1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN TH C VẬT
1.2.2. Cơ chế ức chế α-amylase của defensin thực vật
Trong tự nhiên, thực vật có thể sản sinh ra vô số các chất để chống lại sâu, bệnh gây hại. Chúng bao gồm các phân tử carbohydrate, polyanions và một số protein bảo vệ nhƣ chitinases, β-1,3-glucanases, lectin, α và β-thionins, defensin và một số chất ức chế tiêu hóa enzyme [102], [113].
Ba loại defensin đó là SIα1, SIα2 và SIα3 (defensin của hạt cao lương có khả năng ức chế sự tiêu hoá của côn trùng bởi sự ức chế hoạt động α-amylase. Ba defensin này cũng thể hiện hoạt động chống lại nấm và ức chế yếu α-amylase trong tuyến nước bọt của người. Nhưng α-amylase từ tuyến tuỵ lợn, lúa mạch và vi khuẩn không bị ức chế bởi các defensin này. Defensin γ-Hordothionin của nội nhũ lúa mạch cũng đã đƣợc chứng minh là có khả năng ức chế α-amylase. γ- Hordothionin ức chế α-amylase từ nước bọt của người nhưng không có hiệu quả ức chế α-amylase của tuỵ lợn. Trên cơ sở khả năng ức chế α-amylase từ ruột của côn trùng của một số defensin thực vật, có thể sử dụng defensin thực vật trong việc bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng. Defensin ngăn cản côn trùng tiêu hoá, vì thế côn trùng mất đi năng lƣợng từ sự tiêu hóa tinh bột [100].
Defensin VrD1 đƣợc phân lập ở cây đậu xanh đã đƣợc xác định là có khả năng kháng mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis) [75]. Trong hạt có chứa 0,2% defensin VrD1 tái tổ hợp gây chết đối với ấu trùng mọt đậu xanh [27], [28].
Những kết quả tương tự cũng thu được khi defensin VrD1 tái tổ hợp gây chết đối với P. pastoris. VaD1 đƣợc phân lập từ đậu azuki đậu đỏ) đã cho thấy khả năng ức chế mọt đậu xanh (C. chinensis) với nồng độ 0,8% [29]. Defensin thực vật có khả năng ức chế α-amylase, hoạt động theo cơ chế cạnh tranh, ức chế sự hoạt động của enzyme tiêu hóa dẫn đến cái chết của côn trùng [86]. Nghiên cứu Liu và cs (2006) về cơ chế ức chế α-amylase mọt bột vàng (T. molitor) của defensin từ đậu xanh (VrD1), cho rằng loop 3 tạo giữa gấp nếp β2 và β3 của cấu trúc không gian
22
của VrD1 gắn kết với trung tâm hoạt động của α-amylase của mọt bột vàng. Trong trường hợp này, tương tác không xảy ra tại vị tr xúc tác, nhưng xảy ra ở một vị trí trên bề mặt, mà vị tr đó có tính ổn định ngăn cản sự tiêu hóa cơ chất của enzyme.
Sự gắn kết giữa VrD1 và α-amylase mọt bột vàng là do lực hút tĩnh điện. Bề mặt gắn kết của loop 3 chủ yếu t ch điện dương, trong khi trung tâm hoạt động của α- amylase thì t ch điện âm (Hình 1.5) [78]. Điều này càng đƣợc chứng minh khi Feng Lin và Cs (2007) so sánh VrD1 với defensin khác của đậu xanh là VrD2 là protein có khả năng kháng nấm, không có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng mặc dù chúng có cấu trúc không gian tương tự nhau. Kết quả so sánh cho thấy ở loop 3 của VrD2 ngắn hơn VrD1. Hơn nữa, có sự khác nhau về vị trí amino acid t ch điện dương là Arg. Ở VrD2 thì Arg ở vị trí 40 trong chuỗi polypeptide trong khi VrD1 ở vị tr 38. Ngoài ra, VrD2 đƣợc tăng t ch điện âm bởi Asp ở vị trí 37 và Asp ở vị tr 38 do đó ngăn cản VrD2 chèn loop 3 của mình vào trung tâm hoạt động của enzyme [67].
Pelegrini và cs 2008 đã nghiên cứu khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh (A. obtectus), mọt đậu Mexico (Z. subfasciatus , α- amylase trong nước bọt của người, trong tụy của lợn, của defensin VuD1 được phân lập từ cây đậu đũa V. unguiculata). Kết quả cho thấy, khả năng ức chế α- amylase từ các nguồn khác nhau của VuD1 là khác nhau (Hình 1.6). Hình 1.6 cho thấy, VuD1 không tác động đến hoạt động của Callosobruchus maculatus - một loại nấm gây bệnh Aspergillus fumigatus. VuD1 ức chế thấp với α-amylase của lợn và người, ức chế mạnh hoạt động của α-amylase của mọt đậu Mexico và mọt đậu xanh [104]. Nhƣ vậy, VuD1 có thể đƣợc sử dụng trong bảo vệ sự phá hại của mọt với đậu đỗ.
