Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
3.3.1. Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1
Trình tự nucleotid gen ZmDEF1 của giống SL (giống ngô địa phương có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất trong các giống nghiên cứu đƣợc sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật thông qua A. tumefaciens. Vector chuyển gen mang gen ZmDEF1 được phát triển như mô tả ở hình 2.3 phương pháp nghiên cứu). Sản phẩm RT-PCR tinh sạch của giống SL và vector pDON201-SLHEP-HA đƣợc xử lý đồng thời bởi hai enzyme SalI/HindIII. Khi xử lý hai enzyme SalI/HindIII vector pDON201-SLHEP-HA cắt đoạn HA và vị tr này đƣợc gắn sản phẩm RT-PCR khi đã xử lý hai enzyme SalI/HindIII nhờ enzyme nối thu đƣợc pDON201-SLHEP-ZmDEF1. Vector pDON201-SLHEP-ZmDEF1 có 2 vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, ZmDEF1 cần chuyển đƣợc xen vào giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn.
Cấu trúc pDON201-SLHEP-ZmDEF1 tham gia phản ứng LR với pBetaPhaso-dest có trình tự attR trao đổi với attL để tạo vector chuyển gen nhị thể pBetaPhaso-ZmDEF1 và dòng hóa vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh. Để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới đƣợc tạo thành đúng nhƣ mong đợi thì cần phải thực hiện phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi ZmDEF1F-SalI /ZmDEF1R-HindIII. Những dòng khuẩn lạc dương t nh với phản ứng colony-PCR đƣợc sử dụng tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhaso-ZmDEF1 và đƣợc cắt bởi enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra sự có mặt của ZmDEF1 trong vector tái tổ hợp (Hình 3.8A). Kết quả cắt plasmid và cắt bởi enzyme giới hạn HindIII thu đƣợc 3 băng DNA với k ch thước khoảng 1,85 kb, 2,4 kb và 11,5 kb. Các k ch thước này hoàn toàn phù hợp với t nh toán theo lý thuyết.
75
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng HindIII (A) và hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII từ khuẩn lạc A. tumefaciens CV58 (B)
(M1: Thang DNA chuẩn 1kb; M2: Thang DNA chuẩn 1kb plus; 1, 2: Sản phẩm cắt HindIII plasmid tái tổ hợp của 2 dòng khuẩn lạc; 1, 2, 3: Sản phẩm PCR của 3 dòng khuẩn lạc A.tumefaciens; (-):Đối chứng âm dòng khuẩn lạc không biến nạp; (+): Đối chứng dương sản phẩm PCR gen ZmDEF1; ĐC: plasmid tái tổ hợp không cắt bởi HindIII).
Sau khi kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens CV58 bằng kỹ thuật xung điện. Sản phẩm biến nạp sau khi nuôi phục hồi trong LB lỏng được cấy trải trên môi trường L đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và rifamycine. Sau khi nuôi 48 giờ ở 28oC, các khuẩn lạc xuất hiện trên mặt thạch đƣợc colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII (Hình 3.8 B) cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 đều mang vector chứa cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 và chúng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật qua lây nhiễm.
Một vector chuyển gen thực vật hoàn ch nh không ch chứa gen cần chuyển, bảo đảm yêu cầu tối thiểu của một vector chuyển gen mà cần chú ý đến một số yếu tố quan trọng nhƣ: các thành phần cần thiết cho hoạt động của gen ngoại lai trong tế bào chủ, gen đi kèm gen đ ch giữ vai trò làm ch thị cho chọn lọc thể tái tổ hợp, khả năng khởi động phiên mã của gen đ ch trong tế bào chủ,... Gen
76
đ ch đƣa vào tế bào chủ, ngoài trình tự mã hoá ra cần phải có những yếu tố cần thiết giúp gen hoạt động nhƣ một đơn vị chức năng độc lập trọn vẹn, nhƣ: yếu tố khởi đầu và kết thúc phiên mã, yếu tố xác định vị tr hướng đ ch cho sản phẩm hoạt động của gen chuyển,... Để khởi động phiên mã gen đ ch là vai trò của promoter. Trong vector pBetaPhaso-ZmDEF1 (Hình 3.9), sử dụng promoter Phasoline biểu hiện đặc trƣng ở hạt [83], cùng với trình tự 2S2 để tập trung protein vào nội nhũ hạt với mục đ ch tăng cường biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở hạt ngô để nâng cao khả năng kháng mọt. Bởi mọt hại ngô tấn công và sử dụng hạt ngô là nguồn thức ăn, các bộ phận khác của cây ngô mọt hại không tấn công.
Trình tự kết thúc trong cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 là gen arc5-1 gen này vừa có chức năng tăng cường biểu hiện gen chuyển và vừa có chức năng là trình tự kết thúc.
Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1
(Phaso Pro: Promoter Phaseolin; attB1 và attB2: Vị trí phản ứng trao đổi LR;
LB: bờ trái của T-DNA; RB: Bờ phải của T-DNA;nptII: Trình tự kháng kanamycin; gen arc5-1: có vai trò tăng cường biểu hiện và kết thúc).
Trong chuyển gen thực vật, giai đoạn chọn lọc nguyên liệu ngay sau biến nạp gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens có vai trò rất quan trọng để có thể loại trừ đƣợc nguyên liệu không mang gen chuyển để dễ dàng cho phân tích cây chuyển gen về sau. Sự chọn lọc này thường nhờ những gen ch thị được gắn vào vector, thường sử dụng gen chọn lọc kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ là nhờ hoạt tính kháng của sản phẩm gen đ nh kèm. Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 thiết kế sử dụng hệ thống gen chọn lọc là gen kháng kháng sinh kanamycine (ntpII) (Hình 3.9), để giúp chọn lọc nguyên liệu chuyển gen trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh kanamycine.
Chuyển gen đƣợc coi là thành công khi gen chuyển biểu hiện ở cây chuyển gen và protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện chức năng sinh học. Vì vậy giai đoạn để kiểm tra gen chuyển có hoạt động phiên mã, hay dịch mã hay không là một vấn đề rất quan trọng. Do đó, trong cấu trúc mang gen chuyển cũng gắn trình tự để có thể
77
xác định đƣợc sự có mặt của protein ngoại lai. Trong cấu trúc chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 đƣợc gắn đuôi c-myc để có thể thực hiện lai Western để nhận biết đƣợc protein tái tổ hợp.
3.3.2. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá nhờ A.