Cấu trúc, chức năng của defensin thực vật

1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA DEFENSIN TH C VẬT

1.2.1. Cấu trúc, chức năng của defensin thực vật

Defensins thực vật đƣợc mô tả đầu tiên trong lúa mỳ (Triticum aestivum) và lúa mạch (Hordeum vulgare) [27]. Đƣợc gọi với tên “defensin thực vật” để phân biệt với defensin ở nhiều nhóm sinh vật khác, bởi chúng có cấu trúc mang nhiều nét tương đồng. an đầu, defensin thực vật được nhóm vào thành viên mới của họ thionin do tương đồng về khối lượng phân tử, amino acid và số cysteine. Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc của chúng đã ch ra sự khác biệt về cầu nối disulfide và chứng minh defensin và thionin là không liên quan [25].

Hình 1.2. Hai lớp defensin thực vật

(A: Lớp defensin thực vật 1; B: Lớp defensin thực vật 2)

(Nguồn: Lay và cs (2005) [70])

Cấu trúc chung của protein defensin gồm hai vùng chính. Vùng peptide tín hiệu, vùng defensin ch nh cơ bản) và một số có thêm vùng đuôi ở đầu C. Dựa vào đặc điểm này, Lay và cs 2005 đã chia defensin thực vật làm 2 lớp chính (Hình 1.2). Lớp thứ nhất với số lƣợng defensin lớn nhất, lớp này protein gồm trình tự peptide tín hiệu đầu N và vùng defensin chính ở đầu C (Hình 1.2A). Vùng peptide tín hiệu có tính acid, có chức năng định hướng vận chuyển peptide theo con đường tiết. Vì vậy, có thể thấy rằng peptide tín hiệu tạo nên một hiệu ứng vận chuyển defensin theo mục tiêu. Điểm nối giữa vùng peptide tín hiệu và vùng defensin ch nh có điểm đẳng điện (pI) bằng 3,1. Lớp này không có nhân tố tín hiệu rõ ràng

17

cho quá trình biến đổi sau dịch mã [70].

Lớp defensin thứ 2 gồm các protein có tiền protein lớn hơn do có thêm trình tự amino acid ở vùng đuôi C với 33 amino acid (C-terminal prodomain - Hình 1.2B). Một giả thuyết về chức năng của trình tự đuôi C C-terminal liên quan đến tín hiệu điều ch nh sau dịch mã và bị phân hủy sau dịch mã [70].

Vùng chức năng hay vùng cơ bản của defensin có điểm đẳng điện (pI) bằng 9. Vùng này bao gồm 45 - 55 amino acid, chứa 8 gốc cystein tạo nên 4 cầu nối disunfide, giúp cho cấu trúc không gian ba chiều ổn định với dạng CSαβ (dạng chứa cầu nối disunfide giữa các cystein của xoắn α và nếp gấp β) đặc trƣng cho defensin thực vật [26]. Các defensin thực vật khá đa dạng tương ứng với vị trí khác nhau của các amino acid cũng nhƣ nhóm 8 gốc cystein [37]. Sự khác biệt trong cấu trúc bậc nhất dẫn tới các hoạt tính sinh học khác nhau đối với các loại defensin này.

Protein defensin thực vật gồm ba phiến gấp β và một chuỗi xoắn α, chúng đƣợc giữ vững bởi 4 cầu nối disunfide. Cầu nối disulfide thứ tƣ có chức năng nối đầu N và C tạo ra một cấu trúc protein ổn định [71]. Nicole và cs 2013 đã phân tích 139 trình tự amino acid của defensin thực vật và xác định đƣợc vị trí cystein và tạo 4 cầu nối disulfide giữa các cystein nhƣ sau: Cys1 – Cys8, Cys2 – Cys5, Cys3 – Cys6, Cys4 – Cys7. Giữa các cystein nối với nhau tạo ra 7 loop (vòng lặp) trong cấu trúc (Hình 1.3) [95].

