Nghiên cứu và biểu hiện gene liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây Ngô

phâm ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VÌ THỊ XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC Thái Nguyên, 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VÌ THỊ XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thái Nguyên, 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Các kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc công bố Tạp chí khoa học - công nghệ, phần lại chƣa đƣợc công bố công trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2017 TÁC GIẢ Vì Thị Xuân Thủy ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh trực tiếp hƣớng dẫn thƣờng xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để có đƣợc tự tin lòng đam mê khoa học giúp hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà, PGS.TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tạo điều điều kiện tốt để tiến hành th nghiệm Phòng Công nghệ tế bào thực vật Phòng công nghệ ADN ứng dụng Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên Đƣợc học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, việc nhận đƣợc đóng góp quý báu, có hội trang bị cho phƣơng pháp nghiên cứu hiểu biết sâu sắc nhiều vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Sinh học, thầy cô giáo cán ộ phận đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khoá học Tôi xin cảm ơn Trƣờng Đại học Tây Bắc, đồng nghiệp thầy cô giáo, cán Khoa Sinh - Hoá đơn vị chức tạo cho điều kiện thuận lợi mặt quản lý suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng tri ân ngƣời thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn đồng hành trình học tập Thái Nguyên, tháng năm 2017 TÁC GIẢ Vì Thị Xuân Thủy iii DANH M C NH NG TỪ V CH ABA Abscisic Acid AS Acetylseringone bp base pairs cs VIẾT TẮT Cặp bazơ nitơ Cộng Ct Threshold of Cycle DAB 3,3'-Diaminobenzidine Chu kỳ ngƣỡng tetrahydrochloride Trình tự đánh dấu biểu EST Expressed Sequence Tag ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lƣơng giới GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh GM Germination Medium Môi trƣờng nẩy mầm Gus β-Glucuronidase IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside LB Luria Bertami Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog, 1962 Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô thực vật OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rZmDEF1 Recombinant ZmDEF1 protein Protein tái tổ hợp ZmDEF1 RM Rooting Medium Môi trƣờng tạo rễ RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp - Chain Reaction phiên mã ngƣợc T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid TMB 3,3‟,5,5‟-TetraMethyl Benzidine Các hệ chuyển gen T0, T1 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi T0 ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 nảy T1 X-gal Plasmid gây khối u mầm thành T1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside ZmDEF1 Gen defensin1 ngô iv M CL C MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY NGÔ VÀ MỌT NG 1.1.1 Giá trị ngô tác hại mọt ngô .5 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh ngô liên quan đến tính kháng mọt ngô .11 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN TH C VẬT 16 1.2.1 Cấu trúc, chức defensin thực vật 16 1.2.2 Cơ chế ức chế α-amylase defensin thực vật 21 1.2.3 Nghiên cứu defensin ngô .25 1.3 NGHI N CỨU CHUYỂN GEN Ở NG 26 1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A tumefaciens 26 1.3.2 Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ngô 29 Chƣơng VẬT LIỆU V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Vật liệu thực vật 38 2.1.2 Các chủng vi khuẩn loại vector 39 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 39 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu .40 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 40 2.3.1 Phƣơng pháp đánh giá khả kháng mọt 41 2.3.2 Phƣơng pháp tách dòng giải tự trình tự gen ZmDEF1 .43 2.3.3 Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang gen chuyển ZmDEF1 46 2.3.4 Phƣơng pháp tạo chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49 2.3.5 Phƣơng pháp phân t ch chuyển gen 55 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU60 3.1.1 Khối lƣợng hao hụt giống ngô nghiên cứu 60 3.1.2 Tỷ lệ tạo bột giống ngô nghiên cứu 61 3.1.3 Tỷ lệ nhiễm mọt giống ngô nghiên cứu .62 3.1.