Hình 1.5. Mô hình mô tả sự phân bố điện tích bề mặt của α-amylase của T. molitor (TMA), VrD1, VrD2 và vị trí gắn kết giữa TMA và VrD1
23
(TMA: α-amylase của mọt bộ vàng, VrD1: Defensin của đậu xanh có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng; VrD2: Defensin của đậu xanh không có khả năng ức chế α-amylase mọt bột vàng; Màu đỏ: điện tích âm; màu trắng: điện tích trung tính; màu xanh: tích điện dương; D: Aspartic, E: Glutamic, M: Methionine, Q:
Glutamine, R: Arginine)
(Nguồn: Feng Lin và Cs (2007)[67])
Hình 1.6. Biểu đồ biểu thị khả năng ức chế α-amylase từ các nguồn khác nhau của defensin VuD1
(CMA: α- amylase mọt đậu đỏ (Callosobruchus maculatus), PPA: α-amylase tụy lợn, Aasp: α-amylase Aspergillus fumigatus, HA: α-amylase tuyến nước bọt của người, AA: α-amylase A. obtectus, ZSA: α-amylase Z. subfasciatus)
(Nguồn: Pelegrini và cs (2008) [104]) Rất nhiều nhà khoa học đã đi tìm câu trả lời cho câu hỏi cơ chế nào giúp cho defensin (VuD1) có khả năng ức chế α-amylase khác nhau là khác nhau. Cấu trúc phân tử của VuD1 gồm một chuỗi α từ Thr17 đến Lys27 và 3 nếp gấp β ở các vị trí cụ thể: β1 từ Cys3 đến Ala7, β2 từ Gly33 đến Asp37 và β3 Arg40 đến Arg45. Các amino acid từ vị tr 1 đến 25 t ch điện dương, xen kẽ giữa arginine và lysine.Trên mô hình 3D cho thấy khu vực t ch điện dương trong VuD1 tương tác với vùng t ch điện âm của enzyme, vì vậy giả thiết sự gắn kết giữa defensin thực vật với enzyme là do liên kết ion và liên kết hydro [104].
Cấu trúc không gian của VuD1 tạo nên 3 loop nhƣ cấu trúc chung của defensin thực vật. Trong chuỗi α và nếp gấp β, bên cạnh đầu C có đặc điểm là giàu amino acid cation như lysine và arginine. Một số amino acid kỵ nước nằm trên vị trí tiếp xúc trên
24
bề mặt, các amino acid này nhƣ Leu6, Phe15, Leu30, Leu31 và Val39 [104]. Sử dụng hai chương trình Hex và Autodock, Pelegrini và cs 2008 đã xác định được cơ chế ức chế α-amylase của mọt đậu Mexico (Z. subfasciatus) của VuD1 (Hình 1.7A).
Đó là, Lys1 của VuD1 liên kết với Asp 204 của α-amylase của mọt đậu Mexico ZSA , đây là vị trí hoạt động của α-amylase của ZSA, vì thế ngăn cản sự đi vào của cơ chất tinh bột. Để chứng minh vai trò của Lys1, tác giả đã gây đột biến điểm biến đổi Lys thành Gly, kết quả là ZSA và VuD1 không gắn kết với nhau [104].
Hình 1.7. Mô hình mô tả cơ chế ức chế α-amylase của VuD1
(A: Tương tác cấu trúc không ba chiều giữa VuD1(màu đen) và ZSA (màu xám) B: Tương tác cấu trúc không ba chiều giữa VuD1(màu đen) và ZSA (màu xám trắng) và PPA α-amylase tụy lợn (màu xám đen))
(Nguồn: Pelegrini và cs (2008) [104])
Khả năng ức chế hoạt động của α-amylase tụy lợn (PPA) của VuD1 là thấp, nguyên nhân do đặc điểm 3 loop của α-amylase tụy lợn dài hơn ZSA, gây ra sự giảm tiếp xúc giữa VuD1 và trung tâm hoạt động của α-amylase tụy lợn (Hình 1.7 B). Cụ thể, loop 1 của ZSA đƣợc tạo thành bởi 4 amino acid còn PPA đƣợc tạo bởi 6 amino acid. Loop này là yếu tố quan trọng trong giảm ức chế hoạt động PPA của VuD1 bởi nó nhƣ một trở ngại về không gian cho lối vào của VuD1 đến trung tâm hoạt động của PPA. Loop 2 của ZSA gồm 3 amino acid còn PPA gồm 5 amino acid dài hơn ZSA 0,87 Å. Loop 3 của PPA gồm 10 amino acid còn ZSA ch có 3 amino acid, ở loop này PPA dài hơn ZSA đến 8,4 Å. Nhƣ vậy, sự khác biệt trong cấu trúc ở lối vào trung tâm hoạt động của PPA và ZSA đã gây cản trở sự đi vào gắn kết giữa VuD1 và PPA [104].
Nhƣ vậy, với khả năng ức chế enzyme tiêu hóa của côn trùng cụ thể là α- amylase mở ra hướng ứng dụng sử dụng defensin thực vật trong bảo vệ nông sản khỏi tác hại của sâu hại an toàn, bền vững. Defensin có thể sử dụng nhƣ công cụ
25
công nghệ sinh học để ứng dụng trong bảo vệ nông nghiệp cho sự kiểm soát của sâu, bệnh.