Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
3.4.1. Kết quả chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99
Gen β-glucuronidase (gus đƣợc phân lập từ chủng E.coli RA201. β- glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide tạo sản phẩm phân giải có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronidase thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ đặc điểm này, mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm ch thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển [44]. Ảnh hưởng của mật độ A.
tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn, tuổi phôi ngô đến hiệu quả chuyển gen gus và ngƣỡng chọn lọc phôi mang gen chuyển của kanamycin ở giống ngô LVN99 đã đƣợc nghiên cứu, để làm cơ sở cho chuyển thành công gen đ ch ZmDEF1 vào phôi ngô.
88
3.4.1.1. Ảnh h ởng của mật đ A. tumefaciens, nồng đ AS, th i gian nhiễm khuẩn, tuổi phôi ngô đến hiệu quả chuyển gen gus
Để xác định được ảnh hưởng của mật độ khuẩn A. tumefaciens đến hiệu suất chuyển gen vào phôi ngô giống LVN99, tiến hành nhiễm khuẩn phôi ngô 12 ngày tuổi trong 30 phút, bổ sung 100 M AS ở các mật độ vi khuẩn khác nhau để xác định mật độ khuẩn tối ƣu, kết quả đƣợc ở bảng 3.12.
Kết quả bảng 3.12 cho thấy, hiệu suất biểu hiện tạm thời gen gus của các mẫu chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy, phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn A.
tumefaciens sử dụng để biến nạp. Ở mật độ OD660nm = 0,2 thì không có phôi ngô nào biểu hiện tạm thời gen gus, ở mật độ OD660nm = 0,4 hiệu suất biểu hiện gen gus ch đạt 3,33%. Ở mật độ vi khuẩn OD660nm = 0,8 hiệu quả chuyển gen cao nhất với hiệu suất đạt 40,83%, hiệu suất biểu hiện gen gus ở mật độ OD660nm = 0,6 đạt 35,83%. Ở mật độ OD660nm = 1,0 thì hiệu suất chuyển gen lại giảm, ch đạt 11,67%. Như vậy, mật độ tế bào A. tumefaciens đã ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen và hiệu quả chuyển gen đạt cao nhất ở nồng độ vi khuẩn có giá trị OD660nm = 0,8. Mật độ vi khuẩn OD660nm = 0,8 đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen gus
Ảnh hưởng của mật độ khuẩn
Ảnh hưởng của nồng độ AS
Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn
Mật độ vi khuẩn (OD660nm)
Hiệu suất chuyển gen
gus (%)
Nồng độ AS (M)
Hiệu suất chuyển gen
gus (%)
Thời gian gây nhiễm khuẩn (phút)
Hiệu suất chuyển gen
gus (%)
0,2 0,00 0 0 5 5,83 ± 1,13
0,4 3,33 ± 0,26 50 22,50 ± 1,43 10 14,16 ± 1,13 0,6 35,83 ±1,73 100 35,83 ± 1,73 20 29,17 ± 1,25 0,8 40,83 ±1,53 150 40,83 ± 1,53 30 42,50 ± 2,63 1,0 11,67 ± 1,78 200 32,50 ± 1,86 40 32,50 ± 1,86
89
Bảng 3.12 cũng cho thấy, trong trường hợp không bổ sung AS thì không tìm thấy phôi nào biểu hiện gen gus. Trong môi trường bổ sung 150 M AS thì hiệu suất chuyển gen cao nhất đạt 40,83%. Ở nồng độ 100 và 200 M AS hiệu quả chuyển gen chênh lệch không lớn 35,83% và 32,50% . Nhƣ vậy, khi bổ sung 150
M AS cho hiệu quả chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 là cao nhất, nồng độ này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. AS là một loại phenol đƣợc tiết ra từ thực vật bị tổn thương, chúng có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhập vào thực vật tại nơi tổn thương. Vì vậy bổ sung AS vào môi trường gây nhiễm khuẩn nhằm mục đ ch nâng cao hiệu quả chuyển gen Anami và cs (2010), khi nghiên cứu chuyển hai cấu trúc pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 đã khẳng định với môi trường đồng nuôi cấy bổ sung AS thì hiệu suất chuyển gen đạt cao hơn, và nồng độ AS là 100 - 200 àM là tốt nhất [16].
