Chúng tôi sử dụng dòng tế bào 2E8 để bước đầu đánh giá hoạt tính của protein Interleukin 7 tái tổ hợp. 2E8 là một dòng tế bào hoàn toàn phụ thuộc vào interleukin 7 để tồn tại, sinh trưởng và sinh sản [69].
Cơ sở lý thuyết
Tế bào 2E8 là tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào interleukin 7. Khi môi trường nuôi cấy không được bổ sung IL-7 thì tế bào sẽ chết sau 48 giờ. Vì thế, dòng tế bào 2E8 được sử dụng là dòng chuẩn để xác định hoạt tính sinh học của protein IL-7 tự nhiên cũng như protein tái tổ hợp. Khi bổ sung IL-7 vào môi trường nuôi cấy tế bào 2E8, tùy theo hoạt tính sinh học của protein IL-7 mà tế bào 2E8 sẽ duy trì sự sống và khả năng hoạt hóa quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của tế bào, hoạt tính của protein IL-7 càng mạnh thì khả năng sống sót và hoạt hóa của tế bào 2E8 càng cao.
Phương pháp
a. Nuôi cấy, bảo quản dòng tế bào 2E8
Môi trường nuôi cấy tế bào: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s medium) có bổ sung 4 mM L-glutamin, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 1 ng/ml interleukin 7 và 20% fetal bovine serum.
Nuôi cấy, duy trì: Tế bào nuôi ở dạng hỗn dịch với chu kỳ cấy chuyển là từ 3 - 5 ngày và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 370C và 5% CO2.
b. Thử nghiệm hoạt tính protein IL-7 tái tổ hợp
Lựa chọn dòng IL-7 tái tổ hợp tốt nhất để thử nghiệm hoạt tính sinh học. Sử dụng màng lọc có kích cỡ 0.22 µm để lọc khuẩn, sau đó pha loãng bằng PBS đã khử trùng để đạt nồng độ gốc là 0.1 mg/ml.
Hai ngày sau khi cấy chuyển, tế bào 2E8 được rửa sạch 3 lần bằng môi trường IMDM cơ bản (không có huyết thanh và không có IL-7). Sau đó, tiếp
tục hòa trong môi trường IMDM với nồng độ 1 x 105 tế bào/ml và chuyển vào 96 giếng, thực hiện phản ứng ELISA (190 µl/giếng). Bổ sung mẫu protein IL- 7 tái tổ hợp vào các giếng với các nồng độ khác nhau. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào 2E8 và môi trường nuôi cấy IMDM cơ bản có bổ sung huyết thanh, không bổ sung IL-7.
Các giếng được ủ trong tủ ấm CO2 với điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ bổ sung thêm 30 µl dung dịch thuốc nhuộm trong bộ kit Non-radioactive proliferation để định tính và định lượng protein IL-7. Tiếp tục ủ trong tối 4 giờ và đọc kết quả bằng máy ELISA reader bước sóng 525 nm.
2.2.8. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
Kết quả nghiên cứu của luận án được phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016, Table Curve theo các tham số thống kê: giá tri ̣ trung bình, độ lệch chuẩn (σ), sự sai khác giữa các giá tri ̣ trung bình được kiểm đi ̣nh bằng giớ i ha ̣n sai khác nhỏ nhất LSD của Fisher với α=0,05, chỉ số ED50 v.v...
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thay đổi mã di truyền gene Interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật
Chúng tôi sử dụng trình tự gene interleukin 7 ở người được công bố trên Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật (Codon Usage Database) [36], cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA trên gen IL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA, kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogene để giảm thiểu sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp.
Kết quả thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, chúng tôi đã thành công trong việc thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 để phù hợp và nâng cao hiệu quả biểu hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với gene gốc, với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt và ghép nối gene trong quá trình thiết kế vector chuyển gene, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI,
HindIII đã được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gene interleukin 7. Đồng thời, chúng tôi cũng thêm các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his- tag cũng được gắn vào đầu 3’ của gene.
Trình tự nucleotide gene interleukin 7 sau khi được tối ưu có kích thước 536bp, được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được nhân dòng trong vector pBSK/IL7.
3.2. Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá
3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được thiết kế kế thừa từ vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng cách loại bỏ và thay thế gene TBAG bằng gene IL-7 được mô phỏng như hình 3.2
Hình 3.2. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
Chúng tôi tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.A cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết.
Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP được xử lý với enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector pRTRA 35S-histag-cmyc-100xELP mở vòng và gene TBAG theo tính toán lý thuyết. Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước 5051 bp để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc- 100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ hợp sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng bằng phương pháp sốc nhiệt.
Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang vector chứa gene mã hóa protein IL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF và IL7_BamHI_R. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng 2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước của gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước của một đoạn promoter (250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của phản ứng colony PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
A B C D
Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép
tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(A). Kết quả PCR nhân gene IL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI; (C): Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn, (-). Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc- 100xELP bằng enzyme giới hạn BamHI
Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường
chạy 1 trên hình 3.3.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) và gene IL-7 (564bp). Điều này khẳng định, vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α để nhân dòng và sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử lý đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII. Với plasmid pBC301 để tránh hiện tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau khi tinh sạch được xử lý tiếp bằng enzyme SAP. Các sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Trên hình 3.4.A cho thấy, ở đường chạy 1 (sản phẩm cắt pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 2.9 kb và 2.6 kb; ở đường chạy 2 (sản phẩm cắt pCB301 đã xử lý qua SAP) có 1 băng có kích thước khoảng 5.6 kb. Điều này chứng tỏ đã cắt thành công plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 bằng
HindIII. Tiến hành thôi gel, tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước 2.9 kb và 5.6 kb chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành phản ứng lai ghép casette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vector mở vòng pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp và được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α
để chọn lọc, nhân dòng.
Chọn 5 khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, kết quả thể hiện trên hình 3.4.B cho thấy, ở các đường chạy xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước gene IL-7 theo tính toán lý thuyết. Để tránh khả năng dương tính giả của PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII. Kết quả thể hiện trên
hình 3.4.C, trên đường chạy 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2.9 kb và 5.6 kb theo đúng kích thước tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp.
A B C
Hình 3.4. Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép
tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP
(A). Kết quả xử lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và vector pCB301 bằng enzyme giới hạn HindIII; (B). Kết quả kiểm tra colony PCR pCB301/IL7- cmyc-histag-100xELP bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, (-). Đối chứng âm (pCB301), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả cắt kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme giới hạn HindIII
Do chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn khi tạo đầu dính giữa vector pCB301 và cassette 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP nên chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều của vector pCB301. Vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp có hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, một vị trí nằm trên vector và một
vị trí nằm trên cassette, do đó khi xử lý bằng NcoI sẽ cho ra 2 băng có kích thước khác nhau tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với vector pCB301.
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra
vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm cắt ngược chiều; 2. Sản cắt xuôi chiều
Kết quả thể hiện trên hình 3.5 cho thấy, ở đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 3.6 kb và 4.9 kb tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết khi cassette gắn ngược chiều với chiều của vector pCB301, còn ở đường chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 6.9 kb và 1.6 kb tương ứng với trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301. Sau đó, lựa chọn những vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau khi cắt kiểm tra để biến nạp vào tế bào A.tumefaciens C58C1 bằng xung điện để chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agro-infiltration phương pháp Agro-infiltration
3.3.1. Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Từ kết quả ở mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp đã được thiết kế thành công, sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng phương pháp xung điện (mục 2.2.3.2.f). Sản phẩm của quá trình biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l và
kanamycin 50 mg/l trong 2 ngày.
Chúng tôi lựa chọn 5 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn đều phát triển trên môi trường chọn lọc để kiểm tra bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R và phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn NcoI. Kết quả thể hiện trên hình 3.6 và 3.7.
Hình 3.6. Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 - 5. Các dòng khuẩn lạc; (-). Đối chứng âm; (+). Đối chứng dương
Hình 3.7. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI
Trên hình 3.6 cho thấy, tại các đường chạy 1 - 5 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gene IL-7 nhân bằng cặp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm không có băng nào, đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện một băng kích thước khoảng 564 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng colony PCR đã thành công và mẫu không bị nhiễm.
Để khẳng định chắc chắn cho kết luận, chúng tôi tiến hành tách plasmid các dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR và cắt bằng enzyme giới hạn NcoI. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 3,6 kb và 4,9 kb đúng theo tính toán lý thuyết của vector pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.
Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens
C58C1/pGV2260.
3.3.2. Biểu hiện tạm thời protein IL-7 bằng phương pháp Agro-infiltration
Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá được thực hiện theo quy trình đã trình bày tại mục 2.2.4.
Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản ở -800C để chuẩn bị cho các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag- 100xELP và biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp với sự hỗ trợ của protein Hc-Pro ức chế cơ chế câm gene hoạt động trong cây bằng phương pháp western blot.
Hình 3.8. Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá
3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp
Để kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford (1976), sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy khả năng biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp khác nhau ở các lá có độ tuổi khác nhau, trong đó biểu hiện mạnh nhất ở lá non; điều này có thể giải thích do ở lá non có tốc độ sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn so với lá bánh tẻ và lá già.
Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết, trong khi ở đường chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không chuyển gene không xuất hiện băng này
Hình 3.9. Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng Western blot
M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ, 3. Lá già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gene)
3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein Il-7 tái tổ hợp
Sau khi biểu hiện thành công protein IL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein IL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp