Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuậ- 123docz.net

2.2.5.1. Kỹ thuật PCR

DNA tổng số từ các dòng chuyển gene được tách chiết và sử du ̣ng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.5.2. Lai Western blot Cơ sở lý thuyết

Wertern blot hay còn gọi là protein immuno blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang. Phương pháp này sử dụng điện di trên gel acrylamide để phân tách các protein theo độ dài của mạch polypeptide. Sau đó, chuyển lên màng lai (thường dùng màng nitrocellulose hoặc màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein mục tiêu.

Phương pháp

Tá ch chiết protein tan tổng số

Thu 1 gam sinh khố i nghiền thành bột mi ̣n trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ , bổ sung đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X. Thu di ̣ch nghiền vào ố ng eppendorf 2ml, ly tâm 10.000 rpm ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên. Protein tổng số đươ ̣c đi ̣nh lươ ̣ng bằng phương pháp so màu của Bradford (1976) [20] dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự đổi màu xảy ra khi CBB (Coomasie Brilliant Blue) liên kết với protein trong dung dịch acid.

Điện di protein tổng số và chuyển màng

Protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện không khử , sau đó chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast blotter G2 (Thermo Scientific Pierce) ở 25V, 1,3A trong 20 phút. Tháo màng, tráng bằng nước deion trong 5 phút.

Bảng 2.4. Thành phần gel SDS-PAGE

Thành phần

Gel tách Gel cô

Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml Nước deion 0,55 ml 1,1 ml 0,45 ml 1,3 ml Tris HCl 1,125 ml 1,25ml 0,2 ml 0,5 ml Glycerol 50% 0,9 ml 1,8 ml - - Acrylamid 30% 1,89 ml 3,78 ml 0,14 ml 0,35 ml SDS 10% 45 µl 90 µl 4 µl 10 µl APS 10% 30 µl 60 µl 8 µl 20 µl TEMED 3 µl 6 µl 1 µl 2 µl

* Tris HCl 1,5M; pH 8,8 cho gel tách. Tris HCl 0,5M, pH 6,8 cho gel cô.

Blocking protein

Protein trên màng lai được blocking bằng sữa tách béo 5% (pha trong PBS 0,05% Tween); ủ với kháng thể 1 anti c-myc nồng độ 180 µg/ml pha loãng

tỷ lệ 1 : 100 qua đêm ở 40C, rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút; ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP (Horseradish Peroxidase) pha loãng tỷ lệ 1 : 10.000 trong 1 giờ. Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 10 phút

Hiện màu protein

Sự có mặt của protein interleukin 7 trong mẫu được phát hiện nhờ phản ứng hiện màu bằng cơ chất DAB (Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi hiện băng màu nâu.

2.2.5.3. Sử dụng kỹ thuật ELISA để phân tích sự tích lũy IL-7 tái tổ hợp

Kỹ thuật ELISA gián tiếp đi ̣nh lượng protein interleukin 7 thông qua đi ̣nh lượng protein c-myc được tiến hành theo phương pháp của Sun và cộng sự với một số cải tiến (2006) [88], gồm các bước chính: Bước 1: Pha loãng dịch chiết protein tổng số củ a các mẫu chứa interleukin 7 đến nồng độ 200 μg/ml, sử dụng 100 μl mẫu tra vào các ô trên đĩa microplate, mỗi mẫu lặp la ̣i 3 lần;

Bước 2: Ủ qua đêm ở 40C; rử a đĩa 2 lần bằng PBS-T (Tween 0,05%); Bước 3: Blocking bằng sữa tách béo 5% pha trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng; rử a đĩa 2 lần; Bước 4: Ủ vớ i kháng thể 1 anti c-myc (180μg/ml) pha loãng 1:100 trong 2 giờ ; lặp lại 3 lần; Ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hơ ̣p HRP (Thermo scientific Pierce) pha loãng 1:10.000 trong 1 giờ và cơ chất hiện màu là TMB; Bước 5: Dù ng HCl 1N để dừng phản ứng màu; Đo màu ở bước sóng 630nm.

Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Mục lục