Sau khi biểu hiện thành công protein IL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein IL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag. Phương pháp này
dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ được hoà tan thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole.
Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot. Kết quả thể hiện trên hình 3.10 cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết.
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC
(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein IL-7 sau tinh sạch
(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein IL-7 sau tinh sạch
(C). Định lượng protein IL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C. protein IL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng.
Từ 1kg mẫu lá tươi, sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC và thu nhận lại protein IL-7 tái tổ hợp bằng concentrator iCONTM, nồng độ protein
tổng số được định lượng theo phương pháp của Badford và protein IL-7 được định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. So sánh với một số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein IL- 7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao.
Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và tinh sạch protein IL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn, dễ thực hiện.
Để có thể thu được protein IL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích IL-7.
Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng phương pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein IL-7 tái tổ hợp theo phương pháp mITC (mục 2.2.6.2).
Chúng tôi tiến hành thu lại dịch chiết protein sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch chiết thô qua màng và dịch tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore Q lạnh. Dịch thu được sau từng bước được đo nồng độ protein theo phương pháp Bradford (1976) và phân tích bằng phương pháp lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh sạch và đánh giá hiệu suất thu hồi protein. Kết quả thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.11.
Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào, điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai
không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán.
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC
Dịch chiết protein Protein tổng số (mg) Protein tái tổ hợp (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (%) Dịch thô trước tinh sạch 1634,7 38,3 100 X Dịch IL-7 đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3
Hình 3.11. Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC
M. Thang protein chuẩn; 1. Protein IL-7 tinh sạch sau khi rửa màng bằng nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3. Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch
Hình 3.12. Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch
1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng); 2. Protein IL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh;
3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.
Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein IL-7 bằng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả này tương đương với những nghiên cứu trước đó về hàm lượng protein tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% [47], [143]; 2,2% [1]; 3% [29].
Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt của ELP, đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao. Shoj và cộng sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer và cộng sự (2012) cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp này. Trong nghiên cứu biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận được 367 mg/kg lá tươi. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi tiến hành sản
xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học.