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu 62 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 65 3.2.1 Đặc điểm gen ZmDEF1 cDNA phân lập từ giống ngô nghiên cứu 65 3.2.2 Đặc điểm gen ZmDEF1 phân lập từ DNA .70 3.2.3 Sự đa dạng trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ngô .72 3.3 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 74 3.3.1 Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 .74 3.3.2 Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc nhờ A tumefaciens 77 3.3.3 Phân tích thuốc chuyển gen 79 3.4 BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN .87 3.4.1 Kết chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99 87 3.4.2 Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A tumefaciens 92 3.4.3 Xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 hệ ngô chuyển gen T0 96 3.4.4 Phân tích biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 100 3.4.5 Kiểm tra chức sinh học protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ T1 101 KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ 104 Kết luận .104 Đề nghị 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 107 v DANH M C CÁC BẢNG Bảng 1.1 Mối tƣơng quan thành phần hoá học với tính kháng mọt hạt ngô 14 Bảng 1.2 Các protein đƣợc mã hóa gen từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc chuyển vào ngô 31 Bảng 2.1 Các giống ngô sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 2.2 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với Master Mix 44 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen ZmDEF1 vào vector tách dòng pBT 45 Bảng 2.5 Thành phần môi trƣờng LB lỏng L đặc 45 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid enzyme giới hạn BamHI 46 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid pDON201-SLHEP-HA SalI HindIII 48 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng trao đổi LR 48 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid HindIII 49 Bảng 2.10 Thành phần môi trƣờng tái sinh thuốc 51 Bảng 2.11 Thành phần môi trƣờng tái sinh ngô chuyển gen 52 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng cắt DNA tổng số SalI 56 Bảng 2.13 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 58 Bảng 2.14 Chu trình nhiệt độ phản ứng Real-time RT-PCR 58 Bảng 3.1 Khối lƣợng hao hụt hạt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm mọt 60 Bảng 3.2 Tỷ lệ bột ngô tạo giống nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm mọt 61 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm mọt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm 62 Bảng 3.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm 63 Bảng 3.5 Ch số mẫn cảm mọt tƣơng đối (Sn) giống ngô nghiên cứu 64 Bảng 3.6 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng mã hóa gen ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu 68 Bảng 3.7 Sự sai khác trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA giống ngô địa phƣơng SLvà giống ngô lai LVN99 72 Bảng 3.8 Một số trình tự gen ZmDEF1 để phân t ch đa dạng di truyền 72 Bảng 3.9 Kết biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh thuốc C9-1 78 Bảng 3.10 Kết phân tích chu kỳ ngƣỡng tỷ lệ biểu gen ZmDEF1 thuốc chuyển gen hệ T1 82 Bảng 3.11 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein ZmDEF1 tái tổ hợp từ hạt thuốc chuyển gen T1 85 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng mật độ A tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS , thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu chuyển gen gus 88 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng tuổi phôi đến hiệu suất biểu gen gus 90 Bảng 3.14 Nồng độ kanamycin mg/l cho ngƣỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang gen gus 91 Bảng 3.15 Kết tái sinh chuyển gen ZmDEF1 giống ngô LC1 LVN99 94 Bảng 3.16 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt ngô chuyển gen T1 102 109 expression of ADPglucose pyrophosphorylase: Expectations and unanticipated outcomes”, Plant Science 211, pp 52–60 18 Baosheng W., Jingjuan Y., Dengyun Z., Qian Z 2011 , “Maize defensin ZmDEF1 is involved in plant response to fungal phytopathogens”, African Journal of Biotechnology, 10 (72), pp 16128-16137 19 Baum J A., Bogaert T., Clinton W., Heck G R., Feldmann P., Ilagan O (2007), “Control of coleopteran insect pests through RNA interference, Nature Biotechnology”, 