Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường, SARS, ebola v.v.... Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang tính cầm cự. Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T 3. Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người. Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính 2 tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v.... mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn. Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”.
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ Mã số: ĐH2014-TN05-01 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Huy Hoàng THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ Mã số: ĐH2014-TN05-01 Xác nhận tổ chức chủ trì (ký họ tên, đóng dấu) THÁI NGUYÊN - 2017 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) i DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI I Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu STT Họ tên Đơn vị công tác ThS Nguyễn Huy Hoàng Đại học Y Dược - ĐHTN PGS TS Lê Văn Sơn Viện Công nghệ Sinh học TS Phạm Bích Ngọc Viện Công nghệ Sinh học TS Nguyễn Thu Hiền Đại học Y Dược - ĐHTN TS Nguyễn Thị Thu Ngà Đại học Sư phạm - ĐHTN II Đơn vị phối hợp STT Tên đơn vị Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Họ tên người đại diện PGS TS Chu Hoàng Hà ii MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI I MỤC LỤC II DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH VII THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VII MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukine 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nước 1.3 Nghiên cứu biểu interleukin tái tổ hợp thuốc 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu .15 2.1.1 Vật liệu thực vật 15 2.1.2 Các chủng vi khuẩn 15 2.1.3 Các gene vector 15 2.1.4 Hóa chấ t và thiế t bi ̣máy móc 15 2.1.5 Các loại mồi sử dụng nghiên cứu 16 2.1.6 Điạ điể m và thời gian nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin tối ưu biểu thực vật 18 2.2.2 Thiết kế mồi 19 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin tái tổ hợp 19 2.2.5 Phân tích các dòng chuyể n gen bằ ng kỹ thuật sinh ho ̣c phân tử 24 2.2.6 Tinh protein tái tổ hợp interleukin 26 2.2.7 Đánh giá hoạt tính protein interleukin tái tổ hợp 28 2.2.8 Phân tích thố ng kê kế t quả thực nghiệm 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Thay đổi mã di truyền gene interleukin tối ưu biểu thực vật30 3.2 Thiết kế vector chuyển gene interlukin tái tổ hợp vào thuốc 32 3.2.1 Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc100xELP 34 3.3 Biểu protein interleukin tái tổ hợp thuốc phương pháp Agro-infiltration 36 3.4 Đánh giá biểu tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp 39 3.5 Phân tích định lượng tinh protein IL-7 tái tổ hợp 39 3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp 44 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 4.1 Biểu tạm thời protein interleukin tái tổ hợp thuốc 46 4.2 Tăng cường biểu protein thực vật với ELP tinh mITC 47 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 50 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 68 iii DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 35S Promoter CaMV 35S A tumefaciens Agrobacteria tumefaciens bp Base pairs Cặp bazơ BSA bovine serum albumin Dung dịch protein chuẩn cDNA Complementary DNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic E.Coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic Enzym-linked Kỹ thuật phát kháng nguyên immunosorbent assay mẫu xét nghiệm ELISA ELP elastin-like peptide hIL-7 human interleukin interleukin người HRP Horseradish Peroxidase Horseradish Peroxidase IFN Interferon IL Interleukin IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography kb Kilo base kDa Kilo danton mITC membrane-based Inverse Transition Cycling Sắc kí ion cố định kim loại Đảo ngược theo màng OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RNase