1.3. NGHI N CỨU CHUYỂN GEN Ở NG
1.3.2. Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở ngô
Tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu một phần lớn là do côn trùng gây ra. Ước t nh mức độ thiệt hại chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng lương thực hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13 - 16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu nhƣ cây trồng, nông sản không đƣợc áp dụng các biện pháp bảo vệ. Với cây ngô, sâu đục thân ngô (Ostrinia nubilalis) thuộc họ Ngài sáng (Pyralidae), Bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và sâu xám (Agrotis ypsilon) thuộc họ ngài đêm Noctuidae , ộ cánh vảy (Lepidoptera) là hai loài sâu hại rất phổ biến, thường gây hại rất nặng đối với cây ngô ở nhiều vùng trồng ngô của nước ta [113].
Đến nay hàng loạt gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại
30
của nhóm gen Cry ở vi khuẩn Bacillus thuringiensis t đƣợc đƣa vào cây ngô để tạo cây ngô chuyển gen có khả năng kháng côn trùng [34]. Nhiều tác giả đã nghiên cứu cơ chế tác động của tinh thể độc tố Cry trong ruột của côn trùng. Hiện nay, cơ chế tác động này đã đƣợc sáng tỏ, đó là khi nuốt phải tinh thể Cry (tiền độc tố) dưới tác dụng của pH cao trong ruột côn trùng và protease mà tinh thể được hòa tan, thủy phân và hoạt hóa thành các nhân độc tố có hoạt t nh monomer . Sau đó các nhân độc tố này dính bám lên tế bào thƣợng bì ruột, làm phá hủy cấu trúc tế bào ruột tạo nên các kênh rò r . Vì vậy trong ruột của côn trùng có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa ruột côn trùng và môi trường ngoài, tạo điều kiện cho nước, các ion khuếch tán từ môi trường vào trong ruột và gây nên sự phình của tế bào ruột (Hình 1.9). Kết quả côn trùng chết sau vài ngày. Độc tố Cry không thể bám dính trong bề mặt tế bào niêm mạc ruột của động vật có vú. Hơn nữa do pH của đường ruột động vật có vú thấp nên tiền độc tố Cry không bị hòa tan và thủy phân.
Do vậy, loại protein nay hoàn toàn không gây độc đối với con người cũng như các loài vật nuôi [55], [73].
Hình 1.9. Mô hình phương thức hoạt động của nội độc tố Cry trong đường ruột của côn trùng
(1: Tiền độc tố cry, 2: Tiền độc tố được phân cắt bởi protease của ruột côn trùng, 3: Nhân độc tố (monomer) gắn vào thụ thể của ruột côn trùng, 4 -5 -6: Hình thành lỗ rò trên ruột côn trùng)
(Nguồn Liliana và cs (2013) [73])
Với ƣu điểm của độc tố Cry, cho đến nay, hàng loạt gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, đƣợc chuyển vào cây ngô (Bảng 12 nhằm tạo cây ngô chuyển gen có khả năng tự kháng bộ cánh cứng
31
(Coleoptera) và bộ cánh vẩy (Lepidoptera) [86], [112].
Ở Việt Nam, sâu đục thân ngô thường gây hại nặng ở nhiều vùng và trong mọi mùa vụ. Ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, sâu phá hại ngô thường tập trung vào các tháng mùa mƣa do độ ẩm cao. Ruộng ngô bị sâu đục thân nặng làm số cây bị hại có khi lên đến 80 - 90%, dẫn đến năng suất bị giảm sút. Chuyển gen Cry vào cây ngô để kháng sâu hại cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Trương Thu Hằng 2013 , đã chuyển thành công gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens vào dòng ngô HR9. Cây chuyển gen biểu hiện khả năng kháng sâu đục thân cao [3].
Nhƣ vậy, việc tạo ra các giống ngô biến đổi gen có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Tuy nhiên, trong các hướng nghiên cứu tập trung vào tạo cây ngô chuyển gen kháng sâu hại, rất ít công trình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô để tăng cường khả năng kháng mọt hại ngô.
Bảng 1.2. Các protein đƣợc mã hóa bởi các gen từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc chuyển vào cây ngô
STT Tên
protein
Đối tƣợng gây
độc Loài gây độc Nguồn
1 Cry1Ab Lepidoptera
(Bộ cánh vẩy) Ostrinia nubilalis [142]
[137]
2 Cry1F Lepidoptera (Bộ cánh vẩy)
Ostrinia nubilalis Sesamia spp.
Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda
Agrotis ipsilon.
[107]
[38]
[102]
[57]
[38]
3 Cry1A.105 Lepidoptera (Bộ cánh vẩy)
Ostrinia nubilalis Sesamia spp.
Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda
Agrotis ipsilon.
[21]
[42]
32
4 Cry2Ab2 Lepidoptera (Bộ cánh vẩy)
Ostrinia nubilalis Sesamia spp.
Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda
Agrotis ipsilon.
[21]
[118]
[111]
5 mCry3A Coleoptera
(Bộ cánh cứng) Diabrotica virgifera irgifera [42]
6 Cry3Bb1 Coleoptera
(Bộ cánh cứng) Diabrotica virgifera [43]
7 Cry34Ab1/
Cry35Ab
Coleoptera
(Bộ cánh cứng) Diabrotica virgifera [24], [56]
8 CryIAc Lepidoptera (Bộ cánh vẩy)
Helicoverpa armigera
[33]
1.3.2.2. Cải thiện khả năng kháng thuốc trừ cỏ
Glyphosate ((N-phosphomethyl glycine là một thuốc trừ cỏ lưu dẫn có phổ tiêu diệt rộng, đƣợc sử dụng để diệt các loại cỏ dại, đặc biệt là cỏ dại hàng năm và cỏ thảm đã đƣợc phát hiện năm 1970. Loại thuốc này ức chế sự sinh trưởng của thực vật thông qua ức chế 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, enzyme thứ 6 trong con đường sinh tổng hợp các amino acid thơm triptophan, tyrosine và phenylalanine , phenolic, lignin, tannin và các phenylpropanoid khác. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của thuốc trừ cỏ cũng có thể tiêu diệt cây trồng [141].
Để tránh tác hại của thuốc trừ cỏ lên cây trồng, cây trồng có khả năng kháng thuốc diệt cỏ herbicide-tolerant (HT được hình thành bằng phương pháp chuyển gen. Castle và cs 2004 , đã phát hiện ra chất diệt cỏ glyphosate đƣợc giải độc hiệu quả bằng N-acetylation. Sau đó ông phân lập đƣợc gen GAT mã hóa enzyme glyphosate N-acetyltransferase từ vi khuẩn, ông chuyển gen này vào cây ngô. Cây ngô chuyển gen có khả năng chịu đƣợc glyphosate. Việc acetyl hóa glyphosate đã cung cấp một chiến lƣợc hỗ trợ sử dụng glyphosate trên cây trồng [30].
33
Vi khuẩn A. tumefaciens dòng CP4, có khả năng giải độc glyphosate cao hơn các dòng khác bởi nó chứa EPSPS. EPSPS xúc tác chuyển enolpyruvyl của phosphoenolpyruvate PEP thành 5-hydroxyl của shikimate 3-phosphate S3P để tạo ra 5-enolpyruvyl shikimate 3-phosphate EPSP và phosphate vô cơ [138]. Sau đó gen cpEPSPS đã chuyển thành công vào thực vật trong đó có cây ngô. Đến năm 2007, có khoảng 12 triệu nông dân trên 23 nước đã trồng 114,3 triệu ha cây trồng chuyển gen cp4 EPSPS [19]. Ƣu thế của cây trồng chuyển gen kháng glyphosate giúp cho việc kiểm soát cỏ dại dễ dàng hơn và hiệu quả hơn, tăng lợi nhuận, đòi hỏi t đất trồng và không hạn chế mùa vụ. Lợi ch của sự giải độc glyphosate là loại bỏ đƣợc dƣ lƣợng thuốc diệt cỏ, có thể tạo nên cây kháng tốt hơn và cho phép phun trong thời gian ra hoa. Hiện nay rất nhiều giống ngô kháng thuốc trừ cỏ đã đƣợc đƣa vào Việt Nam trồng nhƣ giống NK66Bt/GT, NK4300 Bt/GT,...
1.3.2.3. Cải thiện khả năng chịu hạn
Ngô là cây lương thực với sản lượng toàn cầu lớn nhất, 829 triệu tấn hàng năm so với 690 triệu tấn/năm đối với gạo và 675 triệu tấn/năm đối với lúa mì).