25(11), pp 1322-1326 20 Bergvinson D J., García-Lara S (2004), “Genetic approaches to reducing losses of stored grain to insects and diseases”, Curr Opin Plant Biol, 7, pp 480–485 21 Bernardi D., Salmeron E., Horikoshi R.J., Bernardi O., Dourado P M., Carvalho R A., Martinelli S., Head G P., Omoto C (2015), “Crossresistance between Cry1 Proteins in fall armyworm (Spodoptera frugiperda) may affect the durability of current pyramided Bt maize hybrids in Brazil”, PLoS One, 16(10), pp 140- 153 22 Bernfeld P (1955), “Amylase α and β”, Methods Enzymol, 1, pp 149–154 23 Binott J.J., Songa J., Ininda J., Njagi E.N., Machuka J (2005),“Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids though somatic embryogenesis”, Afri Crop Sci Conf Prod, 7, pp 1305 - 1310 24 Brewer M J, Odvody G N., Anderson D J., Remmers J C (2014), “A comparison of Bt transgene, hybrid background, water stress, and insect stress effects on corn leaf and ear injury and subsequent yield”, Environ Entomol, 43(3), pp 828-839 25 Bruix M., Gonzalez C., Santoro J., Soriano F., Rocher A., Mendez E (1995), “1H-NMR studies on the structure of a new thionin from barley endosperm”, Biopoly-mers, 36, pp 751–763 26 Carvalho A O., Gomes V M (2011), “Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications”, Curr Pharm 110 Des, 17(38), pp 4270–4293 27 Chen K C., Lin C Y., Kuan C C., Sung H Y., Chen C S (2002), “Anovel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid”, J Agric Food Chem; 50, pp 7258-7263 28 Chen J J., Chen G H., Hsu H C., Li S S., Chen C S (2004), “Cloning and functional expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris”, J Agric Food Chem, 52, pp 2256-2261 29 Chen G H., Hsu M P., Tan C H., Sung H Y., Kuo C G., Fan M J (2005), “Cloning and characterization of a plant defensin VaD1 from azuki bean”, Agric Food Chem, 53, pp 982-988 30 Castle L A., Siehl D L., Gorton R , Patten P A., Chen Y H., Bertain S., Lassner M W (2004), “Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene”, Science, 304 (5674), pp 1151-1154 31 Castiglioni P., D Warner R J., Bensen D C., Anstrom J., Harrison M., Stoecker M., Abad G., Kumar S., Salvador R., D‟Ordine S., Navarro S., Back M., Fernandes J., Targolli S., Dasgupta C., Bonin M., Luethy J.E (2008), “Bacterial RNA chaperones confer abiotic stress tolerance inplants and improved grain yield in maize under water-limited conditions”, Plant Physiology, 147, pp 446-455 32 Chuong Tran Van, Thuy Nguyen Kim (2003), “Demonstration for corn- corb storage at Farm scale in Vietnam”, Proceeding of the Scientific Meeting of the ACIAR project PHT 1998/137, pp 07-08 33 Demissie G., Tefera T., Abraham T (2008), “Efficacy of Silicosec, filter cake and wood ash against the maize weevil, Sitophilus zeamais Motsch, (Coleoptera: Curculionidae) on three maize genotypes”, Journal of Stored Products Research, 40, pp 227-231 34 Devi V.S., Sharma H.C., Rao P.A (2013), “Influence of oxalic and malic acids in chickpea leaf exudates on the biological activity of CryIAc towards”, Helicoverpa armigera, J Insect Physiol, 59(4), pp 394-399 35 Dias S C., Silva M C M., Teixeira F R., Figueira E L Z., Oliveira-Neto, O 111 B., Lima L A (2010), “Investigation of insecticidal activity of rye α- amylase inhibitor gene expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) toward cotton boll weevil (Anthonomus grandis)”, Pesticide Biochemistry and Physiology, 98(1), pp 39-44 36 Edgertom M D (2009), “Increasing crop productivity to meet Global needs for feed, food and fuel”, Plant Physiol, 149, pp 7-13 37 Emma W G., Jose C., Ade´.P.K´., Lamine.M., Simeon O K (2012), “Structural characterization of plant defensin protein superfamily”, Mol Biol Rep 39:4461–4469 38 Farias J R., Horikoshi R J., Santos A C., Omoto C (2014), “Geographical and temporal variability in susceptibility to Cry1F toxin from Bacillus thuringiensis in spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) populations in Brazil”, J Econ Entomol 107(6), pp 2182-2189 39 Frame B R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T., Pegg SE., Li B., Nettleton D., Pei P., Wang K (2002), “Agrobacterium-mediated ransformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Physiol., 129: 13-22 40 Frame B R., McMurray J M., Fonger T N., Main M L., Taylor K W., Torney F J, Paz M M., Wang K (2006), “Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts”, Plant