Ribonuclease Enzyme ribonuclease rpm Revolutions per minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T WT Wild type Chủng hoang dại iv DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Một số cytokine tái tổ hợp biểu thực vật 11 2.1 Trình tự mồi sử dụng đề tài 16 2.2 Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 20 2.3 Thành phần phản ứng lai 20 2.4 Thành phần gel SDS-PAGE 25 3.1 3.2 Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp mITC Kết hoạt hóa dòng tế bào 2E8 interleukin 43 45 v DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc protein Interleukin người 1.2 Thụ thể interleukin 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 17 3.1 Trình tự gene interleukin trước sau thay đổi mã di truyền 31 3.2 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Kết điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP Kết kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP enzyme NcoI Kết colony PCR cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R Kết cắt kiểm tra enzyme giới hạn NcoI Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào thuốc Kiểm tra biểu protein IL-7 tái tổ hợp thuốc Western blot 33 35 36 37 38 39 40 3.10 Kết tinh định lượng protein IL-7 phương pháp IMAC 41 3.11 Kết tinh protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp mITC 43 3.12 Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp phương pháp lai miễn dịch 44 3.13 Hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp 46 vi ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Đơn vị: Trường Đại học Y Dược THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin bước đầu đánh giá biểu protein thuốc Mã số: ĐH2014-TN05-01 Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Huy Hoàng Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên Thời gian thực hiện: 2014 - 2017 Mục tiêu: Thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin tái tổ hợp Tạo thuốc biểu protein interleukin Kết nghiên cứu: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gene biểu protein tái tổ hợp thực vật Biểu thành công protein thực vật phương pháp Agroinfiltration Đã đánh giá hoạt tính sinh học protein IL-7 tái tổ hợp Sản phẩm: 4.1 Sản phẩm khoa học: 03 báo đăng tạp chí khoa học 4.2 Sản phẩm đào tạo: Đào tạo 01 nghiên cứu sinh 55 23 Fischer R., Emans N (2000), “Molecular farming of pharmaceutical proteins”, Transgenic Research, 9(4-5), pp 279-299 24 Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M., Schillberg S (1999), “Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur J Biochem, 262(3), pp.810-816 25 Floss D M., Sack M., Arcalis E., Stadlmann J., Quendler H., Rademacher T., Stoger E., Scheller J R., Fischer R., Conrad U (2009), “Influence of elastin-like peptide fusions on the quantity and quality of a tobaccoderived human immunodeficiency virus-neutralizing antibody”, Plant Biotechnology J., 7(9), pp 899-913, doi: 10.1111/j.1467- 7652.2009.00452.x 26 Funk P E., Stephan R P., Witte P L (1995), “Vascular cell adhesion molecule 1-positive reticular cells express interleukin-7 and stem cell factor in the bone marrow”, Blood, 86, pp 2661-2671 27 Gao P., Zhang C., Bian X., Guo Y., Wei Y., Zhang L., Liu Z., Wang X., Huang S (2016), “The increasingly anti-tumor effect of a colonic carcinoma DNA vaccine carrying HER2 by the adjuvanticity of IL-12”, Immunopharmacol Immunotoxicol, 38(6), pp 441-446, doi: http://dx.doi.org/10.1080/08923973.2016.1233426 28 Gora-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiorkowska B., Gaganidze D., Brodzik R., Sirko A (2010), “Recombinant mouse granulocytemacrophage colony-stimulating factor is glycosylated in transgenic tobacco and maintains its biological activity”, J Interferon Cytokine Res., 30(3), pp 135-142, doi: 10.1089/jir.2009.0053 29 Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L J., SanchezTorres C., Gomez-Lim M A (2004), “Expression of a single-chain 56 human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional studies”, Biotechnology Bioeng., 85(7), pp 734-740 30 Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., de Olivera-Flores T J., SantosArgumedo L., Gomez-Lim M A (2005), “Expression of functional interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants”, Transgenic Res., 14(6), pp 877–885, doi: 10.1007/s11248-005-1464-8 31 Heufler C., Topar G., Grasseger A., Stanzl U., Koch F., Romani N., Namen A E., Schuler G (1993), “Interleukin is produced by murine and human keratinocytes”, J Exp Med., 178(3), pp 1109-1114 32 Jha S., Sanyal I., Amla D (2015), “High-level expression and purification of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from transgenic tomato plants”, International Journal of Advance Research In Science And Engineering 4(1), pp 1158-1176 33 Jiang Q., Li W Q., Aiello F B., Mazzucchelli R., Asefa B., Khaled A R., Durum S K (2005), “Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin”, Cytokine Growth Factor Rev, 16(4-5), pp 513–533, doi: 10.1016/j.cytogfr.2005.05.004 34 Jing L., Min C., Xian-Wei L., Hou-Cheng Z., Fa F S., George P W (2007), “Transient expression of an active human interferon-beta in lettuce”, Scientia Horticulturae, 112(3), pp 258-265, http://doi.org/10.1016/j.scienta.2006.12.047 35 Kariminia A., Ivison S M., Leung V.M., Sung S., Couto N., Rozmus J., Rolf N., Narendran A., Dunn S E., Reid G S., Schultz K R (2017), “Ybox-binding protein contributes to IL-7-mediated survival signaling in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia”, Oncology Letters, 13(1), pp 497-505 doi: 10.3892/ol.2016.5437 PubmedID: 28123588 36 Kazusa DNA Res Inst (2017), Codon http://www.kazusa.or.jp/codon, ngày 7/01/2017 usage database, 57 37 Khaled A R., Li W Q., Huang J., Fry T J., Khaled A S., Mackall C L., Muegge K., Young H A., Durum S K (2002), “Bax deficiency partially corrects interleukin-7 receptor-alpha deficiency”, Immunity, 17(5), pp 561-573 38 Kim H J., Park S M., Lee H., Kim Y S (2016), “Membrane-bound p35 Subunit of IL-12 on Tumor Cells is Functionally Equivalent to Membrane-bound Heterodimeric Single Chain IL-12 for Induction of Anti-tumor Immunity”, Immune Netw, 16(5), pp 305-310, doi: 10.4110/in.2016.16.5.305 39 Kim N S., Kim T G., Jang Y S., Shin Y J., Kwon T H., Yang M S (2008), “Amylase gene silencing by RNA interference improves recombinant hGM-CSF production in rice suspension culture”, Plant Mol Biol., 68(4-5), pp 369–377, doi: 10.1007/s11103-008-9376-7 40 Kim N S., Kim T G., Kim O H., Ko E M., Jang Y S., Jung E S., Kwon T H., Yang M S (2008), “Improvement of recombinant hGM-CSF production by suppression of cysteine proteinase gene expression using RNA interference in a transgenic rice culture”, Plant Mol Biol., 68(3), pp 263–275, doi: 10.1007/s11103-008-9367-8 41 Kim T G., Lee H J., Jang Y S., Shin Y J., Kwon T H., Yang M S (2008), “Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture”, Protein Expr Purif., 61(2), pp.117–121, doi: 10.1016/j.pep.2008.06.005 42 Komarova T V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E., Dorokhov Y L (2010), “Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals”, Expert Rev Vaccines, 9(8), pp 859-876, doi: 10.1586/erv.10.85 58 43 Kowalczyk T , Lucka M., Szemraj J., Sakowicz T (2016), “Hairy roots culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med Dosw (Online), 70, pp 1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186 44 Krzystek-Korpacka M., Zawadzki M., Neubauer K., Bednarz-Misa I., Górska S., Wiśniewski J., Witkiewicz W., Gamian A (2017), “Elevated systemic interleukin-7 in patients with colorectal cancer and individuals at high risk of cancer: association with lymph node involvement and tumor location in the right colon”, Cancer Immunol Immunother, 66(2), pp 171179 doi: 10.1007/s00262-016-1933-3, PubmedID: 27866242 45 Kwon T., Kim Y., Lee J., Yang M (2003), “Production and secretion of biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic tomato suspension cultures”, Biotechnology Letters 25(18), pp 1571-1574, doi: 10.1023/A:1025409927790 46 Lee J H., Kim N S., Kwon T H., Jang Y S., Yang M S (2002), “Increased production of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plant suspension cultures”, J Biotechnol., 96(3), pp: 205–211 47 Link A., Vogt T K., Favre S., Britschgi M R., Acha-Orbea H., Hinz B., Cyster J G., Luther S A (2007), “Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells”, Nat Immunol, 8(11):1255–1265, doi:10.1038/ni1513 48 Luchakivskaya Y., Kishchenko O., Gerasymenko I., Olevinskaya Z., Simonenko Y., Spivak M., Kuchuk M (2011), “High-level expression of human interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.) plants”, Plant Cell Rep., 30(3), pp 407-415, doi: 10.1007/s00299-010-0942-5 49 Ma S., Huang Y., Davis A., Yin Z., Mi Q., Menassa R., Brandle J E., Jevnikar A M (2005), “Production of biologically active human 59 interleukin-4 in transgenic tobacco and potato”, Plant Biotechnol J., 2005, 3(3), pp 309-318, doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00125.x 50 Mauro F R., Gentile M., Foa R (2002), “Erythropoietin and chronic lymphocytic leukemia”, Rev Clin Exp Hematol, 1, pp 21-31 51 Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R (1995), “Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells”, Plant Mol Biol., 27(6), pp: 1163–1172 52 Menassa R., Kennette W., Nguyen V., Rymerson R., Jevnikar A., Brandle J (2004), “Subcellular targeting of human interleukin-10 in plants”, J Biotechnol., 108(2), pp 179-183 53 Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C E., Horsey A., Ugulava N., Shoji Y., de la Rosa P., Palmer G A., Rabindran S., Streatfield S J., Boyers A., Russell M., Mann A., Lambkin R., Oxford J S., Schild G C., Yusibov V (2008), “A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge”, Influenza Other Respi Viruses, 2(1), pp 33-40, doi: 10.1111/j.1750-2659.2008.00037.x 54 Morrissey P J., Conlon P., Braddy S., Williams D E., Namen A E., Mochizuki D Y (1991a), “Administration of IL-7 to mice with cyclophosphamide-induced lymphopenia accelerates lymphocyte repopulation”, J Immunol, 146(5), pp 1547-1552 55 Morrissey P J., Conlon P., Charrier K., Braddy S., Alpert A., Williams D., Namen A E., Mochizuki D (1991b), “Administration of IL-7 to normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral lymphadenopathy”, J Immunol, 147(2), pp 561-568 56 Mortimer E., James M M., Sandiswa M., Amelia B., Anna-Lise W., Inga I H., Edward P R (2012), “Setting up a platform for plant-based influenza virus vaccine production in South Africa”, BMC Biotechnol, 12:14 doi: 10.1186/1472-6750-12-14 60 57 Nahed E., Ronald E G (2010), “An Overview of IL-7 Biology and Its Use in Immunotherapy”, J Immunotoxicol, 7(1), pp 1-7, doi:10.3109/15476910903453296 58 Namen A E., Lupton S., Hjerrild K., Wignall J., Mochizuki D Y., Schmierer A., Mosley B., March C J., Urdal D., Gillis S (1988a), “Stimulation of B-Cell progenitors by cloned murine interleukin- 7”, Nature, 333(6173), pp 571-573, doi: 10.1038/333571a0 59 Namen A E., Schmierer A E., March C J., Overell R W., Park L S., Urdal D L., Mochizuki D Y (1988b), “B cell precursor growth-promoting activity Purification and characterization of a growth factor active on lymphocyte precursors”, J Exp Med., 167(3), pp 988-1002 60 Ngoc P B (2009), Production and Secretion of Recombinant SweetTasting Thaumatin from Suspension Cells and Hairy Roots of Nicotiana tabacum, University of Heidelberg, Germany 61 Ning T., Xie T., Qiu Q., Yang W., Zhou S., Zhou L., Zheng C., Zhu Y., Yang D (2008), “Oral administration of recombinant human granulocytemacrophage colony stimulating factor expressed in rice endosperm can increase leukocytes in mice”, Biotechnology Letter, 30(9), pp 1679-1686, doi: 10.1007/s10529-008-9717-2 62 Nosaka T., Vandeursen J M A., Tripp R A., Thierfelder W