Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
3.4.2. Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A. tumefaciens
Giống bắt đầu vào sản xuất thử năm 2002. Giống đƣợc trồng vụ hè - thu, thu - đông ở các t nh miền núi phía Bắc. Ở t nh Sơn La, giống LVN99 là một trong các giống ngô lai được trồng phổ biến hiện nay. Trong các giống ngô địa phương nghiên cứu, giống LC1 có khả năng kháng mọt thấp nhất. Do đó, lựa chọn giống ngô lai LVN99 và giống ngô địa phương LC1 làm vật liệu để nhận gen chuyển ZmDEF1.
Bắp non của hai giống ngô LVN99 và LC1 đƣợc thu ở 10 - 12 ngày thụ phấn, bóc bỏ 3 - 5 lớp vỏ ngoài bắp, khử trùng bề mặt bắp ngô bằng cồn 70%. Cắt bỏ phần ph a đầu râu ngô, để lại khoảng 4 - 5 lớp vỏ ngoài bao lấy bắp, cho bắp đã đƣợc khử trùng bề mặt vào tủ lạnh 40C để qua đêm để cảm ứng lạnh. Theo Ysida và cs (2007), giai đoạn cảm ứng lạnh là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận gen của phôi ngô [62].
93
Hình 3.17. Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống LVN99 vụ hè - thu năm 2016
(A1: Phôi sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy;
A2: Phôi nuôi trên trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 50mg/l, chọn phôi mang gen chuyển lần 1; A3: Phôi nuôi trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 25mg/l, chọn lọc phôi mang gen chuyển lần 2; A4: Phôi nuôi trên môi trường phục hồi mô sẹo; A5: Phôi nuôi trên môi trường tái sinh chồi; A6: Phôi nuôi trên môi trường ra rễ; Ra cây: Cây được trồng ngoài trời)
Phôi ngô đƣợc tách trong điều kiện vô trùng. Tách hạt khỏi bắp ngô và dùng dao cắt một phần nhỏ của hạt phía có dây treo phôi (tránh cắt ngang phôi) bóp nhẹ để đẩy phôi tách ra khỏi hạt. Dùng kim nhọn để gây tổn thương phôi. Phôi đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens CV58 chứa cấu trúc mang gen ZmDEF1 trong 30 phút sau đó thấm khô và cấy trên môi trường đồng nuôi cấy (Hình 3.17 A1) nuôi trong tối 3 ngày. Phôi sau khi rửa bằng dung dịch
ẵMS và cefotaxim 500 mg/l. Thấm phụi vào giấy thấm và cấy trờn mụi trường chọn lọc chứa kháng sinh kanamycine 50 mg/l trong một tuần (Hình 3.17 A2) những phôi không mang gen chuyển sẽ bị đen, không phát triển và chết. Thu những phôi phát triển được trên môi trường A2 chuyển sang môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine lần 2 để chọn lọc mô sẹo chuyển gen (Hình 3.17 A3) với nồng độ kháng sinh 25 mg/l để thu những mô sẹo phát triển. Các mô sẹo đã đƣợc chọn lọc kháng sinh được chuyển sang môi trường nuôi cấy phục hồi A4. Nuôi cấy
94
trong tối trong một tuần để mô sẹo đạt k ch thước lớn hơn Hình 3.17 A4). Các mô sẹo sau khi nuôi trong môi trường phục hồi, đạt kích thước mong muốn được chuyển sang môi trường tái sinh A5 bổ sung AP 2 mg/l để phôi hóa mô sẹo (Hình 3.17 A5). Sau khi chồi được tái sinh sẽ chuyển sang môi trường tạo rễ A6 bổ sung NAA 0,5 mg/l (Hình 3.17 A6) và nuôi trong điều kiện 28oC, ánh sáng 8 giờ/ngày. Sau 2 đến 3 tuần chồi đƣợc tạo rễ đầy đủ. Cây con hoàn ch nh sẽ đƣợc cho ra huấn luyện ở bầu với giá thể Tribat có chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, muối khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của cây. Sau 7 đến 10 ngày huấn luyện, các cây đƣợc đƣa trồng ra ngoài trời (Hình 3.17 - Ra cây).
Sau hai lần biến nạp sử dụng phôi non ngô ở vụ đông - xuân (tháng 11 năm 2015 đến 2 năm 2016 và vụ hè - thu (tháng 5 - tháng 8 năm 2016 , kết quả biến nạp và tái sinh cây chuyển gen của hai giống ngô LC1 và LVN99 ở bảng 3.15.