Cell Rep, 25(10), pp 1024-1034 41 Frame B., Main M., Schick R., Wang K 2011 , “Genetic transformation using maize immature zygotic embryos”, Plant Embryo Culture: Methods and Protocol, Methods in Moleculer Biology, 710 (22), pp 327-341 42 Frank D L., Kurtz R., Tinsley N A., Gassmann A J., Meinke L J., Moellenbeck D., Gray M E., Bledsoe L W., Krupke C H., Estes R E., Weber P., Hibbard B E (2015), “Effect of seed blends and soil-Insecticide on Western and Northern corn rootworm emergence from Cry3A+eCry3,1Ab Bt Maize”, J Econ Entomol, 108 (3), pp 1260-1270 43 French B W., Hammack L., Tallamy D W (2015), “Mating success, 112 longevity, and fertility of diabrotica virgifera leconte (Chrysomelidae: Coleoptera) in relation to body size and Cry3Bb1-resistant and Cry3Bb1susceptible genotypes”, Insects, 6(4), pp 943-960 44 Jefferson R A., Kavanagh T A., evan M W 1987 , “GUS fusion: β- glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO, 6, pp 3901-3907 45 Garcia S., Bergvinson D J., Burt A J., Ramputh A I., Diaz-Pontones D M., Arnason J T (2004), “The role of pericarp cell wall omponents in maize weevil resistance”, Crop Science, 44, pp 1546-1552 46 Gordon-Kamm W J., Spencer T M., Mangano M L., Adams T R., Daines R J., Start W G., Lemaux P G (1990), “Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants”, The Plant Cell Online, 2(7), pp 603618 47 Gorji A H., Zolnoori M., Jamasbi A., Zolnoori Z (2011), “In vitro plant generation of tropical maize genotypes International Conference on Enviromental”, Biomedical and Biotechnology IPCBEE, 16, IACSIT Press, Singapore 48 Graves A C., Goldman S L (1986), “The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol Biol, 7(1), pp 43-50 49 Greene T W., Hannah L C (1998), “Enhanced stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase is gained through mutants that alter subunit interactions”, Proc Natl Acad Sci, 95, pp 13342-13347 50 Guedes R N C., Oliveira E., EGuedes N M P, Ribeiro B., Serra J E (2006), “Cost and mitigation of insecticide resistance in the maize weevil, Sitophilus zeamais”, Physiological Entomology, 31, pp.30-38 51 Guy R (1987), “Maize”, Tropical Agriculturist, C.T.A., Macmillan, London, pp 22- 36 52 Gwinner J., Harnisch R., Muck O (1996), “Manual on theprevention of post harvest seed losses, post harvest project, GTZ, D-2000”, Hamburg, FRG, pp 294 113 53 Hannah L C., Futch B., Bing J., Shaw J R., Boehlein S., Stewart J.D., Beiriger R., Georgelis N., Greene T (2012), “A shrunken-2 transgene increases maize yield by acting in maternal tissues to increase the frequency of seed development”, Plant Cell, 24(6), pp 2352-2363 54 Harjes C E., Rocheford T R , Bai L., Brutnell T P., Kandianis C B., Sowinski S G (2008), “Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification”, Science, 319, pp 330-333 55 Harwood J D., Wallin W G., Obrycki J J (2005), “Uptake of Bt endotoxins by non-target herbivores and higher order arthropod predators: molecular evidence from a transgenic corn agroecosystem”, Molecular Ecology, 14(9), pp 2815-2823 56 Hitchon A J., Smith J L., French B W., Schaafsma A W (2015), “Impact of the Bt corn proteins Cry34/35Ab1 and Cry3Bb1, alone or pyramided, on western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) beetle emergence in the fieldz”, Econ Entomol, 108(4), pp 1986-1993 57 Horikoshi R J., Bernardi O., Bernardi D., Okuma D M., Farias J R., Miraldo L L., Amaral F.S., Omoto C (2015), “Near-Isogenic Cry1F-Resistant strain of spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) to investigate fitness cost associated with resistance in Brazil”, Econ Entomol, 30, pp 382-387 58 Huang G J., Lai H C., Chang Y S., Sheu M J., Lu T L., Huang S S (2008), “Antimi-crobial, dehydroascorbate reductase, and monodehydroascorbate reductase activities of defensin from sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam „tainong 57‟] storage roots”, J Agric Food Chem, 56, pp 2989-2995 59 Hythum M S., Nasser K B., Gizawy E (2012), “Importance of micronutrients and its application methods for improving maize (Zea mays L.) yield grown in clayey soil, american-eurasian”, J Agric & Environ Sci, 12 (7), pp 954-959 60 Ichiro M., Tomiko A., Toshiaki O., Tomoko T., KeikoA (2009), “Cathepsin D-like aspartic proteinase occurring in a maize weevil, Sitophilus zeamais, as a candidate