Ảnh hưởng của thời gian gây nhiễm A. tumerfaciens đến hiệu suất biểu hiện gen gus vào phôi ngô non giống LVN99 đã đƣợc nghiên cứu. Kết quả bảng 3.12 cho thấy, ở các khoảng thời gian nhiễm khuẩn khác nhau, kết quả biểu hiện tạm thời gen gus là khác nhau, hiệu quả biến nạp tăng dần khi ngâm khuẩn trong các thời gian 5, 10, 20 và 30 phút, nhưng 40 phút thì có xu hướng giảm. Thời gian gây nhiễm khuẩn 30 phút thu đƣợc hiệu suất chuyển gen cao nhất (42,50%). Còn ở thời gian ngâm khuẩn 5 phút hiệu suất thấp nhất (5,83%), có thể do thời gian này chƣa đủ để A. tumerfaciens di chuyển đi vào phôi ngô. Nhƣ vậy, thời gian nhiễm khuẩn có ảnh hưởng lớn tới sự thành công của việc chuyển gen, đồng thời ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái sinh của cây. Nhận định này cũng được đưa ra bởi Takava và cs 2010 khi nghiên cứu chuyển cứu chuyển gen vào ngô nhờ A.
tumerfaciens [124]. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhận xét của Ishida và cs (2007) thời gian ngâm khuẩn 30 phút cho hiệu quả chuyển gen tốt nhất [63].
3.4.1.2. Ảnh h ởng của tuổi phôi ngô đến hiệu suất chuyển gen gus và khả năng tạo mô sẹo
Kết quả nghiên cứu, ảnh hưởng của tuổi phôi đến hiệu suất biểu hiện gen gus và khả năng tạo mô sẹo của giống ngô LVN99 đƣợc trình bày ở bảng 3.13.
90
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tuổi phôi đến hiệu suất biểu hiện gen gus và tạo mô sẹo của giống ngô LVN99
Tuổi phôi (ngày)
Hiệu suất biểu hiện gen gus (%)
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
8 59,17 ± 2,17 23,33 ± 1,26
10 56,67 ± 2,05 42,50 ± 1,87
12 44,17 ± 1,73 55,83 ± 2,15
14 26,67 ± 1,52 60,83 ± 2,83
16 17,50 ± 1,09 74,16 ± 2,85
Kết quả bảng 3.13 cho thấy, hiệu suất chuyển gen ở ngô LVN99 giảm dần theo tuổi phôi, còn hiệu suất tạo mô sẹo lại tăng dần theo tuổi phôi. Ở tuổi phôi 8 ngày tuổi hiệu suất chuyển gen là cao nhất 59,17% tuy nhiên hiệu quả tạo mô sẹo lại thấp nhất đạt 23,33%. Còn ở 10 ngày tuổi hiệu suất chuyển gen đạt 56,67%, hiệu suất tạo mô sẹo là 42,50%. Phôi 12 ngày tuổi hiệu suất chuyển gen giảm còn 44,17%, nhƣng hiệu quả tạo mô sẹo lại cao hơn đạt 55,83%. Đến tuổi phôi 16 ngày, hiệu quả chuyển gen thấp hơn hẳn ch còn 17,50% nhƣng hiệu suất tạo mô sẹo lại cao nhất đạt 74,16%. Nhƣ vậy, để hiệu quả chuyển gen, khả năng tái sinh phôi chuyển gen ở giống ngô LVN99 tốt lựa chọn phôi ngô ở 10 - 12 ngày tuổi với k ch thước phôi tương ứng là 0,9 - 1,3 mm. Phôi non đã được sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô. Nhiều công trình đã công bố tuổi phôi ngô có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh, kết quả nghiên cứu này phù hợp với những nhận xét này [6],[40].