Bảng 3.15 cho thấy, kết quả biến nạp ở vụ đông - xuân, giống LC1 với 136 phôi đƣợc biến nạp ch thu đƣợc 7 mô sẹo đƣợc chọn lọc với kháng sinh (5,15%) và một mô sẹo đƣợc tái sinh với tỷ lệ tái sinh đạt 14,28%. Nhƣng do cây yếu nên khi ra giá thể trong bầu cây bị chết. Ở giống LVN99, có 147 phôi biến nạp gen thu đƣợc 8 phôi chọn lọc với kháng sinh đạt 5,44%, nhƣng cũng ch có một phôi tái sinh đƣợc, phôi này sau khi ra cây cũng bị chết. Ở vụ đông - xuân quá trình tái sinh phôi ngô chuyển gen không thu đƣợc đa chồi. Có thể thấy khả năng nhận gen ngoại lai, tái sinh của phôi non ở hai giống ngô LC1 và LVN99 ở vụ đông - xuân là thấp.
Bảng 3.15. Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1 và LVN99
Lô thí nghiệm Số phôi biến nạp
Số mô sẹo đƣợc
chọn lọc
Số mô sẹo tái sinh
Số cây ra bầu đất
Số cây kết hạt
Vụ đông- xuân (2015-
2016)
LC1 136 7 1 0 0
LVN99 147 8 1 0 0
Vụ hè - thu LC1 158 22 8 5 3
95
(2016) LVN99 167 23 7 4 2
ĐC0- LC1 30 3 0 0 0
ĐC0- LVN99 30 4 0 0 0
ĐC1- LC1 30 22 16 10 10
ĐC1- LVN99 30 20 13 10 10
(LC1: phôi ngô giống ngô LC1 chuyển gen nuôi trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; LVN99: phôi ngô giống LVN99 chuyển gen nuôi trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC0- LC1: phôi ngô giống ngô LC1 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC0- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1- LC1: phôi ngô giống LC1 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC1- LVN99: phôi ngô giống LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh)
Kết quả biến nạp phôi non ngô ở vụ hè - thu (Bảng 3.15) giống LC1 với 22 mô sẹo đƣợc chọn lọc trong 158 phôi đƣợc biến nạp với tỷ lệ chọn lọc đạt 14,1%
trong đó có 8 phôi đƣợc tái sinh đạt tỷ lệ tái sinh lên 36,36%. Thu đƣợc 5 cây ra bầu đất và 3 cây kết hạt. Giống LVN99 biến nạp 167 phôi, số mô sẹo đƣợc chọn lọc trên môi trường kháng sinh là 23 phôi đạt 13,77%, trong số mô sẹo được chọn lọc có 7 phôi tái sinh 30,43% , thu đƣợc 4 cây ra bầu đất và 2 cây kết hạt. Ở vụ hè - thu chúng tôi đã tạo đƣợc đa chồi, trung bình số chồi trên một mô sẹo của giống LVN99 là 2,7 còn của giống LC1 là 2,62 chồi. Đồng thời với các mẫu biến nạp chúng tôi cũng tái sinh các phôi không biến nạp gen của hai giống LC1 và LVN99 trên môi trường chọn lọc (lô thí nghiệm ĐC0 , kết quả các mẫu này đều không tái sinh được trên môi trường chọn lọc kháng sinh. Để có mẫu đối chứng âm, 30 phôi không chuyển gen của mỗi giống LC1 và LVN99 được tái sinh trên môi trường không chứa kháng sinh (lô thí nghiệm ĐC1 . Trên môi trường không chứa kháng sinh giống LC1 có tỷ lệ tái sinh 72,72% còn giống LVN99 đạt 65%, mỗi giống chúng tôi cho ra cây 10 cây.
Kết quả nghiên cứu của Trần Thị Lương và cs 2014 , khi chuyển gen Sh2 vào 12 dòng ngô bằng A. tumefaciens C58 thu đƣợc kết quả chọn lọc mô sẹo trung
96
bình ở vụ xuân là 11,98%, tỷ lệ tái sinh trung bình là 40,20% và kết quả từng dòng ngô khác nhau là khác nhau [6]. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy, khả năng tái sinh của ngô ngoài phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy còn phụ thuộc vào kiểu gen.
Qua Bảng 3.15 cho thấy, tỷ lệ mô sẹo đƣợc chọn lọc và tỷ lệ tái sinh, số cây đưa ra đất của phôi vụ hè - thu tốt hơn so với vụ đông - xuân. Sự sinh trưởng phát triển của phôi ngô trong ở các thời vụ khác nhau trong năm sẽ ảnh hưởng đến chất lượng phôi non. Chất lượng phôi non ảnh hưởng lớn đến khả năng tiếp nhận gen, khả năng phôi hóa mô sẹo cũng như sự sinh trưởng và phát triển của cây khi ra đất.
Kết quả nghiên cứu của Trương Thu Hằng 2013 cũng cho kết quả khả năng nhận gen, tái sinh và sức sinh trưởng của ngô biến nạp ở vụ hè - thu tốt hơn so với vụ đông - xuân khi chuyển gen CryIAc kháng sâu vào dòng ngô HR9 nhờ A.
tumerfaciens [3].