digestive enzyme”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 73 (10), pp 2338-2340 114 61 Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T (1996), “High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Nature Biotechnology, 14(6), pp 745-750 62 Ishida Y., Hiei Y., Komari T (2007), “Agrobacteium-mediated transformation of maize”, Nature Protocol (7): 1614-1621 63 Ishida Y., Hiei Y., Komari T (2007), “Agrobacteium-mediated transformation of maize”, Nature Protocol, (7), pp 1614-1621 64 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci, 12, pp 69-72 65 Kant P., Liu W Z., Pauls K P (2009), “PDC1, a corn defensin peptide expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris inhibits growth of Fusarium graminearum”, Peptides, 30, pp 1593-1599 66 Kumar R (1984), “Insect pest control with special reference to African agriculture”, Edward Arnold Publishers Ltd, Great Britain 67 Feng Lin K., Tian R L., Ping H T., Ming P H., Ching S C., Ping C L (2007), “Structure-based protein engineering for α-amylase inhibitory activity of plant defensin, PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics, 68, pp 530–540 68 Kushmerick C., Castro M S., Cruz J S., Bloch J C., Beira P S L (1998), “Functional and structural features of ɤ -zeathionins, a new class of sodium channel blockers”, FEBS Lett, 440, pp 302-306 69 Larue C D (1949), “Cultures of the endosperm of maize”, Amer J Bot, 36, pp 798 70 Lay F T., Anderson M A (2005), “Defensins – components of the innate immune system in plants”, Current Protein and Peptide Science, 6, pp 85101 71 Lay F T., Schirra H J., Scanlon M J., Anderson M A., Craik D J (2003), “The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application to a homology model of the crop defense protein alfAFP”, J Mol Biol,325, pp 175-188 115 72 Lay F.T., Brugliera F., Anderson M A (2003), “Isolation and properties of floral defensins from ornamental tobacco and petunia”, Plant Physiol, 131, pp 1283-129 73 Liliana P L M S., Alejandra B (2013), “Bacillus thuringiensis insecticidal three-domain Cry toxins: mode of action, insect resistance and consequences for crop protection”, FEMS Microbiol Rev, 37, pp 3-22 74 Livak K J., Schmittgen T D (2001), “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the (-Delta Delta C (T)) Method”, Methods, 25, pp 402-408 75 Liu Y., Cheng C , Lai S., Hsu M., Chen C., Lyu P (2006), “Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung beanand its possible role in insecticidal activity against bruchids”, Proteins: Structure, Function and Genetics, 63(4), pp 777-786 76 Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J (2011), “Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize”, Planta, 233, pp 241-250 77 Li J (2013), “Enhancing sucrose synthase activity results in increased levels of starch and ADP-glucose in maize (Zea mays L.) seed endosperms”, Plant Cell Physiol, 54, pp 282-294 78 Liu Y J., Cheng C S., Lai S M., Hsu M P., Chen C., Lyu P C (2006), “Solution strucure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids”, Proteins, 63, pp 777-786 79 Lobo D.S., Pereira I.B., Fragel-Madeira L., Medeiros L.N., Cabral L.M., FariaJ., Bellio M., Campos R.C., Linden R., Kurtenbach E (2007), “Antifungal Pisum sativum defensin interacts with Neurospora crassacyclin Frelated to the cell cycle”, Biochemistry, 46 (4), pp 987- 996 80 Lu C., Vasil V., Vasil I K (1983), “Improved efficiency of somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue cultures of maize (Zea mays L.)”, Theor Appl Genet, 66, pp 285-289 81 Luke C N., Chris O A., Emmanuel O O (2015), “Screening for new sources 116 of resistance to Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera:Curculionidae) infestatuon in stored maize genotypes”, J.Crop Prot, (3), pp 277-290 82 Maceljski M., Korunic Z (1973), “Contribution to the morphology andecology of Sitophilus zeamais Motsch in Yugoslavia”, J Stored Prod Res, 9, pp 225234 83 Mahesh B C., Kenneth J B., Timothy C.H (2003), “Module-specific regulation of the β-phaseolin promoter during embryogenesis”, Plant J 33: 853-866 84 Maite B., Joaquín R., Elisa G., Luis M.M., Antonio M., Gregorio H (2005), “A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region”, Plant Molecular Biology, 58, pp 269-282 85 Makanjuola W A., Isong I U., Omoloye A A., Kemabonta K A., Ogunyadeka A O (2009), “Inherent susceptibility of elite rice varieties to post harvest damage by Sitophilus zeamais Motsch, (Coleoptera: Curculiondae) ”, Nigerian Journal of Ecology, 10, pp 11-15 86 Măruţescu A 2012 , “A brief survey regarding fate of Bt proteins synthesized by transgenic maize in soil, JOURNAL of Horticulture”, Forestry and Biotechnology, 16(2), pp 126-130 87 Melo F R., Rigden D J., Franco O L., Mello L V., Ary M B., Grossi-deSa´M F., Bloch C (2002), “Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling and docking”, Proteins, 48, pp 311-319 88 Mendez E., Rocher A., Calero M., Girbes T., Citores L., Soriano, F (1996), “Primary structure of ω-hordothionin, a novel member of a family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems”, J Biochem, 239, pp 67-73 89 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), “Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch,(Coleoptera: Curculionidae) ”, Neotrop Entomol, 41 (5), 404-408 90 Michaelson D., Rayner J., Couto M., Ganz T (1992), “Cationic defensins 117 arise from charge-nutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte auto-cytotoxicity? ”, J Leukoc Biol, 51, pp 634–639 91 Morton R L., Schroeder H E., Bateman K S., Chrispeels M J., Armstrong E., Higgins T J V (2000), “Bean alpha-amylase inhibitor in transgenic peas (Pisum sativum) provides complete protection from pea weevil (Bruchus pisorum) under field conditions”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 97(8), pp 3820-3825 92 Munyiri S W., Mugo S N., Otim M., Mwololo J K., Okori, P (2013), “Mechanisms and sources of resistance in tropical maize inbred lines to Chilo partellusstem borers”, Journal of Agricultural Sciences, (7), pp 51-60 93 Murray M G., Thompson W F (1980), "Rapid isolation of high molecular weight plant DNA", Nucleic Acids Res., 8(19), pp 4321-4325 94 Mwololo J K., Mugo S., Okori P., Tefera T., Otim M., Munyiri S W (2012), “Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamais in Tropical Maize”, Journal of Agricultural Science, 4(11), pp 206- 212 95 Nicole L V W., Marilyn A A (2013), Plant defensins: Common fold, multiple functions, Fungal biology reviews, 26, pp.121-131 96 Nguyen Q D., Dang T D (2009), “Some research result on alien invasive species Bean weevil Acanthosscelides obtectus Say (Coleoptera, Bruchidae) in Vietnam”, Sience Journal, (37), pp 105-114 97 Nwosu L C., Nwosu U I (2012), “Assessment of maize cob powder for the control of weevils in stored maize grain in Nigeria”, Journal of tomological Research, 36 (3), pp 21-24 98 Nwosu L C (2015), “Integrating host resistance with plant materials in the management of Sitophilus zeamais infestation in stored maize”, Ph.D Thesis, ederal University of Technology Akure, Ondo State, Nigeria 99 Ombori O., Muoma J V O., Machuka J (2013), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines”, Plant Cell Tiss, 113 (1), pp 11-23 100 Osborn R W., De Samblanx G W., Thevissen K., Goderis I., Torrekens S., 118 Van Leuven F., Attenborough S., Rees S B., Broekaert W F (1995), “Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae”, FEBS Lett, 368, pp 257-262 101 Osipitan A A., Odebiyi, J A (2007), “Laboratory evaluation of twenty maize (Zea mays L.) varieties for resistance to the larger grain borer, Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera; Bostrichidae) in Ibadan, Oyo State, Nigeria”, Nigerian Journal of Entomology, 24, pp 54-67 102 Ostrem J S., Pan Z., Flexner J L., Owens E., Binning R., Higgins L S (2016), “Monitoring Susceptibility of Western Bean Cutworm (Lepidoptera: Noctuidae) Field Populations to Bacillus thuringiensis Cry1F Protein”, J Econ Entomol, 9, pp 376-383 103 Pelegrini P B., Franco O L (2005), “Plant gamma-thionins: novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense pro-teins”, Int J Biochem Cell Biol, 37, pp 2239-2253 104 Pelegrini B P., Lay F T., Murad M A., Anderson M A., Franco L.O (2008), “Novel insights on the mechanism of action of α-amylase inhibitors from the plant defensin family”, Proteins, 73, pp 719-729 105 Peng W K., Lin H.C., Wang C.H (2003), “DNA identification of two laboratory colonies of the weevils, Sitophilus oryzae (L.) and S zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) in Taiwan”, Journal Of Stored Products Research, 39(2), pp 225-235 106 Proctor D.L (1971), “An additional aedeagal