Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ở thực vật thường không cao là một trong những giới hạn khi nghiên cứu biểu hiện protein ở thực vật. Đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm vượt qua giới hạn đó để tăng cường khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp khi biểu hiện ở thực vật bằng nhiều phương pháp như: tối ưu hóa codon [16], kết hợp với một thành phần hỗ trợ như enzyme lichenase [53], ELP [16], [25].
Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã sử dụng 100xELP cùng với protein IL-7 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35 nhằm tăng cường khả năng biểu hiện protein IL-7 ở thực vật. Kết quả của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu khác như: Patel và cộng sự (2007) đã tăng cường sự biểu hiện của interleukin 4 của người lên 19 lần và interleukin 10 lên 15 lần khi kết hợp với 27xELP [68]; nghiên cứu của Floss (2009) cũng cho thấy, mức độ biểu hiện của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng HIV (2F5 và 2G12) cao hơn khi không có sự kết hợp với ELP [25]. Từ những kết quả này cho thấy sự tích lũy các protein tái tổ hợp là do hiệu ứng của ELP chứ không phải do vị trí của gen chuyển.
Sự tăng cường biểu hiện của protein kết hợp với ELP có thể được giải thích là do các protein kết hợp ELP khó bị protease của tế bào chủ phân cắt hoặc thủy phân hơn. Điều này dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao hơn so với bình thường, góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp tinh sạch và thu nhận protein tiếp theo.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nhằm tinh sạch và thu nhận các loại protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao và tinh khiết như: phương pháp sắc ký lọc gel, phương pháp sắc ký ái lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp đảo chiều thuận nghịch mITC. Tùy thuộc vào nghiên cứu và loại protein,người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch tối ưu nhất để thu được hàm lượng protein tái tổ hợp cao nhất.
Phương pháp tinh sạch protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa trên tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan và ngược lại khi nhiệt độ môi trường thay đổi của ELPylated tỏ ra có nhiều ưu điểm và được ứng dụng ngày càng rộng rãi do hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận được nhiều với độ tinh sạch cao, các bước tiến hành nhanh và đơn giản do sự kết tinh của các protein gắn kết ELP được giữ lại trên bề mặt màng và dễ dàng được khử khỏi màng.
Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng hai phương pháp để tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp là phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (IMAC) và phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC). Đối với phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. Đối với phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC), chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 367 mg/kg lá tươi với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % và độ tinh sạch đạt 86,3%. Qua số liệu thu được cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC) dựa trên đặc tính của ELP có hiệu suất thu hồi cao hơn hẳn các phương pháp khác; kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với những nghiên cứu trước đó về biểu hiện protein tái tổ hợp có gắn kết ELP như Scheller và cộng sự (2006) đã tổng hợp được protein scFV tái tổ hợp với hàm lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP [81], Theo Floss (2009), việc gắn kết với ELP có thể làm tăng mức độ biểu hiện của các kháng thể vô hiệu hóa HIV biểu hiện trong hạt [25]; ELP kết hợp với các protein tái tổ hợp ở đầu C cũng làm tăng sự tích lũy của nhiều loại protein biểu hiện trong lá [16], [17], [68].
Từ những kết quả trên cho thấy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp gắn kết với ELP và tinh sạch bằng phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng
mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao hơn so với các phương pháp khác. Mở ra một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho mục đích thu nhận protein tái tổ hợp của người sản xuất ở thực vật nhằm phục vụ trong y dược học, chữa bệnh cho con người.
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 1. Kết luận
1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide là 63,6 % và độ tương đồng acid amin là 100%.
2. Các cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/IL7/cal; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S-IL7-100xELP; pCB301_IL7/ELP được thiết kế phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp.
3. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy cao nhất đạt 367 mg/kg lá tươi khi biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá và thu nhận bằng phương pháp tinh sạch mITC; thấp nhất khi biểu hiện qua hệ thống nuôi cấy huyền phù BY-2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số.
4. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 đạt 82,5% ở nồng độ 2 g/ml.
2. Đề nghị
Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu sâu hơn; chúng tôi đề xuất một số đề nghị sau:
1. Tiếp tục thử nghiệm protein IL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở mức độ động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn hoạt tính sinh học của protein IL-7 trước khi sản xuất trên diện rộng.
2. Nghiên cứu biểu hiện protein IL-7 ở một số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein IL-7 tái tổ hợp.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2014). Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở người.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập 118 số 04, trang 153-156.
2. Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015). Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen trong hệ thống thực vật. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập 134 số 04, trang 25-28.
3. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017). Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration. Tạp chí Sinh học. 4. Hoang,N.H., Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trương Nam Hải (2010), Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mi Hoàng (2015), “Bước tiến trong điều trị bệnh tự miễn”, Tạp chí Thông tin Khoa học và Công nghệ, 9, tr. 28-30.
3. Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Biểu hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp”, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 15(1), tr. 52-61.