E., Witthuhn B A., McMickle A P., Doherty P C., Grosveld G C., Ihle J N (1995), “Defective lymphoid development in mice lacking Jak3”, Science, 270(5237), pp 800-802 63 O'Connor A M., Crawley A M., Angel J B (2010), “Interleukin-7 enhances memory CD8+ T-cell recall responses in health but its activity is impaired in human immunodeficiency virus infection”, Immunology, 131(4), pp 525-536, doi: 10.1111/j.1365-2567.2010.03325.x 61 64 Ohbo K., Suda T., Hashiyama M., Mantani A., Ikebe M., Miyakawa K., Moriyama M., Nakamura M., Katsuki M., Takahashi K., Yamamura K., Sugamura K (1996), “Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the IL-2 receptor-γ chain”, Blood, 87(3), pp 956-967 65 Ohya K., Matsumura T., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C (2001), “Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato plants”, J Interferon Cytokine Res., 21(8), pp 595-602, doi: 10.1089/10799900152547858 66 Ohya K., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C., Matsumura T (2002), “Expression of biologically active human tumor necrosis factoralpha in transgenic potato plant”, J Interferon Cytokine Res., 22(3), 371378, doi: 10.1089/107999002753675802 67 Oliver P M., Wang M., Zhu Y., White J., Kappler J., Marrack P (2004), “Loss of Bim allows precursor B cell survival but not precursor B cell differentiation in the absence of interleukin 7”, J Exp Med., 200(9), pp 1179-1187, doi: 10.1084/jem.20041129, PubMed ID: 15520248 68 Patel J., Zhu H., Menassa R., Gyenis L., Richman A., Brandle J (2007), “Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves”, Transgenic Res., 16(2), pp 239249, doi: 10.1007/s11248-006-9026-2 69 Park Y., Cheong H (2002), “Expression and production of recombinant human interleukin-2 in potato plants”, Protein Expr Purif., 25(1), pp 160-165, doi: 10.1006/prep.2002.1622 70 Park S Y., Saijo K., Takahashi T., Osawa M., Arase H., Hirayama N., Miyake K., Nakauchi H., Shirasawa T., Saito T (1995), “Developmental defects of lymphoid cells in Jak3 kinase-deficient mice”, Immunity, 3(6), pp 771-782 PubmedID: 8777722 62 71 Pellegrini M., Calzascia T., Elford A R., Shahinian A., Lin A E., Dissanayake D., Dhanji S., Nguyen L T., Gronski M A., Morre M., Assouline B., Lahl K., Sparwasser T., Ohashi P S., Mak T W (2009), “Adjuvant IL-7 antagonizes multiple cellular and molecular inhibitory networks to enhance immunotherapies”, Nature Medicine, 15, pp 528536, doi:10.1038/nm.1953 72 Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C., de March G., Gomord V (2009), “Production of recombinant proteins in suspensioncultured plant cells”, Methods Mol Biol., 483, pp 145-161, doi:10.1007/978-1-59745-407-0_9 73 Potula H H., Kathuria S R., Ghosh A K., Maiti T K., Dey S (2008), “Transient expression, purification and characterization of bioactive human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants”, Transgenic Res.,17(1), pp 19-32, doi: 10.1007/s11248-007-9072-4 74 Qiang C (2011), “Expression and manufacture of pharmaceutical proteins in genetically engineered horticultural plants”, Transgenic Horticultural Crops: Challenges, and Opportunities-Essays by Experts Boca Raton: Taylor & Francis, pp 83-124, doi: 10.1201/b10952-5 75 Rich B E., Campos-Torres J., Tepper R I., Moreadith R W., Leder P (1993), “Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin transgenic mice”, J Exp Med., 177(2), pp 305-316 76 Rodig S J., Meraz M A., White J M., Lampe P A., Riley J K., Arthur C D., King K L., Sheehan K C F., Yin L., Pennica D., Johnson E M J., Schreiber R D (1998), “Disruption of the Jak1 gene demonstrates obligatory and non-redundant roles of the Jaks in cytokine-induced biologic responses”, Cell, 93(3), pp 373-383, PubMed: 9590172 77.Sanchez-Hernandez C., Gutierrez-Ortega A., Aguilar-Leon D., HernandezPando R., Gomez-Lim M., Gomez-Garcia B (2010), “In vivo activity of 63 plant-based interleukin-12 in the lung of Balb/c mouse”, BMC Res