1.3. NGHI N CỨU CHUYỂN GEN Ở NG
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A. tumefaciens
27
với giống cây truyền thống. Với các ƣu điểm mà cây chuyển gen mang lại, nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô cũng đã đƣợc quan tâm. Hiện nay, chuyển gen ở cây ngô có 2 phương pháp, chuyển gen trực tiếp và gián tiếp. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhƣng mang lại hiệu quả cao lƣợng bản sao gen biến nạp ít, tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [39], [99].
Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ban đầu không đƣợc xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Tuy nhiên, đã có nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá mầm và khả năng tiếp nhận gen ngoại lai. Chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens thành công là bước đột phá của công nghệ gen. Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã đƣợc xây dựng cho các cây một lá mầm nhƣ lúa, lúa mì, lúa miến [57], [143].
Khả năng chuyển gen ngoại lai vào tế bào ngô nhờ A. tumefaciens lần đầu tiên đƣợc chứng minh vào giữa những năm 80 của thể k XX [46]. Sau đó, phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium được phát triển mạnh khi Ishida và cs (1996), đã chuyển gen vào phôi non ngô với một dòng A.
tumefaciens mang vector nhị thể với gen vir từ pTiBo542 [61]. Từ đó, phương pháp này đã đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều phòng th nghiệm trên thế giới để sản xuất ngô biến đổi gen, đây vẫn là phương pháp được lựa chọn cho nghiên cứu gen quy mô lớn và cho phát triển thương mại [60]. Các yếu tố quan trọng quyết định đến thành công của chuyển gen bằng A. tumefaciens đã đƣợc nghiên cứu tối ƣu hóa, thiết lập nên một hệ thống chuyển gen.
Trong quá trình chuyển gen vào cây ngô thì phôi ngô là vật liệu chuyển gen ƣu thế nhất mà các tác giả sử dụng [23]. Vì vậy, để tạo cây ngô chuyển gen thành công thì việc nuôi cấy phôi ngô là một trong các yếu tố quan trọng nhằm thiết lập hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen. Đã có nhiều tác giả nghiên cứu môi trường và các chất ảnh hưởng đến sinh tái sinh phôi ngô non. Các công trình nghiên cứu đều cho rằng phôi non nuôi cấy trên môi trường N6 cho tỷ lệ mô sẹo cao hơn môi trường MS [41], [115].
28
Các chất điều hòa sinh trưởng và các chất ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo đã được các tác giả quan tâm. Nhìn chung, chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, điển hình là 2,4-D với nồng độ khoảng 1 - 3 mg/l là cần thiết cho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử. 2,4-D là yếu tố quan trọng trong sự khởi đầu và phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi từ phôi ngô non. Bổ sung BAP 0,1 mg/l kết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự hình thành và duy trì mô sẹo phôi hóa [16], [23].
Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo dạng II. Các tác giả nhận thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dạng II đƣợc tăng lên khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường bổ sung AgNO3 (5 - 20 mg/l) và AgNO3 không ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo. AgNO3 được sử dụng như một chất ức chế hoạt tính của ethylen nội sinh. Ethylen đƣợc hình thành trong quá trình nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng tới sự phân chia và biệt hóa của tế bào. Do vậy, việc bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy đã có tác dụng kích thích sự tạo thành mô sẹo và tái sinh cây [99], [131].
Vai trò của L-proline trong việc duy trì mô sẹo xốp và mô sẹo có khả năng tạo phôi ở ngô đã đƣợc nghiên cứu. Các tác giả đã tạo mô sẹo và duy trì hơn một năm mà mô sẹo vẫn xốp và không mất khả năng phôi hóa. Tỷ lệ tạo mô xốp và mô sẹo phôi hóa tăng tỷ lệ với bổ sung L-proline với nồng độ 20 - 25 mM vào môi trường N6 [22], [47], [115].
Ở Việt Nam, cây ngô cũng đƣợc nghiên cứu nuôi cấy nhằm phục vụ cho việc chuyển gen. Phạm Thị Lý Thu 2005 , đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non ngô. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo của 2 dòng ngô HR8 và HR9 đạt 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9% và 21,4% [7].
Nguyễn Văn Đồng và cs 2009 , đã tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năng tái sinh cao. Kết quả nghiên cứu thu đƣợc 4 dòng ngô tẻ VH1, VH11, VH19, VH29; 3 dòng ngô nếp VHN9, VHN10, VHN16 và 2 dòng ngô ngọt VHD2, VHD5 có khả năng tái sinh cao đồng thời mang một số đặc tính nông học tốt đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen [2].
29
Nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu tuổi phôi, k ch thước phôi, thời gian nhiễm khuẩn tối ưu cho chuyển gen và kết quả nghiên cứu cho thấy phôi có k ch thước trung bình từ 0,8 đến 1,5 mm đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens 30 phút với mật độ vi khuẩn OD660nm = 0,6 - 0,8 cho hiệu quả chuyển gen cao nhất [6], [124].
Acetosyringone (AS) là một loại phenol đƣợc tiết ra từ thực vật bị tổn thương, chúng có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhập vào thực vật tại nơi tổn thương. Do đó, bổ sung AS vào môi trường gây nhiễm khuẩn nhằm nâng cao hiệu quả chuyển gen. Vì vậy nồng độ AS bổ sung tối ƣu cho hiệu suất chuyển gen cũng đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu. Các tác giả cho thấy bổ sung 100 - 200 μM là hiệu quả chuyển gen tốt nhất [16], [77].
Ishida và cs (2007 đã đƣa ra một quy trình chuyển gen hoàn ch nh nhờ A.
tumefaciens với thời gian 3 tháng bắt đầu từ lúc gây nhiễm và đồng nuôi cấy vào phôi non của ngô. Theo phương pháp này, 50% phôi non dòng A188 và 15% phôi non dòng A634, H99 và W117 đã đƣợc chuyển gen thành công. Số cây tái sinh từ phôi non này cho hy vọng sẽ tạo ra thế hệ thứ 2 và thứ 3. Hơn 90% số cây chuyển gen có kiểu hình cũng như t nh trạng nông học bình thường [62].
Với quy trình chuyển gen bằng A. tumefaciens ngày càng đƣợc hoàn ch nh, tối ưu nên nhiều giống ngô chuyển gen đã được đưa ra thị trường đã được thương mại hóa.