Chương 2. VẬT LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Hỗn hợp gồm 100μl tế bào khả biến A. tumefaciens CV58 và 2 μl vector pBetaPhaso-ZmDEF1 trong cuvette đƣợc xung điện với thông số 400 Ω, 2,5 kV, 25 μF rồi đưa vào nước đá, sau 5 phút bổ sung 200 μl LB lỏng và đảo nhẹ. Chuyển hỗn hợp đã xung điện sang ống eppendorf 2 ml, nuôi phục hồi ở 28oC, lắc 200 vòng/phút trong 2 giờ. Cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường L đặc có kháng sinh spectinomycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ 28oC trong 48 giờ. Sau đó tiến hành chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pBetaPhaso-ZmDEF11 bằng kỹ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII. Dòng vi khuẩn dương t nh với colony - PCR được nuôi trong LB lỏng, giữ chủng và dùng cho lây nhiễm trong chuyển gen.
Nuôi chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58 mang gen ZmDEF1 trên môi trường L đặc có bổ sung spectinomycin (50 mg/l) và rifamicin (50 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 280 C trong 48 giờ.
Nuôi lỏng lần 1, 2: chọn khuẩn lạc đã mọc ở trên môi trường L đặc tiếp tục nuôi cấy trên LB lỏng. Nuôi lắc 2000 vòng/phút ở 280C trong 16 giờ để nuôi
50
phục hồi. Tiếp tục lấy dung dịch nuôi lỏng lần 1 (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi trong 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh spectinomycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l để nuôi chọn lọc.
Tạo dung dịch khuẩn huyền phù: li tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2, loại bỏ dịch nổi, hòa tan cặn trong MS lỏng và đo mật độ khuẩn ở OD660nm. Dung dịch khuẩn này dùng để biến nạp vào cây thuốc lá và cây ngô chuyển gen.
2.3.4.2. Tạo dòng cây thuốc lá chuyển gen mang gen ZmDEF1
Phương pháp chuyển cấu trúc chứa gen ZmDEF1 vào mảnh lá cây thuốc lá được thực hiện theo mô tả của Topping - 1998 [129] với các bước cơ bản:
Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp: Hạt thuốc lá sau khi khử trùng cho nảy mầm trên môi trường MS (Bảng 2.10). Sau 3 - 5 tuần cây con phát triển 4 - 5 lá thật thì sử dụng lá để biến nạp gen chuyển. Các mảnh lá được cắt với k ch thước khoảng 1 cm2 và được cảm ứng trên môi trường tái sinh trong 48 giờ.
Biến nạp: Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trường MS được dùng biến nạp. Sau 30 phút lây nhiễm trong dịch khuẩn với mật độ khuẩn OD660nm = 0,6 - 0,8, chuyển các mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường MS không chứa kháng sinh để đồng nuôi cấy trong tối 2 ngày.
Tái sinh đa chồi: Sau 2 ngày, tiến hành rửa khuẩn ngoại vi bằng cách ngâm các mảnh lỏ biến nạp trong ẵMS + cefotaxim 400 mg/l, sau đú thấm khụ và chuyển cỏc mảnh lá sang môi trường GM bổ sung kanamycin 50 mg/l và cefotaxim 400 mg/l.
Chọn lọc và kéo dài chồi: Sau 3 - 4 tuần các cụm chồi hình thành đƣợc tách và chuyển sang môi trường MS có bổ sung kanamycin 50 mg/l và cefotaxim 400 mg/l.
Ra rễ: Sau 1 - 2 tuần tiếp theo những chồi sống sót và phát triển đƣợc thành cây hoàn ch nh được cấy lên môi trường RM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Ra bầu và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn ch nh với 3 - 4 lá thật thì cho ra bầu trấu: cát (tỷ lệ 1 : 1). Cây phát triển với 4 - 5 lá thật thì chuyển ra trồng trong nhà lưới.
51
Bảng 2.10. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá Hỗn hợp Thành phần cho 1 lít dung dịch
Stock I KNO3 1,9 g + KH2PO4 0,17 g + NH4NO3 1,65 g + MgSO4 0,37 g Stock II CaCl2 0,44 g
Stock III H3BO3 6,2 mg + MnSO4.4H2O 22,3 mg + CoCl2.6H2O 0,025 mg + CuSO4.7H2O 0,025 mg + ZnSO4.7H2O 8,6 mg + Na2MoO4.2H2O 0,25 mg + KI 0,83 mg
Stock IV FeSO4 27,8 mg + Na2EDTA 37,3 mg
Stock V Myo-Inositol 100 mg + thiamine HCl 0,1 mg + pyridoxine HCl 0,5 mg + nicotic acid 0,5 mg + glycine 2 mg
MS 20ml stock I + 10ml/stock (II, III, IV, V) + glucose 35g + agarose 8g
ẵMS 10ml stock I + 5ml/stock (II, III, IV, V) GM MS + BAP 1mg + sucrose 30 g + agar 8 g RM MS + IBA 0,1 mg + sucrose 30 g + agar 8 g
* Ghi chú: Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ngày.
