Chương 2. VẬT LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU
2.3.2. Phương pháp tách dòng và giải tự trình tự gen ZmDEF1
Dựa vào các thông tin về trình tự nucleotide của gen ZmDEF1 mang mã số JF797205 trên Ngân hàng gen quốc tế, đã thiết kế cặp mồi ZmDEF1F-SalI /ZmDEF1R-HindIII bằng chương trình DNAStar.
2.3.2.2. Phân lập gen Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ các giống ngô nghiên cứu đƣợc tách bằng dung dịch đệm với CTA , EDTA và β-mercapto ethanol tiến hành theo phương pháp của Murray và cs (1980) [93].
Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
Sử dụng bộ kít Trizol Reagents (của hãng Invitrogen để tách chiết RNA tổng số từ các giống ngô nghiên cứu theo ch dẫn của nhà sản xuất.
Sử dụng bộ kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis của hãng Fermantas để tổng hợp cDNA từ RNA tổng số đã tách chiết theo quy trình ch dẫn của nhà sản xuất.
Kỹ thuật PCR khuếch đại gen ZmDEF1
Gen ZmDEF1 đƣợc khuếch đại từ DNA hoặc cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII đặc hiệu đã thiết kế. Thành phần phản
44
ứng PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix
STT Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
1 PCR Master Mix 2X 12,5
2 ZmDEF1F-SalI 10 pmol/μl 1,0
3 ZmDEF1R-HindIII 10 pmol/μl 1,0
4 DNA hoặc cDNA 500 ng/μl 2,0
5 Nước khử ion - 8,5
Tổng thể tích 25
Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng PCR khuếch đại gen ZmDEF1:
Biến tính khởi động ở 94oC trong 5 phút; (biến tính ở 94oC trong 40 giây; gắn mồi ở 58oC trong 30 giây; tổng hợp kéo dài ở 72oC trong 45 giây) × 30 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút; bảo quản ở 4oC.
2.3.2.3.Tách dòng gen ZmDEF1 và xác định trình tự nucleotide
Kỹ thuật tách dòng phân tử đƣợc thực hiện theo Sambrook và cs [111] với các bước cơ bản sau:
Tinh sạch gen đích
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas theo quy trình ch dẫn của nhà sản xuất.
Gắn đoạn DNA vào vector tách dòng pBT
Sản phẩm tinh sạch PCR đƣợc gắn vào vector p T để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm với thành phần và điều kiện phản ứng mô tả ở bảng 2.4 Biến nạp vector tách dòng tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Hỗn hợp gồm 5 àl cú thể chứa vector tỏi tổ hợp pBT-ZmDEF1 và 50 àl dịch tế bào khả biến E.coli DH5α trong nước đá 20 phút, sau đó chuyển nhanh vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút 30 giây rồi đưa ngay vào nước đá trong thời gian 10 phỳt để gõy sốc nhiệt. Sau khi sốc nhiệt, bổ sung 150 - 300 àl LB lỏng
45
(Bảng 2.5 để nuôi phục hồi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ. Cấy trải 150 - 250 àl dịch khuẩn lờn mụi trường L đặc cú bổ sung carbenicillin 50 mg/l, X-gal 30 mg/l và IPTG 100 àM rồi nuụi ở 37oC trong vũng 16 giờ.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen ZmDEF1 vào vector tách dòng pBT STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0
2 T4 DNA Ligase 5 u/μl 1,0
3 ZmDEF1 100 ng/μl 12,0
4 pBT 100 ng/μl 3,0
5 Nước khử ion - 2,0
Tổng 20
Điều kiện phản ứng: 20oC trong 3 giờ
Bảng 2.5. Thành phần môi trường LB lỏng và LB đặc
Môi trường Thành phần
LB lỏng Bacto pepton 10 g/l + NaCl 10 g/l + yeast extract 5 g/l, pH = 7 L đặc LB lỏng + 1,6% agar
Sàng lọc các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR Dùng tăm tre khử trùng chấm những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pBT-ZmDEF1, hoà vào 5 àl nước khử ion. Dung dịch này dựng DNA làm khuôn cho phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI /ZmDEF1R-HindIII. Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt độ đƣợc thực hiện nhƣ phản ứng PCR cơ bản đƣợc mô tả trong phần nhƣ bảng bảng 2.3.
Tách chiết plasmid
Tách chiết plasmid bằng kít Plasmid Extraction theo ch dẫn của nhà sản xuất.
46
Cắt kiểm tra gen ZmDEF1 trên plasmid tái tổ hợp bằng BamHI
Xác định sự có mặt của gen ZmDEF1 bằng cách sử dụng enzyme hạn chế BamHI (Bảng 2.6). Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8%.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 BamHI Buffer 10X 1
2 BamHI 5 u/μl 1
3 Plasmid 200 ng/μl 5
4 Nước khử ion - 3
Tổng 10
Điều kiện phản ứng ở 37oC, 4 giờ Xác định trình tự nucleotide
Các plasmid tái tổ hợp mang gen ZmDEF1 đƣợc xác định trình tự trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.3.2.4. Xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu về phân tích trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit và DNA Star.