Notes, 3:151, doi: 10.1186/1756-0500-3-151 78 Santos R B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T (2016), “Putting the Spotlight Back on Plant Suspension Cultures”, Front Plant Sci., 7:297, doi: 10.3389/fpls.2016.00297 79 Sardana R., Dudani A K., Tackaberry E., Alli Z., Porter S., Rowlandson K., Ganz P., Altosaar I (2007), “Biologically active human GM-CSF produced in the seeds of transgenic rice plants”, Transgenic Res., 16(6), pp 713-721, doi:10.1007/s11248-006-9062-y 80 Savino A M., Izraeli S (2017), “Interleukin-7 signaling as a therapeutic target in acute lymphoblastic leukemia”, Expert Rev Hematol., 10(3), pp 183-185, doi: 10.1080/17474086.2017.1292121 81 Scheller J., Leps M., Conrad U (2006), “Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptides”, Plant Biotechnol J., 4(2), pp 243-249, doi: 10.1111/j.1467-7652.2005.00176.x 82.Schwertschlag U S., Trepicchio W L., Dykstra K H (1999), “Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin11”, Leukemia, 13(9), pp 1307-1315 83 Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R (2003), “Interleukin and T cell receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells”, Nature Immunol, 4(7), pp 680-686, doi: 10.1038/ni946 84 Shin Y J., Hong S Y., Kwon T H., Jang Y S., Yang M S (2003), “High level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture”, Biotechnol Bioeng, 82(7), pp.778-783, doi:10.1002/bit.10635 85 Shiroki F., Satoshi M., Tomomitsu D., Mari F., Yoshito M., Takashi K., Harumi S., Shigeo K (2007), “The p85α regulatory subunit of class IA 64 phosphoinositide 3-kinase regulates beta-selection in thymocyte development”, Journal of Immunology, 178(3), pp 1349–1356, doi: 10.4049/jimmunol.178.3.1349 86 Silva M R., Hoffman R., Srour E F., Ascensao J L (1994), “Generation of human natural killer cells from immature progenitors does not require marrow stromal cells”, Blood, 84, pp 841-846 87 Sijmons P C., Dekker B M., Schrammeijer B., Verwoerd T C., van den Elzen P J., Hoekema A (1990), “Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants”, Nature Biotechnology, 8, pp 217-222, doi:10.1038/nbt0390-217 88 Matsuyama R., Goto K., Kadokura T., Sato M., Mori R., Kumamoto T., Taguri M., Miyasho T., Endo I (2017), “IL-7 and procalcitonin are useful biomarkers in the comprehensive evaluation of the severity of acute cholangitis”, J Hepatobiliary Pancreat Sci, 24(2), pp 81-88, doi:10.1002/jhbp.420 PMID: 28002647 89 Suzuki K., Nakajima H., Watanabe N., Kagami S., Suto A., Saito Y., Saito T., Iwamoto I (2000), “Role of common cytokine receptor-γ chain- and Jak3-dependent signaling in the proliferation and survival of murine mast cells”, Blood, 96(6), pp 2172–2180 90 Sweeney E B., Foss F M., Murphy J R., Spek J C (1998), “Interleukin (IL-7) receptor-specific cell killing by DAB389 IL-7: a novel agent for the elimination of IL-7 receptor positive cells”, Bioconjug chem.,9(2), pp 201 - 207, doi: 10.1021/bc9701757 91 Vandana K., Laura A P., Yevgeniy Y., Florian M B., Surojit S (2015), “Quiescence of Memory CD8(+) T Cells Is Mediated by Regulatory T Cells through Inhibitory Receptor CTLA-4”, Immunity, 42(6), pp 1116-1129 92 Van den Bergh J M., Lion E., Van Tendeloo V F., Smits E L (2017), “IL15 receptor alpha as the magic wand to boost the success of IL-15 65 antitumor therapies: The upswing of IL-15 transpresentation”, Pharmacology & Therapeutics, 170, pp 73-79, doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.10.012 93 Vaquero C., Sack M., Chandler J., Drossard J., Schuster F., Monecke M., Schillberg S., Fischer R (1999), “Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves”, Proc Natl Acad Sci U S A, 96(20), pp 11128-11133 94 Wang D J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A M., Ma S (2008), “A novel platform for biologically active recombinant human interleukin13 production”, Plant Biotechnology J., 6(5), pp 504–515, doi: 10.1111/j.1467-7652.2008.00337 95 