character for distinguishing Sitophilus zeamais Motsch from Sitophilus oryzae (L.) (Coleoptera: Curculionidae) ”, Journal of Stored Products Research, 6, pp 351-352 107 Qiudeng Q., Sivamani E., Xianggan L., Heng Z., Samson N., Michael S., Xiaoyin F., Michael N., Timothy K., Weining G., Zhongying C., Mary-Dell M C (2014), “Maize transformation technology development for commercial event generation”, Plant Sience, 5, pp 379-398 108 Que Q., Elumalai S., Li X., Zhong H., Nalapalli S., Schweiner M., Fei X., Nuccio M., Gu T K W, Chen Z., Chilton M (2014), “Maize transformation 119 technology development for commercial event generation”, Plant Biotechnology, 5, pp 379-397 109 Rule D M., Nolting S P., Prasifka P L., Storer N P., Hopkins B W., Scherder E F., Siebert M W., Hendrix W H (2014), “Efficacy of pyramided Bt proteins Cry1F, Cry1A.105, and cry2Ab2 expressed in Smartstax corn hybrids against lepidopteran insect pests in the northern United States”, J Econ Entomol, 107(1), pp 403-409 110 Sakulsingharoj C.(2004), “Engineering starch biosynthesis for increasing rice seed weight: the role of the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase”, Plant Sci, 167, pp 1323-1333 111 Sambrook J., Russell D W (2001), “Molecular Cloning”, A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, NY 112 Santos-Amaya O F., Rodrigues J V., Souza T C., Tavares C S., Campos S O., Guedes R N., Pereira E J (2015), “Resistance to dual-gene Bt maize in Spodoptera frugiperda: selection, inheritance, and cross-resistance to other transgenic events”, Sci Rep, 17(5), pp.18243 113 Schuppener M., Mühlhause J., Müller A K., Rauschen S (2012),“Environmental risk assessment for the small tortoiseshell aglais urticae and a stacked Bt-maize with combined resistances against Lepidoptera and Chrysomelidae in central European agrarian landscapes”, Mol Ecol, 21, pp 4646-4662 114 Shaista N., Changfu Z., Gemma F., Koreen R., Ludovic B., Ju¨rgen Breitenbach., Dario P C., Gaspar R., Gerhard S., Teresa C., Paul C (2009), “Transgenic multivitamin corn through biofortification of endosperm with three vitamins representing three distinct metabolic pathways”, PNAS, 106, pp 7762-7767 115 Shohael A.M., Akanda M A L., Parves S., Mahfuja S., Alam M F., Islam R., Joarder N (2003), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo derived callus of inbred maize (Zea mays L.) ”, Biotechnol, 2(2), pp 154-161 120 116 Silverio G L., David J B (2015), “Phytochemical and Nutraceutical Changes during Recurrent Selection for Storage Pest Resistance in Tropical Maize”, Crop science, 54, pp 2423-2432 117 Silva E M., Valencia A., Grossi-de-Sá, M F., Rocha T L., Freire E., Paula J E (2009), “Inhibitory action of cerrado plants against mammalian and insect α-amylases”, Pesticide Biochemistry and Physiology, 95(3), pp 141146 118 Siebert M W., Nolting S P., Hendrix W., Dhavala S., Craig C., Leonard B R., Stewart S D., All J., Musser F R., Buntin G D., Samuel L (2012), “Evaluation of corn hybrids expressing Cry1F, cry1A.105, Cry2Ab2, Cry34Ab1/Cry35Ab1, and Cry3Bb1 against southern United States insect pests”, J Econ Entomol, 105(5), pp 1825-1834 119 Solis J., Medrano G., Ghislain M (2007), “Inhibitory effect of a defensin gene from the Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora infestans”, J Plant Physiol, 164, pp 1071-1782 120 Sousa S M., Paniago M G., Arruda P., Yunes J A (2008), “Sugar levels modulate sorbitol dehydrogenase expression in maize”, Plant Mol Biol, 68, pp 203-213 121 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol 98, pp:503-517 122 Spelbrink R.G., Dilmac N., Allen A., Smith, T.J., Shah, D.M., Hockerman, G.H (2004), “Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related plant defensins”, Plant Physiol, 135 (4), pp 20552067 123 Tadele T., Stephen M., Paddy L (2011), “Effects of insect population density and storage time on grain damage and weight loss in maize due to themaize weevil Sitophilus zeamais and the larger grain borer Prostephanus truncatus”, African Journal of Agricultural Research, 6(10), pp 2249-2254 124 Takava S., Rahnama H., Rahimian H., Kazemitabar K (2010), “Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.) ”, Journal 121 of Sciences, 21(1), pp 21-29 125 Tadele T., Girma D., Stephen M., Yoseph B (2013), “Yield and agronomic performance of maize hybrids resistant to the