Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch. Interleukine 7 (hIL7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T 13. Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đich tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người. Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn. Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như2 chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luy trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Nhăm mục đich nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và hIL7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”.
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Chu Hoàng Hà PGS TS Lê Văn Sơn THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS TS Chu Hoàng Hà PGS TS Lê Văn Sơn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố Tạp chí Khoa học; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn, tham khảo ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 01 tháng năm 2017 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Hà, PGS TS Lê Văn Sơn, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS Phạm Bích Ngọc, TS La Việt Hồng, ThS Lê Thu Ngọc, ThS Nguyễn Thu Giang tồn thể chú, anh chị bạn Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật Phòng cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, người tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm phòng Tơi xin chân thành cảm ơn GS TS Chu Hồng Mậu, PGS TS Nguyễn Thị Tâm thầy cô giáo khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học Tơi xin cảm ơn phòng Đào tạo, cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi mặt quản lý suốt q trình tơi học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học phòng chức tạo điều kiện thuận lợi cho công tác để yên tâm học tập Cuối tơi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu sắc Những người ln bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 01 tháng năm 2017 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa lý luận thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa lý luận 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò cytokine interleukine hệ miễn dịch người 1.1.1 Cytokine 1.1.2 Interleukine 10 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học16 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng giới 16 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nước 18 1.3 Một số hệ thống biểu protein người tái tổ hợp 19 1.3.1 Hệ thống biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn 19 1.3.2 Dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) 20 1.3.3 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 22 1.3.4 Cây chuyển gen biểu cytokine tái tổ hợp 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Vật liệu thực vật 29 2.1.2 Các chủng vi khuẩn 29 2.1.3 Các gen vector 30 2.1.4 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 2.1.5 Hóa chất thiết bị máy móc 31 2.1.6 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu protein thực vật 34 2.2.2 Thiết kế mồi 35 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp 35 2.2.4 Phương pháp biểu gen vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc BY2, rễ tơ thuốc 44 2.2.5 Phân tích tiêu sinh lý dòng chuyển gen 47 2.2.6 Phân tích dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 48 2.2.7 Tinh protein hIL-7 tái tổ hợp 50 2.2.8 Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp 50 2.2.9 Phân tích thống kê kết thực nghiệm 52 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu thực vật 53 3.2 Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc thuốc 57 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 57 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 59 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 61 3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 63 3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp 68 3.3.1 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp vi khuẩn 68 3.3.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY2 72 3.3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen 83 3.3.4 Biểu protein hIL-7 thuốc bằng Agro-infiltration 91 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 tái tổ hợp 99 Chương BÀN LUẬN 101 4.1 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp E coli rosetta-gami B 101 4.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY-2, rễ tơ 103 4.3 Biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc 106 4.4 Tăng cường biểu protein thực vật với ELP tinh mITC 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC 138 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự AIDS Tiếng Anh Tiếng Việt Acquired immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch syndrome mắc phải người A tumefaciens Agrobacteria tumefaciens A rhizogenes Agrobacteria rhizogenes AS Acetosyringone bp Base pairs Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết bò BY2 Bright yellow Cal Calreticulin cDNA Complementary DNA ADN bổ sung Cetyl trimethyl Chất hoạt động bề mặt ammonium ammonium bromide bromide DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate DTT Dithiothreitol E Coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic Enzyme-linked Kỹ thuật phát kháng nguyên, immunosorbent assay kháng thể mẫu xét nghiệm CTAB ELISA ELP Elastin-like peptide FDA Food & drug administration FGF8b Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào isoform b sợi isoform b hIL-7 Human interleukin Interleukin người HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E người HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú người HRP Horseradish peroxidase IFN Interferon IL Interleukin IMAC IPTG Immobilized metal ion affinity chromatography Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo danton LB Luria and Bertani MHC Major histocompatibility complex mITC mRNA Sắc kí ion cố định kim loại Membrane-based inverse transition cycling ARN messenger đơn vị protein Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn theo Luria Bertani Phức hệ phù hợp tổ chức Đảo ngược theo màng ARN thông tin Môi trường dinh dưỡng MS Murashige and Skoog nuôi cấy mô thực vật theo Murashige Skoog NK cell Natural killer cell tế bào miễn dịch tự nhiên Neomycin phosphotransferase Gen kháng kháng sinh II gen kanamycine OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate nptII PBST Phosphate buffer saline + tween 20 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng western blot Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ thực vật RNAi RNA interference ARN can thiệp RNase Ribonuclease phân giải ARN Rpm Revolutions per minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis siRNA small interfering RNA TAE Tris acetate EDTA TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine UV Ultraviolet Tia tử ngoại vir Virulence region Vùng gây độc v/v Volume/volume thể tích/thể tích WPM Woody plant medium WT Wild type Chủng hoang dại w/v weight/volume khối lượng/thể tích YEB Yeast extract broth YMB Yeast malnitol broth Môi trường nuôi cấy theo Mccown ... nuôi cấy thực vật Mục tiêu nghiên cứu Xác định hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ưu protein hIL -7 tái tổ hợp Thu nhận tinh protein hIL -7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên. .. cứu Đổi mã di truyền gen hIL -7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL -7 tái tổ hợp phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp. .. 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 63 3.3 Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp 68 3.3.1 Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp vi khuẩn 68 3.3.2 Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp dòng tế bào BY2 72 3.3.3 Biểu protein