyme tham gia, CHI enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng từ phân tử naringenin chalcone mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin Naringenin chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid như: flavanone, flavonol anthocyanin CHI phân thành hai loại CHI loại I CHI loại II Các CHI loại I tìm thấy hầu hết loại thực vật, CHI loại II có họ đậu Gen GmCHI1A đậu tương thuộc CHI loại II nằm nhiễm sắc thể số 20, mã hóa enzyme CHI1A Các kết nghiên cứu biểu gen CHI khẳng định biểu mạnh gen CHI làm tăng hàm lượng isoflavonoid tổng số chuyển gen nhiều lần so với không chuyển gen Như việc tác động đến enzyme CHI làm tăng tích lũy isoflavone flavonoids khác Đến có nghiên cứu Lyle Ralston et al (2005) biểu gen GmCHI nấm men Vu cs (2018) phân tích biểu gen GmCHI1A Talinum paniculatum, mà chưa tìm thấy nghiên cứu đề cập đến kết phân tích biểu gen GmCHI1A đậu tương theo hướng tiếp cận tạo dòng chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng có vị trí quan trọng sản xuất nơng nghiệp nhiều quốc gia giới Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao Ngồi ra, đậu tương loại trồng có giá trị kinh tế cải tạo đất Đáng ý hạt đậu tương chứa isoflavone, đặc biệt dạng aglucone hệ tiêu hóa người hấp thu nhanh, hàm lượng lại thấp Đây lý thu hút quan tâm nghiên cứu việc cải thiện hàm lượng isoflavone hạt đậu tương Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ đậu tương (Glycine max (L.) Merill)” nhằm làm sáng tỏ mối liên hệ việc tăng cường biểu gen GmCHI1A với tăng hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương chuyển gen Mục tiêu nghiên cứu Biểu gen GmCHI1A đậu tương chuyển gen tạo dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A có hàm lượng isoflavone cao đối chứng khơng chuyển gen Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu đặc điểm gen GmCHI1A đậu tương i) Khảo sát hàm lượng isoflavone số giống đậu tương trồng phổ biến miền Bắc Việt Nam ii) Nghiên cứu thông tin gen GmCHI đậu tương, thiết kế cặp mồi PCR nhân đoạn mã hóa gen GmCHI1A từ giống đậu tương có hàm lượng isoflavone cao iii) Tách dòng, giải trình tự nucleotide phân tích đặc điểm gen GmCHI1A phân lập từ đậu tương 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmCHI1A đánh giá hoạt động vector chuyển gen thiết kế 3.3 Phân tích biểu gen GmCHI1A đậu tương chuyển gen i) Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A vào giống đậu tương DT2008 ii) Phân tích hợp gen chuyển GmCHI1A vào hệ gen đậu tương PCR Southern blot iii) Phân tích biểu protein tái tổ hợp GmCHI1A đậu tương chuyển gen Western blot ELISA iv) Đánh giá thay đổi hàm lượng isoflavone chuyển gen GmCHI1A so với đối chứng không chuyển gen Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu Việt Nam giới chứng minh biểu mạnh gen GmCHI1A làm tăng hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương chuyển gen Luận án cơng trình có hệ thống với nội dung trình bày từ phân lập gen đến thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu gen tạo dòng chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao Cụ thể là: 1) Gen GmCHI1A phân lập từ đậu tương Việt Nam có kích thước vùng mã hóa 657 nucleotide, mã hóa 218 amino acid, thuộc phân họ II nằm nhiễm sắc thể số 20 đậu tương 2) Lần gen GmCHI1A phân tích biểu biểu mạnh gen chuyển GmCHI1A làm tăng hàm lượng enzyme CHI đậu tương 3) Tạo dòng đậu tương chuyển gen hệ T2 có hàm lượng daidzein tăng từ 166,46% đến 187,23% genistein tăng từ 329,80%463,93% so với không chuyển gen Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Về mặt khoa học, kết luận án chứng minh tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa đường sinh tổng hợp isoflavone đậu tương làm tăng hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương Kết nghiên cứu sở khoa học để cải thiện hàm lượng hợp chất thứ cấp trồng kỹ thuật biểu gen Kết đăng tải báo khoa học trình tự gen đăng ký GenBank tài liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu giảng dạy Về mặt thực tiễn, dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương có hàm lượng isoflavone cao Kết nghiên cứu luận án áp dụng vào giống họ đậu loài thực vật khác định hướng nâng cao hàm lượng isoflavone mầm hạt nhằm nghiên cứu thực phẩm chức phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng Cấu trúc luận án Luận án có 139 trang (kể phụ lục), chia thành chương, phần: Mở đầu (5 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (36 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết thảo luận (43 trang); Kết luận đề nghị (2 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (2 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (6 trang) Luận án có 14 bảng, 36 hình, phụ lục tham khảo 126 tài liệu số trang web Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 126 tài liệu số trang web, có 17 tài liệu tiếng Việt, 109 tài liệu tiếng Anh ba vấn đề bản, là: (1) Cây đậu tương isoflavone hạt đậu tương; (2) Enzyme CHI gen mã hoá CHI; (3) Chuyển gen đậu tương phân tích biểu gen CHI Hạt Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) chứa protein lipid với hàm lượng cao, chứa nhiều amino acid khơng thay thế, muối khống Ca, Fe, Mg, P, K, Na vitamin (B1, B2, C, E, K ) cần thiết cho thể người động vật Đáng ý hạt đậu tương chứa isoflavone Isoflavone chất chuyển hóa thứ cấp, có chức sinh học đa dạng Isoflavone hợp chất tương tự isoflavone tìm thấy đậu tương số loại thực vật, cỏ ba lá, cỏ linh lăng, dong, …Isoflavone hạt đậu tương dễ sử dụng cho người, isoflavone có nguồn gốc từ lồi thực vật khác khó sử dụng Isoflavone đậu tương có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim mạch, cải thiện sức khỏe phụ nữ tác động tích cực đến q trình sinh lý khác Hàm lượng isoflavone đậu tương thấp, hướng nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone đậu tương, đặc biệt mầm hạt vấn đề quan tâm nghiên cứu Hàm lượng isoflavone hạt tương đối thấp, khoảng từ 50 – 3000 µg/g tồn hai dạng β-glucoside (daidzin, genistin, glycitin) aglucone (daidzein, genistein, glycitein) Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn cho hấp thụ hạn chế hệ tiêu hóa người, đó, dạng aglucone hấp thụ nhanh hơn, hàm lượng lại thấp Isoflavone tổng hợp từ đường phenylpropanoid có tất lồi thực vật chalcone isomerase (CHI) enzym quan trọng xúc tác cho phản ứng từ phân tử naringenin chalcone isoliquiritigenin mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin liquiritigenin, hai tiền chất nhiều hợp chất flavonoid isoflavonoid Enzyme CHI đậu tương phân thành loại dựa sở tương đồng chất đặc hiệu, CHI1, CHI2, CHI3, CHI4 Các CHI loại I tìm thấy hầu hết loại thực vật, CHI loại II có họ đậu CHI gồm khoảng 220 amino acid, gồm chuỗi xoắn α phiến gấp β Vị trí hoạt động enzyme CHI phần lớn amino acid không phân cực từ phiến gấp β3a, phiến gấp β3b, chuỗi xoắn α4 chuỗi xoắn α6 Làm rõ vị trí then chốt enzyme chalcone isomerase đường phenylpropanoid cấu trúc vị trí hoạt động có vai trò quan trọng việc cải thiện hàm lượng flavonoid isoflavonoid thực vật Bước đầu xác định 12 gen CHI hệ gen đậu tương xếp phân họ gen Gen CHI1A đậu tương xếp vào CHI loại II Gen CHI1A đậu tương có bốn exon ba intron, đoạn mã hóa có kích thước 657 bp mã hóa cho 218 axit amin Gen CHI mã hóa chalcone isomerase enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở isoliquiritigenin mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin liquiritigenin – hai tiền chất nhiều hợp chất flavonoid isoflavonoid Cách tiếp cận tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa đường tổng 10 hợp phenylpropanoid kỹ thuật ứng dụng để làm tăng hàm lượng isoflavone nhiều loài thực vật khác Các nghiên cứu chuyển gen nhờ A.tumefaciens đậu tương sử dụng mầm hạt chín vật liệu nhận gen Khả tiếp nhận gen đậu tương cách gây tổn thương nách mầm lây nhiễm A.tumefaciens tái tổ hợp nghiên cứu khẳng định hiệu cao phương pháp biến nạp khác Nhiều tác giả ứng dụng kỹ thuật theo hướng cải thiện