Năng suất ngô trong các nước phát triển của Bắc Mỹ và châu Âu trung bình 8,7 tấn/ha, còn các nước đang phát triển của châu Á và châu Phi đạt 3,7 tấn/ha. Năng suất, sản lƣợng ngô bị biến động lớn bởi tác động của hạn hán, nó gây giảm trung bình 15% sản lượng trên toàn cầu tương đương với hơn 120 triệu tấn bị mất đi hàng năm. Thiệt hại về kinh tế là mất đi 36 tỷ đô la, số tiền có thể nuôi sống 300 triệu người trong một năm. Do đó tạo cây ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn là vấn đề đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm [107].
Giống ngô MON 87.460, đƣợc chuyển gen cspB quy định protein sốc lạnh (cold-shock protein) phân lập từ vi khuẩn Bacillus subtilis [31]. Thử nghiệm giống MON 87.460 trong mùa khô năm 2012, kết quả giống có khả năng chịu hạn cao.
Giống MON 87.460 bị thiệt hại bởi hạn 7% trong khi đó giống nền thiệt hại tới 65%. Giống này đã được tập đoàn Monsanto đưa ra thị trường thương mại năm 2013 [107].
Các gen của họ gen DREB cũng đƣợc sử dụng nhiều trong chuyển gen vào cây ngô nhằm tăng cường khả năng chịu hạn. Cây ngô chuyển gen họ DREB đã đƣợc chứng minh hiệu quả chịu hạn ở giai đoạn cây con [140]. Chịu hạn là một
34
đặc điểm phức tạp, đa gen vì vậy những cây chuyển gen đơn lẻ thường mức độ cải thiện khả năng chịu hạn không cao nhƣ mong đợi. Vì vậy chiến lƣợc tạo cây ngô chuyển đa gen multigene đang đƣợc tập trung nghiên cứu.
Ở Việt Nam, tạo cây ngô chuyển gen đang cũng đƣợc quan tâm. Đinh Văn Trình và cs 2009 đã chuyển thành công gen Zm-DREBlA theo phương pháp chuyển gen nguyên cây nhờ A. tumefaciens [8]. Phạm Văn Đồng và cs 2013 , đã chuyển thành công gen chịu hạn ZmNAC1 và ZmNF-YB vào 3 giống ngô VH1, CM8 và VN106 với mục đ ch tạo dòng ngô chuyển gen chịu hạn cao [2].
1.3.2.4. Tăng năng suất ngô
Enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzyme có cấu trúc từ nhiều phân tử khác nhau. Enzyme này xúc tác cho mức độ tổng hợp tinh bột và đƣợc biết đến nhƣ là enzyme then chốt trong điều khiển sức chứa. Biến đổi gen mã hóa enzyme này có thể làm tăng sức chứa của cây dẫn đến tăng số lƣợng hạt ngô và khối lƣợng hạt. Hoạt động của AGPase đƣợc thúc đẩy bởi 3-phosphoglycerate, bị ức chế bởi Pi ở tế bào chất [17]. Vì vậy, những nỗ lực để tăng năng suất của ngô liên quan đến biểu hiện cao (over-expression) của các gen liên quan đến hoạt động của AGPase. Cải thiện năng suất của ngô theo hai hướng, thứ nhất tăng khối lượng hạt, hướng thứ hai tăng số lượng hạt.
Tăng năng suất bằng tăng khối lƣợng hạt
Rev6 là gen được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến điểm gen AGPase.
Kết quả biểu hiện của gen rev6 ở cây ngô chuyển gen làm tăng 11 - 18% khối lƣợng hạt ngô. Nguyên nhân của sự tăng khối lƣợng hạt này do gen đột biến rev6 chèn Tyr-Ser vào đuôi carboxyl của tiểu đơn vị lớn của AGPase làm giảm sự ức chế của Pi đến enzyme AGPase [107].
Nghiên cứu của Wang và cs 2007 cũng thu được kết quả tương tự, sự tăng khối lƣợng hạt ngô khi chuyển gen glgC16 đột biến từ AGPase của vi khuẩn E.
coli. Gen glgC16 của E. coli mã hóa một AGPase ít phụ thuộc vào cơ chất fructose-1,6-bisphosphate và ít nhạy cảm với các chất ức chế AMP và Pi. Cây ngô chuyển gen glgC16 với sự kiểm soát của promoter Zein-19 đã tăng 13 - 25% khối lƣợng hạt [135].