Hình 1.3. Cấu trúc của chuỗi polypeptide defensin thực vật (Nguồn: Nicole và cs (2013 [95])

Nếu trong chuỗi polypeptide của defensin ở giữa các vị trí của 8 cystein tạo nên 7 loop thì trong cấu trúc không gian tạo nên 3 loop với 4 cầu nối disulfide (Hình 1.4 . Loop 1 L1 đƣợc tạo ra giữa phiến gấp β1 và xoắn α, loop 2 L2 đƣợc tạo bởi xoắn α và nếp gấp β2, cuối cùng loop 3 L3 đƣợc tạo bởi nếp gấp β2 và β3. Trong cấu trúc không gian, các loop này có vai trò quan trọng, đặc biệt là loop

18

3 nó liên quan đến hoạt tính sinh học của defensin [67], [95].

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2)

(A: mặt trước, B: mặt sau, màu xanh: phiến gấp β, màu đỏ xoắn α, màu vàng hình ở hình B: cầu nối disunfide, VrD2: defensin của đậu xanh)

(Nguồn: Hình A Feng Lin và cs (2007) [67], hình B Nicole và cs (2013) [95]) 1.2.1.2. Chức năng của defensin thực vật

Defensin thực vật là protein đa chức năng, chúng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của nấm, kháng vi khuẩn; ức chế trypsin, α-amylase, ức chế tổng hợp protein; tăng khả năng chịu kim loại nặng; ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, ức chế quá trình dịch mã, thay đổi trạng thái oxy hóa khử ascorbic acid.

Ức chế dịch mã in vitro

Hoạt tính sinh học đầu tiên của defensin thực vật là ức chế quá trình dịch mã in vitro đƣợc mô tả bởi Mendez và cs 1990 , đó là một peptide đƣợc phân lập từ nội nhũ lúa mạch γ-hordothionin, đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế quá trình dịch mã ở gan chuột. Một peptide khác sau đó đƣợc chiết xuất từ nội nhũ lúa mạch và đặt tên ω- hordothionin, cũng có khả năng ức chế quá trình dịch mã trong gan chuột, gan thỏ và trong hệ thống prokaryote (Escherichia coli) [88].

Cơ chế ức chế quá trình dịch mã in vitro của defensin đang đƣợc bàn luận.

Một số nghiên cứu cho thấy ở nồng độ cao, defensin lúa mạch gây phosphoryl hoá một tiểu đơn vị trong chuỗi polypeptide của 2 nhân tố khởi đầu eIF-2α ở eukaryote, có lẽ là do sự hoạt hoá eIF-2α kinase. Nên đây có thể là lý do giải thích cho việc suy yếu các giai đoạn khác nhau của tổng hợp protein [26].

Ức chế protease

19

Hai defensin tương đồng được phân lập từ hạt của Cassia fistula (muồng hoàng yến , đƣợc biết đến với đặc tính chống côn trùng. Đó là defensin 5459, có tác dụng ức chế trypsin. Còn peptide thứ 2 là defensin 5144, không có khả năng ức chế trypsin. Defensin 5459 khác với 5144 ch bởi vài amino acid, trong đó sự thay đổi ở amino acid thứ 25 trong chuỗi peptide, ở defensin 5144 là Thrcòn defensin 5459 là Lys. Khi Lys trong defensin đã đƣợc xác định là có liên quan đến các hoạt động ức chế proteinase. Với chức năng sinh lý này, 5459 có thể góp phần giúp cây trồng có khả năng chống lại côn trùng bởi khả năng ức chế tiêu hoá côn trùng. Cơ chế của khả năng ức chế trypsin đƣợc giải thích với defensin Cp-thionin là nó có thể liên kết với trypsin của côn trùng, do đó ức chế tiêu hóa protein của côn trùng [87].

Kháng vi sinh vật

Chức năng sinh học kháng vi sinh vật của defensin thực vật đã đƣợc quan tâm ngay từ những năm đầu thập niên 1990 bởi Terras và cs [126].

Khả năng kháng vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều là khả năng kháng nấm [79]. Defensin phân lập từ lá của Spinacia oleracea (cải bó xôi) có khả năng ức chế vi khuẩn C. michiganensis (vi khuẩn gây thối cà chua), vi khuẩn P.

solanacearum (vi khuẩn gây bệnh héo rũ ở cà chua, khoai tây,...) ở nồng độ dưới 20 mM [139].

Rất nhiều loài nấm gây bệnh ở cây trồng bị ức chế sinh trưởng bởi defensin thực vật nhƣ: Alternaria brassicola (gây bệnh đốm vòng), A. solani gây héo rũ ở cà chua), Botrytis cinerea (gây bệnh thối xám), Cladosporium colocasiae (gây bệnh đốm mốc), Verticilium dahliae (gây bệnh thối rễ),... và một số loài nấm gây bệnh ở người như Candida albicans. Nồng độ ức chế tuỳ thuộc và loài nấm và loại defensin khác nhau. Ví dụ, F. culmorumwas bị ức chế bởi Ah-AMP1 (defensin phân lập từ loài Aesculus hippocastanum) ở nồng độ 12 mg/ml và bởi Rs-AFP2I (defensin phân lập từ hạt loài R. sativus) ở nồng độ 1,5 mg/ml, loài R. solani bị ức chế bởi TvD1 (defensin phân lập từ cây cốt khí) ở nồng độ 100 mg/ml [119], [128]. Defensin ức chế sự tăng trưởng của nấm bằng cách tương tác với lipid trên màng sinh chất ngăn cản sự phân chia của tế bào nấm hoặc defensin cạnh tranh để liên kết với sphingolipid trên màng của nấm, gây ức chế sinh trưởng của nấm [95].

20

Khả năng chịu kẽm

Hiện nay, tình trạng ô nhiễm kim loại nặng đang trở nên phổ biến ở nhiều khu vực do hoạt động sản xuất của con người. Trong đó, đáng chú ý là hiện tượng bị nhiễm kẽm, chì, đồng,… Các tác giả đã biểu hiện cDNA của cây Arabidopsis halleri trong nấm men S.cerevisiae và lựa chọn các chủng chịu kẽm bằng cách ủ chúng vào một môi trường có chứa nồng độ độc hại của các kim loại. Chín trình tự cDNA đã đƣợc lựa chọn và kết quả dịch mã cho thấy các trình tự này mã hoá cho bốn peptide tương đồng với defensin thực vật. Biểu hiện của defensin trong nấm men và A. halleri đƣợc thúc đẩy khi cây t ch lũy lƣợng kẽm lớn [95]. Tuy nhiên, cơ chế liên quan đến khả năng chịu kẽm của defensin thực vật vẫn còn là vấn đề đang đƣợc bàn luận.

Liên quan đến trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid

Defensin SPD1 đƣợc nhân dòng từ củ khoai lang (Ipomoea batatas đƣợc xem nhƣ một enzyme. SPD1 có khả năng khử dehydroascorbate (DHA) tới ascorbic acid (AsA) với sự có mặt của glutathione. Tuy nhiên, khi thiếu glutathione SPD1 có hoạt tính DHA-reductase rất thấp và AsA bị oxi hóa bởi AsA- oxidase tạo monodehydroascorbate MDA . MDA cũng đƣợc khử bởi SPD1 tới AsA với sự có mặt của NADPH bởi MDA-reductase. Những dữ liệu này cho thấy, SPD1 có cả hai hoạt tính là DHA-reductase và MDA-reductase. Vì vậy, chức năng của SPD1 là quy định trạng thái oxi hoá khử của AsA. Điều này có ý nghĩa đối với tế bào thực vật, giúp cho cây loại bỏ đƣợc các gốc oxy hoạt hóa, tránh đƣợc tình trạng bị stress oxy hóa [58].

Khoá kênh ion

Kushmerick và cs (1998) là những tác giả đầu tiên mô tả sự ức chế kênh natri của tế bào động vật có vú GH3 bởi hai defensin phân lập từ hạt ngô, γ1- zeathionin ở nồng độ 33 mM, và γ2-zeathionin ở nồng độ 62 mM. Defensin có thể tác động làm thay đổi điện thế hoạt động của kênh ion bằng cách giảm số lƣợng kênh ion mở hoặc giảm số lượng các kênh mở trong bước nhảy thế [68]. Các tác giả này cũng đã chứng minh, các kênh ion kali không bị thay đổi dưới tác động của defensin [16].

21

Spelbrink và cs 2004 , đã nghiên cứu ảnh hưởng của MsDEF1 (defensin của loài M. truncatula) đến hoạt động của kênh ion canxi. Kết quả cho thấy có tới 90% kênh ion này bị đóng bởi MsDEF1. Các tác giả cũng giải thích nguyên nhân MsDEF1có thể ngăn chặn kênh ion canxi có thể là do MsDEF1 có cấu trúc giống protein KP4, một chất có khả năng ngăn chặn kênh ion canxi [122].