3.4.1.3. Xác định ng ỡng chọn lọc mô sẹo của kanamycin
Kết quả nghiên cứu ngƣỡng chọn lọc phôi chuyển gen của kháng sinh kanamycin đƣợc trình bày ở bảng 3.14.
91
Bảng 3.14. Nồng độ kanamycin (mg/l) cho ngƣỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang gen gus
Nồng độ kanamycin (mg/l)
Tỷ lệ tạo mô sẹo, chồi của phôi chuyển gen (%)
Tỷ lệ tạo mô sẹo, chồi của phôi không chuyển gen (%) Sau 7 ngày Sau 15 ngày Sau 7 ngày Sau 15 ngày 0 54,18 ± 1,53 50,69 ± 1,76 59,78 ± 2,32 56,67 ± 2,01 25 50,12 ± 1,96 46,28 ± 1,45 20,16 ± 0,94 17,20 ± 0,89 50 38,36 ± 1,56 25,68 ± 1,72 3,18 ± 0,96 0,82 ± 0,05
75 10,32 ± 1,12 3,86 ± 0,93 0 0
100 1,26 ± 0,09 0 0 0
150 0 0 0 0
Kết quả bảng 3.14 cho thấy, trong môi trường không bổ sung kanamycin thì các phôi không chuyển gen có khả năng tạo mô sẹo và sống sót cao hơn so với các phôi chuyển gen, sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo của phôi không chuyển gen đạt 59,78%, còn phôi chuyển gen đạt 54,18%; sau 15 ngày nuôi cấy tỷ lệ sống sót và tạo chồi của phôi không chuyển gen là 56,67% còn phôi chuyển gen ch đạt 50,69%. Có thể thấy, sự gây tổn thương phôi và thời gian biến nạp ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của phôi. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo mô sẹo của các phôi. Khi bổ sung kanamycin 25 mg/l sau 7 ngày nuôi cấy khả năng tạo mô sẹo của phôi chuyển gen là 50,12% còn phôi không chuyển gen còn 20,16%, sau 15 ngày nuôi cấy tỷ lệ sống sót và tạo chồi của phôi không chuyển gen còn 46,28% trong khi phôi không chuyển gen còn 17,20%. Khi bổ sung kanamycin 50 mg/l sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo của phôi chuyển gen là 38,36%, phôi không chuyển gen là 3,18%, sau 15 ngày nuôi cấy khả năng sống sót và tạo chồi của phôi chuyển gen đạt 25,68% trong khi đó phôi không chuyển gen đã bị chọn lọc rất cao ch còn 0,82%. Khi nồng độ kanamycin tăng lên 75 mg/l thì phôi không chuyển gen không có khả năng tạo mô sẹo, còn phôi chuyển gen thì khả năng tạo mô sẹo và tạo chồi
92
bị ảnh hưởng rõ rệt, tỷ lệ tạo mô sẹo ch còn 10,32% và khả năng sống sót và tạo chồi còn 3,86%. Nồng độ kanamycin tăng lên 100 mg/l và 150 mg/l thì cả phôi chuyển gen và không chuyển gen đều không có khả năng tạo mô sẹo. Nhƣ vậy, nồng độ kanamycin cho ngƣỡng chọn lọc phôi chuyển gen là 50mg/l.
Từ các kết quả nghiên cứu trên, quy trình chuyển gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens chủng C58 đã đƣợc xây dựng và tối ƣu. Mật độ vi khuẩn A. tumefaciens th ch hợp ở giá trị OD660nm=0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tối ƣu là 30 phút, AS bổ sung là 150 M và tuổi phôi từ 10 - 12 ngày tuổi tương ứng với k ch thước 0,9 - 1,3 mm) là tuổi phôi tối ưu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh. Ngƣỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đối với phôi chuyển gen là 50 mg/l.
Kết quả tái sinh và chuyển thành công gen gus ở giống ngô LVN99 là cơ sở cho nghiên cứu chuyển gen ZmDEF1 vào giống ngô Việt Nam phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt.