Chúng tôi sử dụng trình tự gene interleukin 7 ở người được công bố trên Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật (Codon Usage Database) [36], cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA trên gen IL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA, kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogene để giảm thiểu sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp.
Kết quả thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, chúng tôi đã thành công trong việc thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 để phù hợp và nâng cao hiệu quả biểu hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với gene gốc, với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt và ghép nối gene trong quá trình thiết kế vector chuyển gene, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI,
HindIII đã được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gene interleukin 7. Đồng thời, chúng tôi cũng thêm các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his- tag cũng được gắn vào đầu 3’ của gene.
Trình tự nucleotide gene interleukin 7 sau khi được tối ưu có kích thước 536bp, được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được nhân dòng trong vector pBSK/IL7.
3.2. Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá
3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được thiết kế kế thừa từ vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng cách loại bỏ và thay thế gene TBAG bằng gene IL-7 được mô phỏng như hình 3.2
Hình 3.2. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
Chúng tôi tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.A cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết.
Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP được xử lý với enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector pRTRA 35S-histag-cmyc-100xELP mở vòng và gene TBAG theo tính toán lý thuyết. Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước 5051 bp để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc- 100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ hợp sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng bằng phương pháp sốc nhiệt.
Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang vector chứa gene mã hóa protein IL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF và IL7_BamHI_R. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng 2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước của gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước của một đoạn promoter (250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của phản ứng colony PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
A B C D
Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép
tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
(A). Kết quả PCR nhân gene IL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI; (C): Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn, (-). Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc- 100xELP bằng enzyme giới hạn BamHI
Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường
chạy 1 trên hình 3.3.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) và gene IL-7 (564bp). Điều này khẳng định, vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α để nhân dòng và sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.