35
Zhang và cs (2016), chuyển đồng thời hai gen sh2 và bt2 vào cây ngô, kết quả cây chuyển gen tăng 18 - 33% khối lƣợng hạt. Tuy nhiên khi chuyển từng gen đơn lẻ thì kết quả không cao như chuyển đồng thời hai gen này [142]. Hướng nghiên cứu này cũng thành công ở cây lúa gạo, cây lúa mì khi chuyển gen rev6, glgC-TM, sh2,... [110]. Nhƣ vậy, sự tăng khối lƣợng hạt của các cây chuyển gen với cơ chế chung là giảm sự ức chế của Pi đến hoạt động của AGPase.
Tăng năng suất bằng tăng số lƣợng hạt
AGPase có thể được biểu hiện cao (over-expression để tăng cường sức chứa.
Kết quả này thu đƣợc khi chuyển gen hs33/rev6 hoặc gen upreg1 vào cây ngô với promoter sh2 hay gluteri điều khiển các chất vào nội nhũ, thì cây chuyển gen không tăng khối lƣợng của hạt mà tăng số lƣợng hạt. Các tác giả giải thích, có thể do các gen này có tác dụng kích thích sự phát triển của cơ quan sinh sản nên làm tăng số lƣợng hạt của ngô [49], [76].
Hannah và cs 2012 , đã nghiên cứu biểu hiện gen hs33/rev6 với sự điều khiển promoter sh2 trên cây ngô chuyển gen qua nhiều mùa sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cây chuyển gen biểu hiện AGPase có sự sai khác cây hoang dại, cụ thể tăng 56% sức chứa của bầu nhụy và tăng 64% số lƣợng hạt so với cây không chuyển gen, vì vậy làm tăng năng suất của ngô. Lý giải là sự biểu hiện của gen chuyển làm tăng hoạt động ATPase tăng xác suất thụ tinh thành công, hơn nữa tăng sức chứa của bầu nhụy, cùng với đó là tinh bột đƣợc tổng hợp nên hạt đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng đủ nên hạn chế phôi bị chết do đó số lƣợng hạt tăng lên [53].
1.3.2.5. Thay đổi thành phần hạt Tăng hàm lƣợng tinh bột
Quá trình tổng hợp tinh bột đƣợc bắt đầu bằng enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) xúc tác cho phản ứng glucose-1-phosphate với ATP để tạo ADP-glucose, rồi tổng hợp nên tinh bột. Gen Shrunken 2 (sh2) mã hóa cho hai tiểu phần lớn của ADP-glucose pyrophosphorylase và t thay đổi trong quá trình tiến hóa. Đây là gen quan trọng, biểu hiện ở nội nhũ, vì vậy có ảnh hưởng rất nhiều đến tổng hợp tinh bột [6], [17]. Li và cs 2011 cũng chuyển gen sh và bt2
36
vào hai dòng ngô Chang 7-2 và Ye478. Kết quả nghiên cứu đã thu đƣợc những hạt ngô chuyển gen có khối lƣợng tăng 15% so với hạt ban đầu và hàm lƣợng tinh bột là 74%, trong khi giống ban đầu có hàm lƣợng tinh bột là 65% [76].
Cây ngô chuyển gen biểu hiện protein Susy cũng làm tăng hàm lƣợng tinh bột lên từ 10 - 15% [77]. Cũng tương tự, cây chuyển gen biểu hiện enzyme sorbitol dehydrogenase SDH cũng nâng cao sản lƣợng tinh bột trong cây ngô.
SDH giảm fructose, để sử dụng sorbitol NADH. SDH cũng có thể góp phần vận chuyển đường vào nội nhũ bằng cách tạo ra một gradient thông qua sản xuất sorbitol [119].
Ở Việt Nam, tác giả Trần Thị Lương và cs 2014 đã chuyển gen sh2 vào sáu dòng ngô H95, H240, H26, H14, H4 và CML161 với hiệu suất chuyển gen từ 1,08 đến 1,77%, tạo được cây chuyển gen sinh trưởng và phát triển bình thường, cho bắp và hạt [6].
