hiện ở thực vật
Cơ sở lý thuyết
Mã di truyền là phần mật mã quy định thông tin về trình tự các acid amin được mã hóa dưới dạng các trình tự nucleotide trên gene, trong đó ba nucleotide liên tiếp sẽ quy định một loại acid amin nhất định. Acid amin có thể được quy định bởi nhiều bộ ba mã di truyền khác nhau [10], [43]. Do đó, để phù hợp và tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của gene interleukin 7 trong hệ thống thực vật, chúng tôi tiến hành thay đổi những mã di truyền hiếm của gene ngoại lai interleukin 7 thành mã di truyền phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin của protein.
Phương pháp
Quá trình thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 gồm các bước: Bước 1: Khai thác thông tin trình tự nucleotide gene interleukin 7 trên Ngân hàng Gene quốc tế, mã số 3574 [28] và trình tự mRNA, mã số J04156.1.
Bước 2: Thay thế các codon hiếm trong gene interleukin 7 bằng các codon phổ biến ở thực vật bằng phần mềm Codon Optimization 2.0 dựa trên thông tin tần suất các codon phổ biến ở thực vật trong cơ sở dữ liệu mã di truyền Codon Usage Database [18]. Ngoài ra, trình tự ATTTA được loại bỏ và sử dụng phần mềm Invitrogene để tối ưu nhằm giảm thiểu sự hình thành mRNA thứ cấp.
Bước 3: Bổ sung các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, NcoI,
HindIII, BamHI vào trình tự gene nhằm phục vụ cho quá trình cắt và ghép nối gene khi thiết kế vector chuyển gene.
Bước 4: Thêm đoạn trình tự mã hoá cho epitope c-Myc tag và His-tag vào đầu 3’ của gene interleukin 7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein interleukin 7 tái tổ hợp trong thực vật thông qua các phương pháp lai miễn dịch Western blot và phân tích ELISA.
Bước 5: Sử dụng phần mềm BioEdit để kiểm tra và so sánh trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của gene interleukin 7 trước và sau khi đổi mã. Gene interleukin 7 tái tổ hợp được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Mỹ) và được nhân dòng trong vector pBSK-IL7.
2.2.2. Thiết kế mồi
Sử dụng phần mềm BioEdit và trình tự gene interleukin 7 tái tổ hợp cùng trình tự gene đã công bố trên Ngân hàng Gene quốc tế để thiết kế các cặp mồi phục vụ nghiên cứu trong luận án, thể hiện tại bảng 2.1
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp
Quá trình thiết kế vector chuyển gen gồm các bước chính sau: Bước 1.
Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng lai; Bước 2. Ghép nối các đoạn gene tạo plasmid tái tổ hợp; Bước 3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli
DH-5 để nhân dòng; Bước 4. Chọn dòng khuẩn lạc bằng phương pháp colony- PCR và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn.
a. Nhân dòng gene IL-7
Đoạn gene IL-7 được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng khuôn là plasmid pBSK-IL7 với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện: 50 µl hỗn hợp phản ứng gồm 0,3 µM mồi, 0,2 µM dNTPs, 5 µl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 20 ng khuôn. Chu trình nhiệt: 940C/5 phút, 30 chu kỳ lặp lại các bước 940C/30 giây, 500C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây. Sau đó giữ 720C/10 phút và sản phẩm được giữ bảo quản ở 150C. Kết quả PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
b. Ghép nối gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP * Phản ứng cắt enzyme giới hạn
Cơ sở lý thuyết
Enzyme giới hạn nhận biết các vị trí cắt đặc hiệu trên phân tử DNA. Chúng phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA nhưng không làm ảnh hưởng
tới bases. Các liên kết hóa học ở các gene bị enzyme giới hạn cắt có thể nối lại nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau cùng sự xúc tác của enzyme ligases.
Phương pháp
Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP và gene IL-7 được cắt đồng thời bằng enzyme giới hạn BamHI theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 9,5 2 Buffer 10x 10 3 DNA (~1µg) 80 4 Enzyme BamHI 0,5
Phản ứng được ủ ở 370C trong vòng 2 - 4 giờ.
* Phản ứng lai ghép đoạn gene IL-7 với pRTRA 35S-100xELP
Sản phẩm tinh sạch - đoạn gene IL-7 được ghép nối vào vector pRTRA 35S- 100xELP tạo plasmid tái tổ hợp mang gene IL-7 (ký hiệu pRTRA 35S/IL7-cmyc- histag-100xELP) Bảng 2.3. Thành phần phản ứng lai STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước 0 2 Buffer 10x 1 3 Sản phẩm cắt (vector) 5 4 Sản phẩm cắt (IL-7) 3 5 Enzyme T4 ligation 1 Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 220C trong 1 giờ 30 phút.
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH-5α.
c. Biến nạp sản phẩm ghép nối gene vào tế bào khả biến E.coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt
* Chuẩn bị tế bào khả biến Cơ sở lý thuyết
Tế bào nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log và được làm sạch nhờ việc rửa nhiều lần bằng CaCl2 0,1M. Dưới tác dụng của muối CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. Tế bào chứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gene kháng kháng sinh nên được chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó.
Phương pháp tạo tế bào khả biến
Tế bào khả biến E. coli DH-5αđược tạo theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly tâm. Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần thứ ba 45 phút.
*Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α
Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp được thực hiện như sau:
• Bổ sung 5 µl vector vào tế bào khả biến và đảo nhẹ • Ủ trong đá 15 - 30 phút.
• Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây. • Để trong đá 15 - 30 phút.
• Bổ sung 200 µl LB lỏng.
• Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ.
• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc carbenicillin 50 mg/L.
* Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR
Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gene bằng cặp mồi đặc hiệu.
* Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn Cơ sở lý thuyết
Dưới tác dụng của NaOH và SDS, thành tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ giải phóng DNA genome, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị biến tính. Khi thay đổi độ pH của dịch tách chiết tế bào bằng kali acetae, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị kết tủa. Phần protein còn sót lại, cùng với các mảnh vỡ của tế bào sẽ được tủa bằng hồn hợp chloroform : isoamylalcohol (24:1 v/v), sau ly tâm sẽ được tách khỏi phần dung dịch DNA plasmid. DNA plasmid nằm ở pha trên được thu lại bằng cách tủa trong isopropanol và rửa lại bằng cồn 70%. Sau đó, sử dụng nước deion khử trùng có bổ sung RNase 10µg/µl để hòa tan DNA plasmid và loại bỏ RNA có trong dung dịch.
Phương pháp tách plasmid
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang vector pRTRA 35S/IL7- cmyc-histag-100xELP đã được kiểm tra colony PCR trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/L ở 370C qua đêm. Các tế bào E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng được cho vào ống eppendorf 2ml ly tâm thu cặn. Bổ sung sol I (Glucose 50 mM, TrisHcl 25 mM; EDTA 10 mM pH 8,0), voltex để hòa tan và ổn định tế bào. Tiếp tục bổ sung sol II (NaOH 0,2N; SDS 1%), đảo nhẹ để phá vỡ thành và màng tế bào bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Tiếp tục bổ sung sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M), đảo nhẹ để biến tính và tủa DNA hệ gen và protein, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm, thu 800 µl dịch nổi. Bổ sung 800 µl chloroform : isoamylalcohol (24 : 1 v/v), đảo nhẹ, ly tâm 13.000 rpm trong 10
phút, thu 500 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống epppendorf 1,5 ml. Bổ sung 1 ml isopropanol, ủ 30 phút trong -200C, ly tâm thu cặn. Bổ sung 1ml ethanol 70%, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn. Làm khô cặn bằng máy Speed-vac trong 2 phút. Hòa tan DNA bằng 30 µl nước deion khử trùng có bổ sung RNase 10 µg/µl. Bảo quản ở -200C.
*. Thiết kế cấu trúc tối ưu biểu hiện chuyển gen pCB301_IL7/ELP
Thực hiện phản ứng cắt vector pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP và vector pCB301 bằng enzyme HindIII và loại bỏ gốc phosphate bằng enzyme
SAP. Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli DH-5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh
kanamycin 50 mg/l. Plasmid tái tổ hợp pCB301_IL7/ELP sau khi được chọn dòng bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme NcoI sẽ được biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng xung điện để phục vụ cho nghiên cứu biểu hiện tạm thời.
2.2.4. Biểu hiện tạm thời interleukin 7 ở cây thuốc lá
Quá trình biểu hiện tạm thời protein IL-7 gồm các bước chính sau: Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301_IL7/ELP mã hóa cho protein IL-7 và chủng
A.tumefaciens mang vector chứa gene mã hóa cho protein HcPro ức chế câm gene hoạt động trong cây được nuôi cấy riêng trong 200ml môi trường YEB có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamycin 50 mg/ml, nuôi lắc qua đêm ở 280C, 140 rpm. Sau 24 giờ, chuyển 50 ml dịch khuẩn sang bình lớn, bổ sung 500 ml môi trường LB với kháng sinh thích hợp vào hai bình nuôi cấy, nuôi thêm 24 giờ, ở 280C, 140 rpm. Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C để thu cặn khuẩn, hòa trong buffer (10 mM 2 - N - morpholimo MES acid ethanesulphonic, 10 mM MgSO4, pH 5,6). Trộn lẫn 2 dịch khuẩn, pha loãng trong đệm để nồng độ khuẩn cuối cùng OD600 0,5 chuẩn bị cho quá trình biến nạp vào cây thuốc lá N.benthamiana.
Bước 2. Chuẩn bị cây thuốc lá N. benthamiana
Cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro khoảng 4 tuần tuổi được tiến hành ra cây bầu nhỏ. Sau 1 - 1,5 tuần chuyển cây từ bầu nhỏ sang bầu lớn, mỗi ngày tưới 1 - 2 lần nước. Khi cây 4 - 6 tuần và có từ 8 đến 12 lá sẽ được sử dụng để biến nạp infiltration.
Bước 3. Biến nạp
Tiến hành bọc nilon quanh bầu đất và úp ngược cây chìm trong bình chứa dịch khuẩn; đặt vào bình hút chân không. Tiến hành hút chân không ở điều kiện 25 inches Hg trong 2 phút, sau đó xả từ từ. Các cây sau biến nạp được đặt trong nhà kính ở 21oC - 26oC. Sau 6 ngày, tiến hành thu lá và bảo quản ở -80oC để chuẩn bị kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp western blot.