hàm lượng chất thứ cấp, nâng cao khả chịu hạn, tăng cường tính kháng sâu, kháng virus, …Các nghiên cứu chuyển gen CHI từ loài sang loài khác cho kết chuyển gen có tích lũy flavonoid tăng tăng không chuyển gen nhiều lần Nghiên cứu biểu tăng cường gen CHI lồi đề cập Gen GmCHI1A đậu tương phân tích biểu nấm men, Sâm đất, nhiên, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen với gen GmCHI1A để cải thiện hàm lượng CHI1A tái tổ hợp định hướng nâng cao hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương chưa nghiên cứu Hướng nghiên cứu biểu mạnh gen GmCHI1A (overexpression of GmCHI1A gene) đậu tương nhằm tạo nguyên liệu phục vụ chọn giống đậu tương có tích lũy isoflavone cao, tạo ngun liệu phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học đáp ứng nhu cầu ngày tăng cơng tác chăm sóc bảo vệ sức khỏe người nước ta Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Các giống đậu tương sử dụng nghiên cứu: Năm giống đậu tương ĐT51, ĐT26, DT90, DT84, DT2008 sử dụng thí nghiệm luận án Hai giống ĐT51 ĐT26 Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp; ba giống DT90, DT84, DT2008 Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp Các vector chủng vi khuẩn: Các vector sử dụng nghiên cứu bao gồm: vector tách dòng pBT, vector pRTRA7/3 chứa promoter 35S cmyc, vector chuyển gen pCB301 Chủng vi khuẩn E.coli DH5α sử dụng 15 Các thí nghiệm thực từ tháng 8/2015 đến tháng 11/2018 Thí nghiệm phân tích hàm lượng isoflavone mầm đậu tương thực Phòng Công nghệ Thực phẩm - Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia Hà Nội, Bộ Y tế Các thí nghiệm khuếch đại gen, tách dòng phân tử, chuyển gen, phân tích chuyển gen thực Phòng thí nghiệm Di truyền học, Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen, phân tích Southern blot, Western blot, ELISA tiến hành Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phòng Cơng nghệ Tế bào thực vật Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GENGmCHI1A PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG 3.1.1 Hàm lượng daidzein genistein mầm hạt số giống đậu tương trồng phổ biến miền Bắc Việt Nam Tiến hành khảo sát hàm lượng isoflavone (daidzein genistein) giống đậu tương (ĐT26; ĐT51; DT2008; DT84; DT90) phương pháp sắc ký HPLC, kết cho thấy, giống đậu tương ĐT26, hạt đậu tương nảy mầm ngày tuổi có hàm lượng daidzein genistein cao (64,27 mg/100 g), giống DT2008 có hàm lượng thấp (26,17 mg/100 g) Hàm lượng daidzein genistein có khác biệt giống đậu tương mức ý nghĩa α = 0,001 Có thể xếp theo thứ tự giảm dần hàm lượng isoflavone (daidzein+genistein) giống đậu tương nghiên cứu: ĐT26 > ĐT51 > DT90 > DT84 > DT2008 3.1.2 Tách dòng xác định trình tự nucleotide gen GmCHI1A từ đậu tương Kết nhân kiểm tra sản phẩm tách dòng gen GmCHI1A PCR với cặp mồi đặc hiệu thể hình 3.3 hình 3.4 16 Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen GmCHI1A bốn giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT2008, DT84 tiến hành giải trình tự nucleotide, kết thu đoạn DNA có kích thước 657 nucleotide dự kiến thiết kế cặp mồi Phân tích trực tuyến chương trình BLAST NCBI kết cho thấy trình tự gen GmCHI1A phân lập có hệ số tương đồng với trình tự NM_001248290 GenBank sử dụng thiết kế cặp mồi PCR 98,93% (ĐT51); 98,93% (DT84); 98,78% (DT2008), 97,87% (ĐT26) Hình 3.3 A Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmCHI1A (M: thang DNA 1kb; 1, 2: ĐT26; 3, 4: ĐT51; 5, 6: DT84; 7,8 DT90; 9, 10:DT2008); Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18F/pUC18R M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: dòng khuẩn lạc có kiểu hình trắng kiểm tra colony-PCR Như vậy, kết phân tích BLAST cho thấy đoạn DNA phân lập từ mRNA bốn giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT2008, DT84 đoạn mã hóa gen GmCHI1A đậu tương Gen GmCHI1A (cDNA) gống đậu tương nghiên cứu có 657 nucleotide, mã hóa 218 amino acid Các trình gen GmCHI1A công bố GenBank mang mã số LT594994.1, LT594995.1, LT594993.1, LT594996.1 3.1.3 Sự đa dạng trình tự nucleotide trình tự amino acid gen GmCHI1A Bốn trình tự gen GmCHI GenBank mang mã số AF276302, DQ191401, DQ835284 NM_001248290 với trình tự phân lập từ giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT84 DT2008 lựa chọn để phân tích đa dạng dựa trình tự nucleotide trình tự amino acid Sơ 17 đồ hình hình 3.8 3.9 thiết lập dựa trình tự nucleotide theo phương pháp UPGMA phần mềm MEGA7 Kết phân tích hình 3.8 cho thấy, dựa trình tự nucleotide gen GmCHI1A, giống đậu tương phân bố hai nhánh, giống đậu tương ĐT26 phân bố nhánh giống lại phân bố nhánh thứ hai, với khoảng cách di truyền 1,2% Ở hình 3.9, sơ đồ hình thiết lập theo phương pháp UPGMA dựa trình tự amino acid suy diễn gen GmCHI1A cho thấy giống đậu tương phân bố hai nhánh chính, nhánh thứ có giống ĐT26 nhánh thứ hai gồm giống lại, khoảng cách di truyền xác định 3,0 % Hình 3.8 Sơ đồ hình mối quan hệ giống đậu tương dựa trình tự nucleotide gen GmCHI1A thiết lập theo phương pháp UPGMA Hình 3.9 Sơ đồ hình mối quan hệ giống đậu tương dựa trình tự amino acid suy diễn gen GmCHI1A thiết lập theo phương pháp UPGMA 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN GmCHI1A Để chuyển gen GmCHI1A vào thực vật kiểm tra biểu sản phẩm protein gen, vector biểu gen thực vật pCB301 mang promoter CaMV35S thiết kế để điều khiển biểu gen GmCHI1A thực vật 3.2.1 Tạo cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A Vector pRTRA7/3 chứa promoter CaMV35S khởi động phiên mã, trình tự nucleotide xác định chuỗi peptide c-myc trình tự nucleotide xác 18 định đoạn KDEL Mở vòng vector pRTRA7/3 cặp enzyme NotI/NcoI tạo phân đoạn DNA có kích thước 0,9 kb 3,3 kb, đoạn DNA có kích thước 3,3 kb đoạn DNA mang trình tự 35S_cmyc_KDEL Gen GmCHI1A từ vector tách dòng pBT_GmCHI1A cắt cặp enzyme NotI NcoI tạo phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,67 kb 2,7kb Trong đó, phân đoạn DNA 0,66 kb đoạn gen đích GmCHI1A cần thu nhận (Hình 3.10) Tinh đoạn gen GmCHI1A gắn vào vector pRTRA7/3 nhờ phản ứng ligation xúc tác enzyme T4 ligase tạo cấu trúc vector tái tổ hợp pRTRA7/3_GmCHI1A mang cấu trúc CaMV35S_GmCHI1A-cmyc-polyA Nhân dòng E.coli DH5α kiểm tra colony-PCR (Hình 3.11) Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt mở vòng pRTRA7/3 cắt pBT-GmCHI1A cặp enzyme NcoI/NotI M: Thang DNA kb; 1: Vector pRTRA7/3 không cắt enzyme NotI NcoI; 2: Sản phẩm cắt vector pRTRA7/3 enzyme NcoI NotI; 3: vector tái tổ hợp pBT-GmCHI1A không cắt enzyme NotI NcoI; 4: Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pBT-GmCHI1A enzyme NcoI NotI Hình 3.11 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen GmCHI1A từ dòng khuẩn lạc M: Thang DNA kb; (-): Colony-PCR từ khuẩn lạc E.coli không biến nạp pRTRA7/3_GmCHI1A; (+): PCR nhân gen GmCHI1A từ vector pBT_GmCHI1A; 1-3: Colony-PCR từ dòng khuẩn lạc biến nạp pRTRA7/3_GmCHI1A 3.2.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A Thực phản ứng cắt vector pRTRA7/3_GmCHI1A HindIII thu nhận cấu trúc 35S_GmCHI1A_cmyc_KDEL_polyA (1,5 kb) 19 đoạn DNA có kích thước 2,4 kb (Hình 3.12) Mở vòng vector chuyển gen pCB301 HindIII nhận hai phân đoạn DNA 5,502 kb (Hình 3.13) Gắn cấu trúc 35S_GmCHI1A_cmyc_KDEL vào vector pCB301 tạo vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A (Hình 3.14) Biến nạp pCB301_GmCHI1A nhân dòng E.coli DH5α chọn dòng khuẩn lạc colony-PCR Plasmid pCB301_GmCHI1A tách chiết từ dòng dương tính với PCR Hình 3.12 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pRTRA7/3_GmCHI1A HindIII M: thang DNA 1kb; Làn điện di số 1: plasmid pRTRA7/3_GmCHI1A cắt HindIII; Làn điện di số 2: plasmid pRTRA7/3_GmCHI1A khơng cắt; Hình 3.13 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 M: thang DNA 1kb; Làn điện di số 1:plasmid không cắt HindIII; Làn điện di số 2: Sản phẩm DNA đích mở vòng từ vector pCB301 Hình 3.14 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A nptII: gen kháng kanamycin; CaMV35S: promoter 35S; GmCHI1A: gen Glycine max chalcone isomerase 1A (GmCHI1A) phân lập từ đậu tương; cmyc: trình tự nucleotide mã hóa peptid c-myc; KDEL: trình tự nucleotde mã hóa peptide KDEL 3.2.3 Tạo A tumefaciens pCB301_GmCHI1A CV58 chứa vector chuyển gen 20 Plassmid pCB301_GmCHI1A tách chiết từ dòng vi khuẩn E.coli dương tính với colony-PCR tinh sạch, sau biến nạp vào A.tumefaciens CV58 Nuôi 48 nhiệt độ 28 oC khuẩn lạc xuất mặt thạch tiến hành kiểm tra colony-PCR cặp mồi đặc hiệu CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R để chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen GmCHI1A (Hình 3.16) Hình 3.16 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR cặp mồi đặc hiệu CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R từ dòng khuẩn lạc A.tumefaciens CV58 M: thang DNA 1kb; (-): Đối chứng âm-dòng A.tumefaciens khơng biến nạp pCB301_GmCHI1A; 1-9: chín dòng khuẩn lạc A.tumefaciens CV58 chứa vector pCB301_GmCHI1A 3.2.4 Phân tích hoạt động vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A thuốc Tiến hành biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A thông qua lây nhiễm A.tumefaciens vào mơ thuốc (Hình 3.17) Kết thí nghiệm biến nạp lặp lại lần trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 cho thấy, sau ba lần biến nạp lơ thí nghiệm thu 83 mẫu tạo cụm chồi qua chọn lọc kháng sinh có 206 chồi sống sót Ở mơi trường tạo rễ có 163 chồi rễ chọn lọc 98 để chuyển trồng trông bầu đất Kết cuối tạo 30 sống sót điều kiện nhà lưới Hình 3.17 Hình ảnh biến nạp tái sinh thuốc chuyển gen GmCHI1A A: mảnh thuốc dịch khuẩn lây nhiễm; B: Đồng nuôi cấy môi trường CCM; C: Tái sinh đa chồi môi trường chọn lọc chứa kanamicin; D: Kéo dài chồi; E: Ra rễ môi trường RM; F: Cây thuốc chuyển gen trồng giá thể 21 Thu non 30 thuốc chuyển gen, tách chiết DNA tổng số thực phân tích có mặt gen chuyển GmCHI1A PCR với cặp mồi CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R, kết cho thấy band DNA có kích thước khoảng 0,67 kb xuất 22 điện di, số 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29 số 1, 2, 3, 10, 14, 15, 26, 30 band DNA Chọn ngẫu nhiên thuốc T0 dương tính với phản ứng PCR, sinh trưởng phát triển bình thường để phân tích Southern blot kết xuất 5/7 thuốc chuyển gen T0 T01, T02, T04, T05, T06 xuất băng DNA Như gen chuyển GmCHI1A hợp vào hệ gen thuốc chuyển gen RNA tổng số tách chiết từ non thuốc chuyển gen (T01, T02, T04, T05, T06) dương tính với lai Southern, sinh trưởng, phát triển bình thường hệ T0 sử dụng tạo cDNA thực phản ứng PCR với cặp mồi CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R Kết nhân gen chuyển GmCHI1A (cDNA) từ mRNA thuốc chuyển gen cho thấy điện di có băng DNA với kích thước khoảng 0,67 kb (Hình 3.19A) Kết minh chứng gen chuyển GmCHI1A biểu phiên mã tổng hợp mRNA A B Hình 3.19 A- Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen GmCHI1A (cDNA) từ mRNA thuốc chuyển gen hệ T0 M: thang DNA 1kb; (+): Plasmid pBT_GmCHI1A (đối chứng dương); (-) Cây không chuyển gen (WT-đối chứng âm); 1-5: Các thuốc chuyển gen T0 B- Kết phân tích Western blot thuốc chuyển gen hệ T0 (+): 22 Protein HA gắn c-myc; WT: Protein thu từ không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, mẫu protein thu thuốc chuyển gen dương tính với lai southern blot Tuy nhiên, hình 3.19B, kết phân tích Western blot thu 4/5 T0 xuất băng protein ứng với kích thước khoảng 25,67 kDa Như gen chuyển GmCHI1A dich mã tổng hợp protein tái tổ hợp rCHI1A thuốc T0 (T01, T04, T05, T06) Các kết phân tích thuốc rút nhận xét vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A hoạt động tốt thuốc chuyển gen sử dụng để chuyển vào đậu tương trồng khác 3.3 PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN GmCHI1A TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 3.3.1 Biến nạp cấu trúc pCB301_GmCHI1A vào đậu tương thông qua A.tumefaciens Thí nghiệm chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI1A vào giống đậu tương DT2008 qua lần biến nạp với 390 mảnh mầm (Hình 3.20) Trong số 390 mẫu biến nạp tạo 26 chuyển gen mang trồng trên giá thể 3.3.2 Phân tích diện hợp gen chuyển GmCHI1A đậu tương chuyển gen T0 Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra có mặt gen chuyển GmCHI1A 26 đậu tương chuyển gen hệ T0 Từ DNA tổng số tách từ non đậu tương chuyển gen T0 đối chứng không chuyển gen sử dụng cho PCR với cặp mồi CHI-NcoI-F/ CHI-SacI-R Kết điện di sản phầm PCR nhân gen chuyển GmCHI1A cho thấy gel điện di có chạy xuất band DNA, số 1, 3, 4, 5, 21, 22, 24 25 với kích thước khoảng 0,72 kb tương ứng với kích thước gen chuyển GmCHI1A Các đậu tương chuyển gen dương tính với PCR hệ T0 giống DT2008 ký hiệu T0-1; T0-3; T0-4; T0-5; T0-21; T0-22; T0-24; T0-25 Ở điện di phân tích sản phẩm PCR từ DNA đối chứng không chuyển gen không thấy xuất band DNA 23 Các đậu tương cho kết dương tính với PCR kiểm tra hợp gen chuyển GmCHI1A vào hệ gen chuyển gen Southern blot DNA tổng số tách chiết từ đậu tương chuyển gen đối chứng không chuyển gen, tinh xử lý enzyme giới hạn SacI để thu đoạn nptII_CaMV35S_GmCHI1A_cmyc chứa gen nptII gen GmCHI1A Kết phân tích Southern blot thể hình 3.23 cho thấy T0 T0-1, T0-3, T0-4, T0-21, T0-22, T0-24, T0-25 xuất band DNA, T0-5 WT không cho kết lai Southern Hiệu suất chuyển gen đến thời điểm phân tích Southern blot 7/390= 1,79 % Sau màng, màng lai band DNA tương ứng với copy Mẫu WT biểu âm tính, chứng tỏ phản ứng lai đặc hiệu, mẫu dò khơng liên kết với gen nội sinh Hình 3.20 Kết tạo đậu tương chuyển gen GmCHI1A từ giống DT2008 kỹ thuật lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp qua nách mầm hạt chín A: Hạt đậu tương DT2008 sau khử trùng khí clo; B: Lá mầm gây tổn thương thu từ hạt nảy mầm môi trường GM tạo nguyên liệu biến nạp; C: Lá mầm tổn thương nách ngâm dịch khuẩn lây nhiễm 30 phút; D: Đồng nuôi cấy CCM điều kiện tối ngày; E: Cảm ứng tạo đa chồi SIM, bổ sung BAP mg L -1 + kanamycin 50 mg L-1; F: Cắt bỏ mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM tuần, bổ sung GA 0,5 mg L-1 + IAA 0,1 mg L-1 + kanamycin 50 mg L-1); G: Ra rễ môi trường RM, bổ sung IBA 0,1 mg L-1 20 ngày; H: Cây chuyển gen trồng giá thể có ty lệ trấu hun : cát vàng Hình 3.23 Kết phân tích Southern blot đậu tương chuyển gen GmCHI1A với đoạn dò nptII đánh dấu biotin (+): vector pCB301- 24 GmCHI1A; 1-8: dòng đậu tương chuyển gen dương tính với PCR (1: T01; 2: T0-3; 3: T0-4; 4: T0-5; 5: T0-21; 6: T0-22; 7: T0-24; 8: T0-25); WT: đậu tương không chuyển gen Kết phân tích Southern blot cho thấy, gen chuyển GmCHI1A hợp vào hệ gen đậu tương Các dòng chuyển gen T0-1, T0-3, T0-4, T0-21, T0-22, T0-24, T0-25 cho kết lai Southern tiếp tục đánh giá sinh trưởng phát triển, thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích dòng chuyển gen hệ gen T1 3.3.3 Phân tích biểu protein CHI1A tái tổ hợp Western blot ELISA Hạt chuyển gen T0 (T0-1, T0-3, T0-4, T0-21, T0-22, T0-24, T0-25) gieo trồng lơ thí nghiệm ứng với dòng chuyển gen T1, ký hiệu T1-1, T1-3, T1-4, T1-21, T1-22, T1-24, T1-25 Đồng thời dòng đậu tương chuyển gen T1được sử dụng phân tích biểu protein CHI1A tái tổ hợp (ký hiệu rCHI1A) Western blot ELISA Kết phân tích Western blot protein dòng đậu tương chuyển gen đối chứng không chuyển gen cho thấy, dòng đậu tương chuyển gen GmCHI1A hệ T1 có dòng cho kết Western blot (Hình 3.24) Như vậy, thời điểm phân tích biểu protein tái tổ hợp rCHI1A hiệu suất chuyển gen đạt đến thời điểm phân tích Southern blot 4/390= 1,03 % Hình 3.24 Kết phân tích Western blot protein từ đậu tương chuyển gen hệ T1 không chuyển gen M: thang protein chuẩn; (+) đối chứng dương protein HA gắn cmyc; (-) Đối chứng âm mẫu protein thu từ không chuyển gen; 17 (T1-1, T1-3, T1-4, T1-21, T1-22, T1-24, T1-25): protein thu đậu tương Hình 3.25 Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp rCHI1A dòng đậu tương chuyển gen T1-1, T1-4, T1-21, T1-24 đối chứng không chuyển gen (WT) 25 chuyển gen dương tính với lai Southern blot Hình 3.25 cho thấy, hàm lượng protein tái tổ hợp rCHI1A dòng đậu tương chuyển gen T1-1, T1-4, T1-21 T1-24 dao động từ 2,37-3,59 µg/mg Dòng T1-1 có hàm lượng protein tái tổ hợp rCHI1A cao (3,59 µg/g), tiếp đến dòng T1-4 (3,51 µg/g) dòng T1-21(2,68 µg/g) thấp dòng T1-24 (2,37 µg/g) (Hình 3.25) Như nhận xét gen chuyển GmCHI1A di truyển qua sinh sản hữu tính từ hệ T0 sang T1 hoạt động phiên mã dịch mã tổng hợp protein đậu tương chuyển gen hệ T1 3.3.4 Phân tích hàm lượng daidzein genistein dòng đậu tương chuyển gen Mầm hạt dòng chuyển gen hệ T2 (T2-1, T2-4, T2-21, T2-24) sử dụng phân tích hàm lượng daidzein genistein (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Sự thay đổi hàm lượng daidzein genistein giai đoạn hạt nảy mầm dòng đậu tương chuyển gen so với khơng chuyển gen Cây WT dòng chuyển gen Daidzein (µg/g khối lượng khơ) Tăng so với WT (%) Genistein (µg/g khối lượng khơ) WT a 253,05 ± 3,60 100,00 113,11A ±1,78 100,00 366,16 187,23 524,64D ±4,27 463,93 998,43 180,62 467,66C±17,97 413,46 870,53 177,01 499,72CD±15,95 441,80 947,64 166,46 B 373,00 ± 9,82 329,77 750,99 T2-1 T2-4 T2-21 T2-24 Hàm lượng daidzein genistein 473,79c ± 9,63 bc 457,07 ±18,1 bc 447,92 ±14,8 b 421,22 ± 8,91 Tăng so Tổng daidzein với WT genistein (%) (µg/g khối lượng khơ) Kết phân tích cho thấy, so với đậu tương không chuyển gen (WT), hàm lượng daidzein genistein mầm hạt dòng đậu tương chuyển gen T2-1, T2-4, T2-21, T2-24 cao hàm lượng daidzein dòng chuyển gen tăng từ 139,17 % đến 186,86 %; hàm lượng genistein tăng từ 329,80 % đến 463,93 % Sự khác biệt hàm lượng 26 isoflavone dòng chuyển gen WR phân tích theo kiểm định Duncan với p < 0,05 3.4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ở thực vật bậc cao, CHI enzyme quan trọng xúc tác cho phản ứng đường phenylpropanoid để tạo sản phẩm isoflavonoid, flavonoid, anthocyanin (Oliver et al., 2005) Gen GmCHI1A đậu tương mã hóa protein enzyme CHI1A chúng tơi phân lập từ giống đậu tương Việt Nam đăng ký GenBank, với mã số LT594994.1, LT594995.1, LT594993.1, LT594996.1 Đoạn mã hóa gen GmCHI1A có 657 nucleotide, mã hóa cho 218 amino acid phân lập từ bốn giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT84, DT2008 phù hợp với công bố Ralston cs (2005), Chiu cs (2001), Chung Nam (2007), Dastmalchi and Dhaubhadel (2019) Theo hướng nghiên cứu biểu gen CHI loài loài khác ghi nhận kết biểu SmCHI từ loài S medusa, hoa mẫu đơn thuốc lá; biểu gen CHI Dạ yến thảo cà chua, kết tạo chuyển gen có hàm lượng flavonoid tăng lên nhiều lần so với không chuyển gen Ralston et al (2005) phân tích biểu GmCHI type I type II nấm men (Saccharomyces cerevisiae) có nhận xét enzyme CHI loại II tồn với isoflavone synthase chất chalcone khác thêm vào môi trường nuôi cấy chuyển đổi thành isoflavanone isoflavone Trong nghiên cứu Vũ Thị Như Trang cs phân tích biểu gen GmCHI type II đậu tương Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) kết nhận dòng chuyển gen có hàm lượng flavonoid tổng số tăng lên từ 4,8 -7,4 lần so với không chuyển gen (Vu et al., 2018) Nhiều loại dược liệu quý không tồn enzyme CHI type II, không tồn nhánh tổng hợp isoflavone đường phenylpropanoid, kết nghiên cứu sở cho việc bổ sung enzyme CHI type II từ họ đậu vào dược liệu kỹ thuật chuyển gen để thu nhận isoflavone Theo hướng tiếp cận tăng thu nhận isoflavone mầm hạt đậu tương, nghiên cứu biểu thành công gen 27 GmCHI1A đậu tương với điều khiển promoter CAMV35S Các dòng đậu tương chuyển gen hệ T1 (T1-1, T1-4, T1-21 T1-24) có hàm lượng protein tái tổ hợp rCHI1A từ 2,37-3,59 µg/mg Kết tạo bốn dòng chuyển gen T2 (T2-1, T2-4, T2-21, T2-24) mầm đậu tương T2 phân tích hàm lượng daidzein genistein Kết phân tích HPLC cho thấy, Sự biểu mạnh gen GmCHI1A làm tăng hàm lượng enzyme GmCHI1A mầm dòng đậu tương chuyển gen T2 có hàm lượng daidzein tăng từ 166,46% đến 187,23%, genistein tăng từ 329,80%-463,93% so với khơng chuyển gen Đáng ý dòng chuyển gen có hàm lượng genistein cao tăng so với đối chứng không chuyển gen từ 3,3- 4,64 lần Như nói, biểu mạnh gen GmCHI1A đậu tương làm tăng hoạt độ enzyme CHI tăng tích lũy liquiritigenin naringenin Cùng với tham gia enzyme IFS làm tăng hàm lượng isoflavone flavonoids khác chuyển gen Trong nghiên cứu chúng tôi, dấu hiệu đáng ý mầm dòng chuyển gen có hàm lượng genistein tăng so với mầm không chuyển gen cao hàm lượng daidzein Isoflavone sản phẩm tự nhiên quan trọng sử dụng chăm sóc bảo vệ sức khỏe người (Jiang et al., 2015) Genistein có đậu tương dược chất quý có khả chống oxy hóa, sản sinh lượng collagen đáng kể phòng ngừa ung thư vú phụ nữ, ung thư tuyến tiền liệt nam giới số bệnh ung thư khác ung thư kết tràng, ung thư phổi, ung thư da ung thư máu (Perabo et al., 2008) Vì vậy, việc tạo dòng đậu tương có hàm lượng genistein cao có ý nghĩa thực tiễn cơng tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng Lần gen GmCHI1A biến nạp biểu thành công đậu tương Sự biểu mạnh gen GmCHI1A làm tăng hàm lượng enzyme CHI1A mầm dòng đậu tương chuyển gen T2 có hàm lượng daidzein genistein tăng cao đối chứng không chuyển gen KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Hàm lượng daidzein, genistein mầm hạt năm giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT90, DT84 DT2008 khảo sát Trong đó, giống đậu tương ĐT26 có hàm lượng daidzein, genistein cao (64,27 28 mg/100g mầm), hàm lượng thấp giống DT2008 Vùng mã hóa gen GmCHI1A phân lập từ mRNA đậu tương có kích thước 657 nucleotide, mã hóa 218 amino acid 1.2 Vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A chứa gen GmCHI1A promoter CaMV35S thiết kế biến nạp thành công vào thuốc Gen chuyển GmCHI1A xác nhận hợp vào hệ gen thuốc thơng qua phân tích Southern blot, biểu tạo protein tái tổ hợp rGmCHI1A thuốc chuyển gen 1.3 Gen chuyển GmCHI1A biến nạp thành công vào giống đậu tương DT2008 kỹ thuật lây nhiễm A.tumefaciens tái tổ hợp qua nách mầm, tạo 26 đậu tương chuyển gen T0 Trong số đó, gen chuyển hợp vào hệ gen đậu tương DT2008 đậu tương chuyển gen T1 nhận từ T0 biểu sản phẩm protein tái tổ hợp, hiệu suất chuyển gen đạt 1,03% Sự biểu gen chuyển GmCHI1A làm tăng hàm lượng enzyme CHI1A mầm làm tăng hàm lượng daidzein từ 166,46% đến 187,23%, genistein từ 329,80%-463,93% so với khơng chuyển gen Bốn dòng đậu tương chuyển gen T2-1, T2-4, T2-21, T2-24 vật liệu để tiếp tục chọn lọc đánh giá hệ sau Đề nghị 2.1 Trình tự nucleotide trình tự amino acid gen GmCHI1A giống đậu tương nghiên cứu phát sai khác Đặc biệt giống đậu tương ĐT26 có hàm lượng isoflavone cao Do khơng nằm phạm vi nghiên cứu luận án nên chưa xác định sai khác có liên quan đến hàm lượng isoflavone hay khơng Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để làm sáng tỏ thêm mối liên quan có sai khác trình tự gen giống ĐT26 với hàm lượng isoflavone cao mà tạo 2.2 Các dòng đậu tương chuyển gen T2-1, T2-4, T2-21, T2-24 sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương, cần tiếp tục phân tích hệ để chọn tạo dòng đậu tượng có hàm lượng isoflavone cao ổn định 29 2.3 Kết luận án chứng minh tăng cường biểu gen mã hố enzyme chìa khố đường sinh tổng hợp isoflavone đậu tương làm tăng hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương chuyển gen Đây sở khoa học để áp dụng vào giống họ đậu loài thực vật khác định hướng nâng cao hàm lượng isoflavone để nghiên cứu thực phẩm chức phục vụ công tác chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ... hút quan tâm nghiên cứu việc cải thiện hàm lượng isoflavone hạt đậu tương Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI1A liên quan đến tổng hợp isoflavone phân lập từ đậu tương. .. tương (Glycine max (L. ) Merill)” nhằm làm sáng tỏ mối liên hệ việc tăng cường biểu gen GmCHI1A với tăng hàm lượng isoflavone mầm hạt đậu tương chuyển gen Mục tiêu nghiên cứu Biểu gen GmCHI1A đậu tương. .. đậu tương chuyển gen i) Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A vào giống đậu tương DT2008 ii) Phân tích hợp gen chuyển GmCHI1A vào hệ gen đậu tương PCR Southern blot 7 iii) Phân