Tăng hàm lƣợng β-carotene
Con người có thể tổng hợp vitamin A từ β-carotene, do đó cung cấp một lƣợng đủ β-carotene có thể ngăn ngừa các bệnh do thiếu vitamin A nhƣ: mù, rối loạn chức năng miễn dịch,… Quá trình tổng hợp β-carotene đƣợc quyết định bởi enzyme lycopene-ε cyclase. Gen lycE quy định tổng hợp lycopene-ε cyclase đã đƣợc nghiên cứu và chuyển thành công vào cây ngô. Kết quả cây ngô chuyển gen có hàm lƣợng β-carotene tăng 30 - 40%, các dòng đều đạt trên 13,6μg/g khối lƣợng khô [54].
Aluru và cs 2008 , đã chuyển gen crtB của vi khuẩn Erwinia (mã hóa phytoene synthase) và gen crtI (xúc tác làm giảm độ bão hòa trong con đường tổng hợp carotenoid) vào cây ngô dưới sự kiểm soát của promoter γ-zein để biểu hiện trong nội nhũ. Kết quả cây ngô chuyển gen có hàm lƣợng carotenoid lên tới 33,6μg/g khối lƣợng khô [14].
Chuyển gen Zmpsy1 và PacrtI vào cây ngô với promoter kiểm soát biểu hiện ở nội nhũ. Cây ngô chuyển gen thu đƣợc có hàm lƣợng β-carotene tăng đột biến có dòng lên tới 56μg/g khối lƣợng khô [17].
Wang và cs (2012), đã chuyển gen mã hóa phytoene synthase psy) vào
37
giống Tian Tawu và 7922 thông qua A. tumefaciens. Kết quả, cây ngô chuyển gen psy có hàm lƣợng carotenoid tổng số trong cây ngô chuyển gen tăng 25% so với giống ban đầu [136].
Tạo giống ngô đa vitamin
Thiếu hụt vi chất dinh dƣỡng là một thách thức lớn đối với sức khỏe con người trên toàn thế giới, với ước tính khoảng 40 - 50% dân số trên thế giới bị bệnh do thiếu khoáng chất cần thiết và các vitamin. Đặc biệt, các nước đang phát triển tình trạng thiếu vitamin cao hơn do chế độ ăn uống của người dân chủ yếu là ngũ cốc, mà ngũ cốc có hàm lƣợng vitamin và vi chất dinh dƣỡng thấp [58]. Trong ngô có 4 đa hình của locus lcye có thể thay đổi lƣợng giữa α-carotene và β-carotene cho phép nâng cao hàm lƣợng β-carotene. Tuy nhiên sự tổng hợp các chất bị điều khiển bởi cơ chế ức chế ngƣợc lƣợng sản phẩm ức chế quá trình tổng hợp), nên chiến lƣợc để nâng cao hàm lƣợng vitamin trong hạt ngô là chuyển các gen mã hóa enzyme quan trọng giải phóng con đường ức chế ngược. Mục tiêu tăng cường đồng thời cả 3 loại vitamin trong nội nhũ của ngô là β-carotene, ascorbate (vitamin C và folate. Đây là các vitamin đại diện cho 3 con đường chuyển hóa hoàn toàn khác nhau và cách duy nhất để đạt đƣợc một sự thay đổi triệt để trong dinh dƣỡng của hạt ngô và giảm bớt thời gian sử dụng kỹ thuật chuyển gen [114].
Shaista và cs 2009 , đã chuyển 4 gen mã hóa các enzyme của các con đường chuyển hóa cho β-carotene, ascorbate và folate vào phôi non 10 - 14 ngày tuổi của giống ngô trắng Nam Phi M37W. Để tăng hàm lƣợng β–carotene, chuyển gen psy1 quy định tổng hợp phytoene synthase ở cây ngô và gen crtI từ vi khuẩn Erwinia mã hóa tổng hợp carotene desaturase, dưới sự điều khiển của promoter D-hordein.
Chuyển gen dhar mã hóa cho enzyme dehydroascorbate của cây lúa để tăng hàm lƣợng ascorbate và gen GCH1 của vi khuẩn E. coli quy định tổng hợp GTP cyclohydrolase để tăng hàm lƣợng folate. Kết quả tạo ra cây ngô chuyển gen (L1) có màu vàng chứa đa vitamin đầu tiên với β-carotene tăng gấp 169 lần ascorbate (vitamin C) gấp 6 lần và hàm lƣợng folate gấp 2 lần so với giống ngô trắng Nam Phi M37W [114].