Tiếng Anh
4. Adam W. P., Daniel T. P., Jung H. S., Emma-Kate L., François J., Steven F. Z., Ninan A. (2012), “Interleukin-7, but not thymic stromal lymphopoietin, plays a key role in the T cell response to influenza A virus”, PLoS One, 7(11), PP. 1-8, doi: 10.1371/journal.pone.0050199. 5. Agnieszka S., Tomas V., Anna G., Patrycja R. (2011), “Recombinant
Cytokines from Plants”, Int. J. Mol. Sci., 12(6), pp: 3536-3552, doi:10.3390/ijms12063536.
6. Alkayyal A. A., Tai L. H., Kennedy M. A., Tanese S. C., Zhang J., Lefebvre C., Sahi S., Ananth A. A., Mahmoud A. B., Makrigiannis A. P., Cron G. O., Macdonald B., Marginean E. C., Stojdl D. F., Bell J. C., Auer R. C. (2017), “NK-cell recruitment necessary for eradication of peritoneal carcinomatosis with an IL12-expressing maraba virus cellular vaccine”, Cancer Immunol Res, 5(3), pp. 211-221, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-0162.
7. Appasamy P. M. (1999), “Biological and clinical implications of interleukin- 7 and lymphopoiesis”, Cytokines Cell. Mol. Ther., 5(1), pp. 25-39.
8. Azizi H., Kazemi B., Bandehpour M., Mohebali M., Khamesipour A., Aryaeipour M., Yaghoobi H., Rokni M. B. (2016), “Modulation of the immune response to DNA vaccine encoding gene of 8-kDa subunit of echinococcus granulosus antigen B using murine interleukin-12 plasmid in BALB/c Mice”, Iran J Parasitol, 11(4), pp.480-489.
9. Baird A. M., Lucas J. A., Berg L. J. (2000), “A profound deficiency in thymic progenitor cells in mice lacking Jak3”, J Immunol, 165(7), pp.3680–3688, PubMed: 11034372.
10. Barta A., Sommergruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A., Matzke A. J. M. (1986), “The expression of a nopaline synthase-human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue”, Plant Mol. Biology, 6(5), pp. 347–357.
11. Beilharz M. W., Cummins M. J. (2010), “Oromucosal administration of interferon to humans”, Pharmaceuticals, 3(2), pp.323-344.
12. Budzianowski J. (2010), “Tobacco a highly efficient producer of vaccines”, Przegl. Lek., 67(10), pp. 1071-1076.
13. Cao X., Shores E. W., Huli J., Anver M. R., Kelsall B. L., Russell S. M., Drago J., Noguchi M., Grinberg A., Bloom E. T., Paul W. E., Kayz S. I., Love P. E., Leonard W. J. (1995), “Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor-γ chain”,
Immunity, 2(3), pp. 223-238, PubMedID: 7697543.
14. Chen Y., Chauhan S. K., Tan X., Dana R. (2017), “Interleukin-7 and -15 maintain pathogenic memory Th17 cells in autoimmunity”, J Autoimmun, 77, pp. 96-103, doi: 10.1016/j.jaut.2016.11.003, PubMedID: 27899224. 15. Chong D. K. X., Langridge W. H. R. (2000), “Expression of full-length
bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants”, Transgenic Res, 9(1), pp. 71-78.
16. Conley A. J., Joensuu J. J., Jevnikar A. M., Menassa R., and Brandle J. E. (2009), “Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants”, Biotechnology Bioeng, 103(3), pp. 562-573, doi: 10.1002/bit.22278.
17. Conrad U., Plagmann I., Malchow S., Sack M., Floss D. M., Kruglov A. A., Nedospasov S. A., Rose-John S., Scheller J. (2011), “ELPylated anti- human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock”, Plant Biotechnol. J., 9(1), 22-31, doi: 10.1111/j.1467- 7652.2010.00523.x.
18. Costello R., Imbert J., Olive D. (1993), “Interleukin-7, a major Tlymphocyte cytokine”, Eur. Cytokine Netw., 4(4), pp. 253-262.
19. Davies H. M. (2010), “Review article: commercialization of whole-plant systems for biomanufacturing of protein products: evolution and prospects”, Plant Biotechnol J., 8(8), pp. 845-861, doi: 10.1111/j.1467- 7652.2010.00550.x.
20. Disanto J. P., Muller W., Guygrand D., Fischer A., Rajewsky K. (1995), “Lymphoid development in mice with a targeted deletion of the interleukin-2 receptor-γ chain”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(2), pp. 377- 381, PubMed: 7831294.
21. Eddie A. J., Changlin W., Zeping W., Raymond R., Joong H. S., Nancy S. M., James M. L. (2000), “Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells”, Protein Expression and Purification, 19(1), pp: 131–138, doi: https://doi.org/10.1006/prep.2000.1232.
22. Faller E. M., Ghazawi F. M., Cavar M., MacPherson P. A. (2010), “IL-7 induces clathrin-mediated endocytosis of CD127 and subsequent degradation by the proteasome in primary human CD8 T cells”,
23. Fischer R., Emans N. (2000), “Molecular farming of pharmaceutical proteins”, Transgenic Research, 9(4-5), pp. 279-299.
24. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M., Schillberg S. (1999), “Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur. J. Biochem, 262(3), pp.810-816.
25. Floss D. M., Sack M., Arcalis E., Stadlmann J., Quendler H., Rademacher T., Stoger E., Scheller J. R., Fischer R., Conrad U. (2009), “Influence of elastin-like peptide fusions on the quantity and quality of a tobacco- derived human immunodeficiency virus-neutralizing antibody”, Plant Biotechnology J., 7(9), pp. 899-913, doi: 10.1111/j.1467- 7652.2009.00452.x.
26. Funk P. E., Stephan R. P., Witte P. L. (1995), “Vascular cell adhesion molecule 1-positive reticular cells express interleukin-7 and stem cell factor in the bone marrow”, Blood, 86, pp. 2661-2671.
27. Gao P., Zhang C., Bian X., Guo Y., Wei Y., Zhang L., Liu Z., Wang X., Huang S. (2016), “The increasingly anti-tumor effect of a colonic carcinoma DNA vaccine carrying HER2 by the adjuvanticity of IL-12”,
Immunopharmacol Immunotoxicol, 38(6), pp. 441-446, doi: http://dx.doi.org/10.1080/08923973.2016.1233426.
28. Gora-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiorkowska B., Gaganidze D., Brodzik R., Sirko A. (2010), “Recombinant mouse granulocyte- macrophage colony-stimulating factor is glycosylated in transgenic tobacco and maintains its biological activity”, J. Interferon Cytokine Res., 30(3), pp. 135-142, doi: 10.1089/jir.2009.0053.
29. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L. J., Sanchez- Torres C., Gomez-Lim M. A. (2004), “Expression of a single-chain
human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional studies”, Biotechnology Bioeng., 85(7), pp. 734-740.
30. Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., de Olivera-Flores T. J., Santos- Argumedo L., Gomez-Lim M. A. (2005), “Expression of functional interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants”, Transgenic Res., 14(6), pp. 877–885, doi: 10.1007/s11248-005-1464-8.
31. Heufler C., Topar G., Grasseger A., Stanzl U., Koch F., Romani N., Namen A. E., Schuler G. (1993), “Interleukin 7 is produced by murine and human keratinocytes”, J. Exp. Med., 178(3), pp. 1109-1114.
32. Jha S., Sanyal I., Amla D. (2015), “High-level expression and purification of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from transgenic tomato plants”, International Journal of Advance Research In Science And Engineering 4(1), pp. 1158-1176.
33. Jiang Q., Li W. Q., Aiello F. B., Mazzucchelli R., Asefa B., Khaled A. R., Durum S. K. (2005), “Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin”,
Cytokine Growth Factor Rev, 16(4-5), pp. 513–533, doi: 10.1016/j.cytogfr.2005.05.004.
34. Jing L., Min C., Xian-Wei L., Hou-Cheng Z., Fa F. S., George P. W. (2007), “Transient expression of an active human interferon-beta in lettuce”, Scientia Horticulturae, 112(3), pp. 258-265, http://doi.org/10.1016/j.scienta.2006.12.047.
35. Kariminia A., Ivison S. M., Leung V.M., Sung S., Couto N., Rozmus J., Rolf N., Narendran A., Dunn S. E., Reid G. S., Schultz K. R. (2017), “Y- box-binding protein 1 contributes to IL-7-mediated survival signaling in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia”, Oncology Letters, 13(1), pp. 497-505. doi: 10.3892/ol.2016.5437. PubmedID: 28123588.
36. Kazusa DNA Res. Inst. (2017), Codon usage database, http://www.kazusa.or.jp/codon, ngày 7/01/2017.
37. Khaled A. R., Li W. Q., Huang J., Fry T. J., Khaled A. S., Mackall C. L., Muegge K., Young H. A., Durum S. K. (2002), “Bax deficiency partially corrects interleukin-7 receptor-alpha deficiency”, Immunity, 17(5), pp. 561-573.
38. Kim H. J., Park S. M., Lee H., Kim Y. S. (2016), “Membrane-bound p35 Subunit of IL-12 on Tumor Cells is Functionally Equivalent to Membrane-bound Heterodimeric Single Chain IL-12 for Induction of Anti-tumor Immunity”, Immune Netw, 16(5), pp. 305-310, doi: 10.4110/in.2016.16.5.305.
39. Kim N. S., Kim T. G., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S. (2008), “Amylase gene silencing by RNA interference improves recombinant hGM-CSF production in rice suspension culture”, Plant Mol. Biol., 68(4-5), pp. 369–377, doi: 10.1007/s11103-008-9376-7.
40. Kim N. S., Kim T. G., Kim O. H., Ko E. M., Jang Y. S., Jung E. S., Kwon T. H., Yang M. S. (2008), “Improvement of recombinant hGM-CSF production by suppression of cysteine proteinase gene expression using RNA interference in a transgenic rice culture”, Plant Mol. Biol., 68(3), pp. 263–275, doi: 10.1007/s11103-008-9367-8.
41. Kim T. G., Lee H. J., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S. (2008), “Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture”, Protein Expr. Purif., 61(2), pp.117–121, doi: 10.1016/j.pep.2008.06.005.
42. Komarova T. V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E.,