maize weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae)”, Crop Protection, 46, pp 94-99 126 Terras F R., Torrekens S., Van Leuven F., Osborn R W., Vanderleyden J., Cammue B P., Broekaert W F (1993), “A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species”, FEBS Lett, 316 (3), pp 233-240 127 Thevissen K., Osborn R W., Acland D P., Broekaert W F (1997), “Specific, high affinity binding sites for an antifungal plant defensin onNeurospora crassahyphae and microsomal membranes”, J Biol Chem, 272 (51), pp 32176-32181 128 Thevissen K., de Mello T P, Xu D., Blankenship J., Vandenbosch D., Idkowiak-Baldys J., Govaert G., Bink A., Rozental S., de Groot P W., Davis T R., Kumamoto C A., Vargas G., Nimrichter L., Coenye T., Mitchell A., Roemer T., Hannun Y A., Cammue B P (2012), “The plant defensin RsAFP2 induces cellwall stress, septin mislocalization and accumulation of ceramides in Candida albicans”, Mol Microbiol, 84 (1), pp 166-180 129 Topping J F (1998), “Tobacco transformation”, Methods of Mol Biol, 81, pp 365-372 130 Tongjura J D C., Amuga G A., Mafuyai H B (2010), “Laboratory assessment of the susceptibility of some varieties of Zea mays infested with Sitophilus zeamais, Motsch, (Coleoptera: Curculionidae) in Jos, Platue State, Nigeria”, Science World Journal, (2), pp 55-57 131 Vain P., Yean H., Flament P (1989), “Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L by AgN03”, Plant Cell Tiss, 18, pp 143-153 132 Vasil V., Vasil I K (1986), “Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension cultures of Zea mays L”, Plant Physiol, 124, pp 122 399-408 133 Vasil I K (2005), “Tissue cultures of maize”, Maydica, 50, pp 361-365 134 Wang Z., Chen X., Wang J., Liu T., Liu Y., Zhao L., Wang G (2007), “Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 88, pp 83-92 135 Wang Z (2007), “Increasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants”, Plant Cell Tiss Org, 88, pp 83-92 136 Wang T T., Ji J., Wang G., Guan C F., Zhang L., Jin C (2012), “Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy Gene into Shoot Meristem of Maize”, China Biol, 32(8), pp 36-40 137 Wang Y., Hu Z., Wu W (2015), “Different Effects of Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ab on Midgut Cell Transmembrane Potential of Mythimna separata and Agrotis ipsilon Larvae”, Toxins (Basel), 7(12), pp 5448-5458 138 Watrud L S., Lee E H., Fairbrother A., Burdick C., Reichman J R., Bollman M., Water P K V (2004), “Evidence for landscape-level, pollenmediated gene flow from genetically modified creeping bentgrass with CP4 EPSPS as a marker”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(40), pp.14533-14538 139 Wong J H., Zhang X Q., Wang H X , Ng T B (2006), “A mitogenic defensin fromwhite cloud beans (Phaseolus vulgaris) ”, Peptides, 27, pp 20752081 140 Yamaguchi-Shinozaki K., Sakuma Y., Ito Y., Shinozaki K (2006), “The DRE-DREB regulon of gene expression in Arabidopsis and rice in response to drought and cold stress, In: J.-M Ribaut (Ed.) Drought adaptation in cereals”, Haworth, NY pp 583-598 141 Zahida Q., Khadija A., Idrees A N., Abdul M F., Bushra T., Qurban A., Arfan A., Mudassar F A., Muhammad T., Tayyab H (2015), “An overview of genetic transformation of glyphosate resistant gene in Zea mays”, Nature and 123 Science, 13(3), pp 81-90 142 Zhang L., Shen W., Fang Z., Liu B (2016), “Cry1ab/c in different stages of growth in transgenic rice Bt- shanyou”, Front Biosci, 1(21), pp 447-454 143 Zhao Z U., Cai1 T., Tagliani L., Miller M., Wang N., Pang H., Rudert M., Schroeder S., Hondred D., Seltzer J., Pierce D (2000), “Agrobacteriummediated sorghum transformation”, Plant Mol Biol, 44, pp 789-798 ... ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 nảy T1 X-gal Plasmid gây khối u mầm thành T1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside ZmDEF1 Gen defensin1 ngô iv M CL C MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn... Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lƣơng giới GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh GM Germination Medium Môi trƣờng nẩy mầm Gus β-Glucuronidase IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside... Recombinant ZmDEF1 protein Protein tái tổ hợp ZmDEF1 RM Rooting Medium Môi trƣờng tạo rễ RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp - Chain Reaction phiên mã ngƣợc T-DNA Transfer