Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 65 1. Đặc điểm của gen ZmDEF1 cDNA phân lập từ các giống ngô nghiên cứu
3.2.2. Đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ DNA
Giống ngô địa phương SL và giống ngô lai LVN99 gieo đến khi được 3 - 4 lá thật tiến hành tách DNA tổng số từ mô lá. Gen ZmDEF1 đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI /ZmDEF1R-HindIII. Kết quả kiểm tra bằng điện di trên gel agarose cho thấy xuất hiện một băng DNA đặc hiệu có k ch thước khoảng 0,35 kb. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT, biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α, chọn lọc dòng mang gen bằng phản ứng bằng colony - PCR, cắt bằng BamHI để kiểm tra sau đó tách plasmid để xác định trình tự gen ZmDEF1.
Kết quả xác định trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA cho kết quả giống LVN99 và giống ngô địa phương SL có chiều dài 345 bp (Hình 3.5).
Hai trình tự gen của hai giống SL và LVN99 đã đƣợc Ngân hàng gen quốc tế chấp nhận và đăng với các mã số: LN809934 và LN878138.
71
Hình 3.5. Trình tự gen ZmDEF1 của giống ngô địa phương SL và giống ngô lai LVN99 phân lập từ DNA
So sánh trình tự gen ZmDEF1 phân lập từ DNA và phân lập từ cDNA cho phép tìm ra đặc điểm cấu trúc của gen. Đồng thời làm căn cứ để phân tích sự có mặt của gen chuyển trong hệ gen cây ngô chuyển gen. So sánh trình tự gen ZmDEF1 phân lập từ cDNA và DNA của giống ngô địa phương SL và LVN99 cho thấy gen có cấu tạo gồm 2 exon xen kẽ bởi intron có chiều dài là 102 bp (Hình 3.6)
Intron– 102 bp
Exon1- 64 bp Exon2- 179 bp
1 65 166 345
Hình 3.6. Sơ đồ cấu trúc của gen ZmDEF1 của ngô
Nhƣ vậy, kết quả phân t ch này là cơ sở sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII để phân biệt cây ngô mang gen chuyển ZmDEF1 với cây không chuyển gen bằng phản ứng PCR. Đối với cây ngô mang gen chuyển, cặp mồi này có thể khuếch đại ZmDEF1 nội tại cho k ch thước đoạn DNA là 345 bp, đồng thời khuếch đại cả ZmDEF1 ngoại lai cho k ch thước đoạn DNA là 243 bp. Cây không chuyển gen ch khuếch đại đƣợc một sản phẩm là gen ZmDEF1 nội tại cho k ch thước đoạn DNA là 345 bp.
So sánh hai trình tự gen ZmDEF1 phân lập từ DNA của giống ngô địa phương SL và giống ngô lai LVN99 để thấy được sự đa hình gen ZmDEF1, kết
72
quả so sánh hai trình tự thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Sự sai khác về trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA của giống ngô địa phương SLvà giống ngô lai LVN99
STT Vị trí SL1 LVN99 Vùng sai khác
1 43 C A Exon1
2 53 T C Exon1
3 150 G A Intron
4 203 G A Exon 2
5 263 C T Exon 2
6 297 C T Exon 2
Sự sai khác 6 vị trí nucleotide giữa giống Sơn La và LVN99 xảy ra trên cả intron và exon. Trên exon1 có hai điểm sai khác (vị trí 43, 53); intron chứa một điểm sai khác (vị tr 150 , exon 2 có 3 điểm sai khác (vị trí 203, 263 và 297). Sai khác ở intron không làm thay đổi vùng mã hoá, do vậy không làm thay đổi các amino acid trong chuỗi polypeptid, tuy nhiên nó góp phần làm tăng sự đa hình gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu.
3.2.3. Sự đa dạng về trình tự v ng m hóa gen ZmDEF1 ở ngô
Để xác định mức độ đa dạng trong trình tự nucleotide của gen ZmDEF1, thực hiện so sánh vùng mã hoá của gen ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế (Bảng 3.8).
Bảng 3.8. Một số trình tự gen ZmDEF1 để phân tích đa dạng di truyền STT Mã số NCBI Năm công bố Quốc gia Tác giả
1 LN878139 2015 Việt Nam Vi,T.X.T và cs
2 LN650980 2014 Việt Nam Vi,T.X.T và cs
3 LN650981 2014 Việt Nam Vi,T.X.T và cs
4 LN650982 2014 Việt Nam Vi,T.X.T và cs
5 LN650983 2014 Việt Nam Vi,T.X.T và cs
6 NM001153529 2013 Mỹ Schnable PS
73
7 JF797205 2011 Trung Quốc Wang B.S
8 EU531731 2009 Italia Padovan,L.,
9 EU961911 2008 Mỹ Alexandrov,N.N.,
10 EU958657 2008 Mỹ Alexandrov,N.N
11 EU952901 2008 Mỹ Alexandrov,N.N.,
12 EF200066 2007 Trung Quốc Wang,B.,
13 DQ244829 2006 Trung Quốc Jia,J.,
14 BT009185 2003 Mỹ Tingey,S.V.
Kết quả đánh giá sự đa dạng của trình tự gen ZmDEF1 của các trình tự nghiên cứu đƣợc thể hiện trên sơ đồ hình cây ở hình 3.7.
Sơ đồ hình cây ở hình 3.7 cho thấy, 14 trình tự vùng mã hóa của gen ZmDEF1, chia sơ đồ thành hai nhóm lớn, với khoảng cách di truyền là 2,8%.
Nhóm lớn thứ nhất, gồm 13 trình tự gen và chia thành bốn nhóm nhỏ. Nhóm nhỏ thứ nhất, gồm các trình gen có quan hệ gần gũi với nhau, bao gồm các trình tự LN650982, LN650980, LN650983, LN650981, LN650979 phân lập ở Việt Nam.
Nhóm nhỏ thứ 2 gồm hai trình tự JF797205 và EF200066 đƣợc phân lập cùng ở Trung Quốc. Nhóm nhỏ thứ 3 gồm 5 trình tự DQ244829, BT009185, EU958657, NM001153529, EU961911 và nhóm nhỏ thứ tƣ ch có một trình tự là EU952901.
Nhóm lớn thứ hai, ch duy nhất một trình tự gen mang mã EU531731 (Italia).
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn mã hoá của gen ZmDEF1