2.3.4.3. Chuyển gen gus vào phôi non ngô
Phương pháp chuyển gen gus vào phôi non giống ngô LVN99 nhờ A.
tumefaciens đƣợc tiến hành dựa trên nghiên cứu của Frame và cs (2002) [39], Trần Thị Lương và cs 2014 [6] và thành phần môi trường tái sinh bảng 2.11.
Chuẩn bị nguyên liệu chuyển gen: Bắp non đƣợc thu sau ngày thụ phấn từ 8 - 16 ngày, bóc bỏ 3 - 5 lớp vỏ ngoài bắp, mỗi lần bóc một lớp cần khử trùng bề mặt bắp ngô bằng cồn 70%. Phôi đƣợc tách trong điều kiện vô trùng. Tách hạt khỏi bắp ngô và dùng dao cắt một phần nhỏ của hạt phía có dây treo phôi, tránh cắt ngang phôi, bóp nhẹ để đẩy phôi tách ra khỏi hạt.
52
Bảng 2.11. Thành phần môi trường tái sinh cây ngô chuyển gen Hỗn hợp Thành phần cho 1 lít dung dịch
Stock I (N1) CaCl2.2 H2O 16,6 g
Stock II (N2) KNO3 283g + KH2PO4 40 g + (NH4)2SO4 46,3 g + MgSO4.7H2O 18,5g
Stock III (N3) H3BO3 320 mg + MnSO4.4H2O 660 mg + CuSO4.7H2O 5 mg + ZnSO4.7H2O 300 mg + Na2MoO4.2H2O 50 mg + KI 160 mg Stock IV (N4) FeSO4.7H2O 5,56 g+ Na2EDTA 7,46 mg
Stock V (N5) Thiamine HCl 200 mg + pyridoxine HCl 100 mg + nicotic acid 100 mg + glycine 8 g
N6 10ml stock I + 10 ml stock II + 5ml stock (III, IV, V) + agarose 8g
A1 A1: N6 + 2,4-D 2 mg + AgNO3 10 mg + L-proline 1,15 g + casein hydrolysate 100 mg + sucrose 20 g + glucose 10 g + acetosyringone 150 àM
A2 N6 + 2,4-D 2 mg + AgNO3 10 mg + L-proline 1,15 g + casein hydrolysate 100 mg + sucrose 20 g + glucose 10 g + cefotaxime 500 mg + kanamycin 50 mg
A3 N6 + 2,4-D 2 mg + AgNO3 10 mg + L-proline 1,15 g + casein hydrolysate 100 mg + sucrose 20 g + glucose 10 g + cefotaxime 150 mg + kanamycin 25 mg
A4 N6 + 2,4-D 2 mg + AgNO3 10 mg + L-proline 1,15 g + casein hydrolysate 100 mg + sucrose 20 g + glucose 10 g
A5 N6 + BAP hoặc kinetin 2 mg + sucrose 60 g A6 ẵ N6 + NAA (IBA) 0,5 mg + sucrose 30 g
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens: Nuôi chủng A. tumerfaciens C58 chứa gen gus trên môi trường L đặc có bổ sung kanamycin (50 mg/l) và
53
rifamycin (50 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 28oC, trong 48 giờ. Chọn khuẩn lạc mọc trên môi trường L đặc và nuôi cấy trong LB lỏng với chế độ lắc 2.000 v/p ở 28oC trong 16 giờ. Lấy dung dịch nuôi lỏng lần 1 này (1 ml dung dịch khuẩn) nuôi trong 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin. Ly tâm dung dịch nuôi lỏng lần 2, loại bỏ dịch nổi rồi hòa tan cặn trong môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) [7] lỏng và pha loãng dịch với mật độ khuẩn OD660nm.
Nhiễm vi khuẩn và đồng nuôi cấy: Phôi ngô non đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong 5 - 40 phút, bổ sung acetosyringone 50 - 200 M sau đó thấm khô, cấy trên môi trường đồng nuôi cấy A1 và phôi được nuôi trong tối 3 ngày.
Diệt khuẩn, nuôi cấy và chọn lọc mô sẹo chuyển gen: Phôi sau khi gây nhiễm đƣợc rửa bằng dung dịch cefotaxim 500 mg/l. Thấm phôi vào giấy thấm và cấy trên môi trường A2 để chọn lọc mô sẹo chuyển gen với nồng độ kháng sinh kanamycine từ 0 – 150 mg/l. Sau 1 tuần, chuyển phôi sang môi trường chọn lọc A3 để chọn lọc mô sẹo chuyển gen. Sau một tuần nuôi cấy, chọn các mô sống sót chuyển sang môi trường phục hồi A4 và nuôi cấy trong tối để mô sẹo đạt k ch thước lớn hơn.
Tái sinh cây từ mô sẹo chuyển gen, tạo rễ và đưa cây ra đất: Các mô sẹo sau khi xử lý chuyển gen và chọn lọc được đưa vào môi trường tái sinh A5. Sau khi chồi được tái sinh sẽ chuyển sang môi trường tạo rễ A6 và nuôi trong điều kiện 28oC, ánh sáng 8 giờ/ngày. Sau 2 đến 3 tuần chồi đƣợc tạo rễ đầy đủ. Cây con hoàn ch nh sẽ đƣợc cho ra huấn luyện ở bầu với giá thể Tribat có chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, muối khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của cây. Sau 7 đến 10 ngày huấn luyện, các cây được đưa trồng ra nhà lưới [9].
Nhuộm biểu hiện tạm thời gen gus: Thực hiện theo phương pháp của Jefferson và cs (1987) [44]. Các phôi sau khi nhiễm khuẩn, sau 3 ngày nuôi tối đƣợc nhuộm với dung dịch 5-bromo-4- chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc , để 8 - 12 giờ trong tối ở nhiệt độ 370C. Sau đó rửa bằng cồn 70% ba lần và quan sát dưới kính hiển vi. Những vùng biểu hiện gen gus có màu xanh lam.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens, nồng độ AS, thời gian gây nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở ngô.
54
Dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens CV58 chứa gen gus nuôi lỏng lần 2, ly tâm loại bỏ dịch nổi, hòa tan cặn trong môi trường MS lỏng và pha loãng dịch rồi đo mật độ vi khuẩn OD660nm ở các giá trị: 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0. Sau đó tiến hành nhiễm khuẩn với phôi giống ngô LVN99 12 ngày tuổi trong 30 phút, bổ sung 100
M AS ở các mật độ vi khuẩn khác nhau để xác định mật độ khuẩn tối ƣu. Sau đó ở mật độ khuẩn tối ƣu đƣợc sử dụng biến nạp phôi ngô 12 ngày tuổi trong 30 phút, bổ sung các nồng độ 0 M, 50 M, 100 M, 150 M và 200 M AS để xác định nồng độ AS tối ƣu. Ở mật độ khuẩn tối ƣu, nồng độ AS tối ƣu đƣợc dùng để biến nạp vào phôi ngô 12 ngày tuổi trong các khoảng thời gian ngâm khuẩn: 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút để xác định thời gian ngâm khuẩn tối ƣu cho chuyển gen. Sau đó sẽ tiến hành biến nạp ở mật độ khuẩn, nồng độ AS, thời gian ngâm khuẩn tối ƣu cho chuyển gen vào phôi ngô non ở các ngày tuổi: 8 ngày, 10 ngày, 12 ngày, 14 ngày và 16 ngày tuổi. Các phôi sau 3 ngày đồng nuôi cấy tiến hành nhuộm phôi để xác định hiệu suất chuyển gen, còn các phôi để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo sau đồng nuôi cấy 3 ngày, đƣợc diệt khuẩn bằng 500 mg/l cefotaxim và chuyển sang môi trường tạo mô sẹo môi trường A2, không bổ sung kháng sinh).
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định ngƣỡng chọn lọc mô sẹo của kanamycin Phôi giống ngô LVN99 ở ngày tuổi tối ƣu cho chuyển gen, chia thành lô thí nghiệm (lô chuyển gen đƣợc biến nạp ở mật độ khuẩn, nồng độ AS, thời gian ngâm khuẩn tối ƣu cho chuyển gen và lô đối chứng là không biến nạp khuẩn (không chuyển gen). Cả hai lô này sau khi được nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy A1, được chuyển sang nuôi trên môi trường chọn lọc A2, bổ sung kanamycin với nồng độ khác nhau 0, 25, 50, 75, 100, 150 mg/l , để xác định nồng độ cho ngƣỡng chọn lọc phôi chứa gen chuyển của kanamycin. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần biến nạp 40 phôi ngô.
2.3.4.4. Chuyển gen ZmDEF1 vào phôi non ngô
Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen ZmDEF1 vào phôi ngô non giống LVN99 và LC1 được mô tả tổng quát trong (Hình 2.4) và thành phần môi trường tái sinh bảng 2.11.
55
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non của ngô 2.3.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.3.5.1. Kiểm tra sự c mặt của gen chuyển Kỹ thuật PCR
Tách chiết DNA tổng số từ lá cây chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII để xác định sự có mặt của gen ZmDEF1 trong cây chuyển gen. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Kỹ thuật lai Southern
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển và số bản sao mà gen chuyển có mặt trong hệ gen cây chuyển gen, chúng tôi thực hiện lai Southern theo mô tả của
56
Southern (1975) [121] theo các bước cơ bản sau:
(1) Tách chiết DNA tổng số của cây chuyển gen cần phân t ch, đạt nồng độ 10 àg mẫu DNA tổng số. Sau đú tiến hành tinh sạch DNA tổng số để phục vụ cho phản ứng cắt enzyme giới hạn.
(2) DNA tổng số đƣợc tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt enzyme giới hạn với thành phần và điều kiện phản ứng ở bảng 2.12.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng cắt DNA tổng số bằng SalI STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 Enzyme SalI 10u/àl 5
2 Buffer 10 X 5
3 DNA 30 àg /μl 30
4 Nước khử ion -
Tổng 50
Điều kiện phản ứng: 37oC để qua đêm
3 Điện di sản phẩm cắt DNA tổng số trên gel agarose 1%, ở điện thế thấp trong thời gian dài (6 giờ).
(4) Chuyển lên màng nitrocellulose hay còn gọi là blotting: Màng lai đƣợc cắt vừa với bản gel và đặt dưới bản gel, một cột giấy được đặt ph a dưới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch chuyển màng thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc đƣợc cấp từ khay đựng buffer. Quá trình chuyển màng hoàn tất sau 3 giờ với bản gel dày dưới 5 mm, hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai đƣợc rửa với dung dịch 2X SSC và tiến hành lai với mẫu dò.
(5) Tổng hợp mẫu dò (probe): Nhân dòng trình tự gen npII từ plasmid mang gen nptII bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu (nptII-F: 5‟-G A G G C T A T T C G G C T A T G A C T G-3‟ và nptII-R: 5‟-A T C G G G A G C G G C G A T A C C G T A-3‟ .
Mẫu PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm này đƣợc tinh sạch bằng kít tinh sạch PCR đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp
57
mẫu dò theo hướng dẫn của bộ Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit.
(6) Tiền lai và lai: Màng lai đƣợc cố định bằng dung dịch tiền lai (200àl/cm2) trong 4h ở 44°C trong ống lai. Sau đú đổ bỏ dung dịch tiền lai, bổ sung dung dịch lai (60 àl/cm2 , lai qua đờm ở 44°C.
(7) Rửa màng: Màng lai đƣợc rửa 2 lần với đệm rửa 2x ở nhiệt độ phòng, 1 lần với đệm rửa 1x ở 65°C trong 15 phút, 2 lần với đệm rửa 0.1x ở 65°C trong thời gian 15 phút.
(8) Hiện màng: Phức hợp enzyme Streptavidin-AP có khả năng gắn bám đặc hiệu với gốc biotin trên mẫu dò. Ngoài ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng phân hủy BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine salt) thành hợp chất có màu t m đen. Nhờ vậy có thể phát hiện mẫu dò gắn với đoạn DNA cần nghiên cứu trên màng lai. Quy trình này đƣợc thực hiên theo hướng dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic Detection Kit (hãng Themosience).
2.3.5.2. Phân tích cây chuyển gen bằng RT-PCR
Tách chiết RNA tổng số từ hạt cây chuyển gen bằng kít Trizol Reagents;
tổng hợp cDNA bằng kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII để khuếch đại cDNA gen ZmDEF1 nhằm xác định sản phẩm phiên mã của gen chuyển. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.3.5.3. Phân tích cây chuyển gen bằng real-time RT-PCR
Mức độ phiên mã của gen ZmDEF1 ngoại lai đƣợc xác định bằng phản ứng Real-time RT-PCR với chất màu gắn huỳnh quang SYBR Green I của hãng Roche và house - keeping gene actin. Quy trình gồm các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết RNA tổng số ở hạt cây chuyển gen theo k t Trizol Reagents; 2 Định lƣợng 1000ng RNA tổng số/mẫu bằng máy NanoDrop đƣa vào phản ứng tổng hợp cDNA theo kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis; (3) Thực hiện phản ứng trên máy Real-time RT-PCR của hãng Roche (LightCycler®480) với thành phần ở bảng 2.13 theo chu trình nhiệt các bước ở bảng 2.14; 4 T nh toán xác định kết quả dựa vào phương pháp 2-∆∆Ct của Livak [74] định lượng số bản sao cho gen đ ch Tg, target gene) và gen tham chiếu (Ref - reference gene).
58
Bảng 2.13. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) Master mix for Real-time 2X 12,5
Primer F 10 pmol/μl 0,5
Primer R 10 pmol/μl 0,5
cDNA 500 ng/μl 2,0
Nước khử ion - 4,5
Tổng thể tích: 20
Bảng 2.14. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian Tốc độ thay đổi nhiệt (oC /s)
Biến tính: (1 chu kỳ) 95 10 phút 20
Khuếch đại và định lƣợng:
(45 chu kỳ)
95 10 giây 20
58 10 giây 20
72 20 giây 20
Phân tích nhiệt độ chảy:
(1 chu kỳ)
95 0 giây 20
65 1 phút 20
95 0 giây 0,1
Kết thúc: (1 chu kỳ) 40 30 giây 20
2.3.5.4. Phân tích cây chuyển gen bằng lai Western
Kiểm tra hoạt động của gen chuyển qua sự có mặt của protein ZmDEF1 bằng lai Western với các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết protein tổng số (nghiền 0,5 g hạt trong nitơ lỏng và hoà tan trong 1 ml PBS + Tween 0,05%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ; 2 Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide - SDS 10%; (3) Chuyển protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy Pierce G2 Fast Blotter (25V, 1,3 mA trong 20 phút); (4) Màng chứa kháng nguyên c-myc đƣợc phủ bằng 5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween 0,05% trong 16 giờ; (5) Lai kháng thể 1 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS 5% sữa tách béo có chứa kháng thể c-myc với độ pha loãng 700 lần, lắc trong 3
59
giờ ở nhiệt độ phòng); (6) Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS + 5% sữa tách béo có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse Radish Peroxidase) trong 2 giờ); (7) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất TM 3,3‟,5,5‟-tetramethyl benzidine) hoặc DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride), hiển thị kết quả dưới ánh sáng thường.
Hiệu suất chuyển gen ở mỗi giai đoạn phân t ch đƣợc xác định bằng công thức:
Hiệu suất chuyển gen (%) = Số cây mang gen chuyển
Tổng số mẫu biến nạp × 100.
2.3.5.5. Đánh giá khả năng ức chế α-amylase của protein ZmDEF1 tái tổ hợp Xác định hoạt độ α-amylase
Khả năng ức chế hoạt độ α-amylase của mọt đã được xác định theo phương pháp Bernfeld (1955) [22]. Ấu trùng mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch. đƣợc nghiền trong đá với đệm phosphate 0,2 M, pH 6,8 rồi ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó thu dịch có chứa α-amylase. Tinh bột 1% đã đƣợc sử dụng làm cơ chất phản ứng xác định hoạt độ α-amylase. Hỗn hợp có chứa α-amylase từ ấu trựng mọt và 100 àl protein chiết xuất từ hạt cõy chuyển gen và khụng chuyển gen và tinh bột 1% đƣợc ủ trong 30 phút ở 30oC, sau đó bổ sung 3,5- dinitrosalicilic acid để ngừng phản ứng. Hỗn hợp để ở 100oC trong 10 phút để các phản ứng dừng lại hoàn toàn. Sau đó hỗn hợp được đo ở bước sóng 530 nm để xác định hoạt độ của α-amylase của ấu trùng mọt ngô. Hoạt độ của α-amylase đƣợc tính bằng lƣợng tinh bột đƣợc phân hủy trong 30 phút ở 30oC ĐVHĐ/mg bởi α- amylase. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
Định tính hoạt độ α - amylase
Thành phần hỗn hợp dịch: agarose 2%, tinh bột 1%, 100 àl dịch chiết protein hạt các dòng cây chuyển gen và không chuyển gen và nước cất. Cho hỗn dịch vào bình tam giác đun cách thuỷ cho tan thạch, đổ vào đĩa petri dày 4 mm để nguội, đục lỗ đường kớnh 9 mm. Bổ sung 100àl dịch chiết chứa α-amylase vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24 giờ.
Nhuộm bằng lugol trong 5 phút và tráng lại bằng NaCl 1N.