Wang M L., Goldstein C., Su W., Moore P H., Albert H H (2005), “Production of biologically active GM-CSF in sugarcane: A secure biofactory”, Transgenic Res., 14(2), pp 167-178 96 Wang X B., Wu Q., Ito T., Cillo F., Li W X., Chen X., Yu J L., Ding S W (2010), “RNAi-mediated viral immunity requires amplification of virus-derived siRNAs in Arabidopsis thaliana”, Proc Natl Acad Sci U S A, 107(1), pp 484-9, doi: 10.1073/pnas.0904086107 97 Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H., Aiso S., Hibi T., Ishii H (1995), “Interleukin is produced by human intestinal epithelial-cells and regulates the proliferation of intestinal mucosal lymphocytes”, J Clin Investigation, 95(6), pp 2945-2953, doi: 10.1172/JCI118002 98 Wikipedia, Interleukin 7, https://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_7, ngày 01/01/2017 99 Wiles M V., Ruiz P., Imhof B A (1992), “Interleukin-7 expression during mouse thymus development”, Eur J Immunology, 22(4), pp 1037-1042, doi: 10.1002/eji.1830220424 66 100 World Health Organization (2016), Vietnam has among world’s highest cancer fatality rates, https://www.vietnambreakingnews.com/2016/10/vietnam-has-amongworlds-highest-cancer-fatality-rates/, ngày 01/01/2017 101 Yoko S., Hong B., Konstantin M., Amy R., April H., Gourgopal R., Brian G., Moneim S., Christine E F., Barbara T., Nutan M., Natalia U (2009), “Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine, 27(7), pp 1087-1092, doi:10.1016/j.vaccine.2008.11.108 102 Yoseph S., Yoram T (2016), “Plant specific N-glycan not have proven adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp 706-708, doi:10.1038/nbt.3556 103 Zhang B., Yang Y H., Lin Y M., Rao Q., Zheng G G., Wu K F (2003), “Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants”, Biotechnology Letter, 25(19), pp 1629-1635 104 Zhang X., Du P., Lu L., Xiao Q., Wang Q., Cao X., Ren B., Wei C., Li Y (2008), Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the accumulation of siRNAs, Virology, 374(2), pp 351-360, doi: 10.1016/j.virol.2007.12.045 105 Zhong H., Gu X., Dai Y., Wang Z., Fu D., Guo X., Wu H., Wang D., Lu Z (2016), “Interleukin-7 in Patients With Chronic Hepatitis B May Have Effect on T Follicular Helper Cells and Specific Cellular Immunity”, Hepat Mon, 16(9): e36068, doi:10.5812/hepatmon.36068 106 Zhou F., Wang M L., Albert H H., Moore P H., Zhu Y J (2006), “Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana benthamiana using potato virus X vector”, Appl Microbiology Biotechnology, 72(4), pp 756-762, doi: 10.1007/s00253-005-0305-2 67 107 Ziegler S F., Liu Y J (2006), “Thymic stromal lymphopoietin in normal and pathogenic T-cell development and function”, Nature Immunology, 7(7), pp 709-714, doi: 10.1038/ni1360 68 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần số dung dịch đệm Dung dịch đệm Đệm xử lý mẫu (Treatment buffer 6X) Thành phần Tris HCl 1M 3,75 ml Glycerol 100% ml SDS 1,2 g 2-mercaptoethanol 0,9 ml Bromophenol blue 1,2 mg pH 6,8 Tris HCl 25 mM Đệm chạy điện di protein Glycine (running buffer protein) SDS 250mM 0,1% lít running buffer 1X: 3g Tris, 18,8 g glycine, 1g SDS Đệm Staining buffer Đệm Destaining buffer Đệm chiết DNA tổng số CBBR - 250 0,25% Methanol 30% Acid axetic 10% Methanol 30% Acid axetic 10% Tris-HCl 1M 50 mM NaCl 5M 300 mM EDTA 0.5M 20 mM CTAB 4% pH 8.0 69 Phụ lục Các vector sử dụng luận án * Sơ đồ cấu trúc vector pBSK/IL7 * Sơ đồ cấu trúc vector pCB301 35S/IL7-histag-cMyc-100xELP ... systems Code number: ĐH2014-TN05-01 Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA Implementing institution: Thai Nguyen university of Medicine and Pharmacy Duration: from 2014 to 2017 Objective(s): - Design... Improve the research capacity of the participants, especially the leader Additional 01 reference material for the research, teaching and learning of students, specialized students in Genetics Transfer... minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế