Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Chu Hoàng Hà

2 PGS TS Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS TS Chu Hoàng Hà và PGS TS Lê Văn Sơn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học; phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS TS Nguyễn Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này

Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản lý trong suốt quá trình tôi học tập tại Trường

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu sắc Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu của mình

Thái Nguyên, ngày 25 tháng 11 năm 2017

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của luận án 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án 3

4.1 Ý nghĩa lý luận 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

5 Đóng góp mới của luận án 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ miễn dịch ở người 4

1.1.1 Cytokine 4

1.1.2 Interleukine 7 11

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16 1.2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới 16

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước 18

1.3 Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp 20

1.3.1 Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn 20

1.3.2 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) 21

1.3.3 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 23

1.3.4 Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.1.1 Vật liệu thực vật 30

2.1.2 Các chủng vi khuẩn 30

2.1.3 Các gen và vector 31

2.1.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 31

2.1.5 Hóa chất và thiết bị máy móc 31

2.1.6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật 35

2.2.2 Thiết kế mồi 36

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp 36

2.2.4 Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá 45

2.2.5 Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen 49

2.2.6 Phân tích các dòng chuyển gen b ng k thuật sinh học phân tử 50

2.2.7 Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp 52

2.2.8 Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp 52

2.2.9 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm 54

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55

3.1 Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật 55

3.2 Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá 59

3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 59

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 61

3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 63

3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 66

3.3 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp 71

3.3.1 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn 71

3.3.2 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 76

3.3.3 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen 87

3.3.4 Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá b ng Agro-infiltration 96

3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp 105

Chương 4 BÀN LUẬN 107

4.1 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E coli rosetta-gami B 107

4.2 Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ 109

4.3 Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá 112

4.4 Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC 113

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 119

PHỤ LỤC 145

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immunodeficiency

syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người

A tumefaciens Agrobacteria tumefaciens

A rhizogenes Agrobacteria rhizogenes

CTAB Cetyl trimethyl

ammonium bromide

Chất hoạt động bề mặt ammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate

E.Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic

ELISA Enzyme-linked

immunosorbent assay

K thuật phát hiện kháng nguyên, kháng thể trong mẫu xét nghiệm ELP Elastin-like peptide

FDA Food & drug administration Cục quản lý thực phẩm và dược

hIL-7 Human interleukin 7 Interleukin 7 của người

HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người

HRP Horseradish peroxidase

IMAC Immobilized metal ion affinity

chromatography Sắc kí ion cố định kim loại

β-D-1-thiogalactopyranoside

vi khuẩn theo Luria và Bertani MHC Major histocompatibility complex Phức hệ phù hợp tổ chức

mITC Membrane-based inverse transition

Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật theo Murashige và Skoog

NK cell Natural killer cell tế bào miễn dịch tự nhiên

nptII Neomycin phosphotransferase

II gen

Gen kháng kháng sinh kanamycine

PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate

PBST Phosphate buffer saline + tween 20

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng trong western blot

Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật

scFv Single-chain variable fragment

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis siRNA small interfering RNA

TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u

TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

Mccown

YEB Yeast extract broth

YMB Yeast malnitol broth

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân nhóm IL ở người 7

Bảng 1.2 Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2 21

Bảng 1.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật 25

Bảng 2.1 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án 30

Bảng 2.2 Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LR 40

Bảng 2.4 Thành phần gel SDS-PAGE 49

Bảng 3.1 Xử lý mẫu protein với DTT 71

Bảng 3.2 Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7 74

Bảng 3.3 Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2 75

Bảng 3.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2 78 Bảng 3.5 Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc lá trên môi trường chọn lọc 84

Bảng 3.6 Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7 84

Bảng 3.7 Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7 87

Bảng 3.8 Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm) 89

Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp b ng phương pháp mITC 97

Bảng 3.10 Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 b ng protein hIL-7 99

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7 11

Hình 1.2 Thụ thể hIL-7 12

Hình 1.3 Vai trò của hIL-7 15

Hình 1.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2) 22

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 33

Hình 2.2 Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal 38

Hình 3.1 Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu hiện trong hệ thống thực vật 54

Hình 3.2 Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7 khi biểu hiện trong hệ thống thực vật 55

Hình 3.3 Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền 56

Hình 3.4 Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7 57

Hình 3.5 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 58

Hình 3.6 Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7 59

Hình 3.7 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 60

Hình 3.8 Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7 62

Hình 3.9 Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 b ng enzyme SacI và HindIII 62

Hình 3.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 63

Hình 3.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 65

Hình 3.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 66

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

b ng enzyme NcoI 67

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta 69

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28o C 70

Hình 3.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan b ng Western blot 72

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58 73

Hình 3.18 Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen 74

Hình 3.19 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen b ng IL7_F và IL7_R 76

Hình 3.20 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen b ng cặp mồi gen virC 77

Hình 3.21 Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy 77

Hình 3.22 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2 chuyển gen (theo khối lượng tươi) 79

Hình 3.23 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2 chuyển gen (theo khối lượng khô) 80

Hình 3.24 Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào huyền phù BY2 b ng Western blot 82

Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen 83

Hình 3.26 Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7……… 85

Hình 3.27 Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ b ng cặp mồi IL7_F và IL7_R 85

Hình 3.28 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi) 88

Hình 3.29 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô) 88

Hình 3.30 Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ b ng Western blot 90 Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen 90 Hình 3.32 Kết quả colony PCR b ng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R 91

Hình 3.33 Kết quả cắt kiểm tra b ng enzyme giới hạn NcoI 92 Hình 3.34 Trang thiết bị biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

cây thuốc lá 93 Hình 3.35 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá b ng Western blot 94 Hình 3.36 Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 b ng phương pháp

Hình 3.37 Kết quả tinh sạch protein hIL-7 b ng phương pháp mITC 97 Hình 3.38 Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp b ng Western blot 98 Hình 3.39 Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp 100

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch

Interleukine 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [13] Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái

tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Thực tế hiện nay phương pháp này

đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởngv.v… mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác

như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích lu trong tế bào nên việc thu hồi

và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh

ở người

Nh m mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách tối ưu Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi

quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7 tái tổ hợp

Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật

3 Nội dung nghiên cứu

Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật

Biểu hiện proteinhIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen

Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy thực vật

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án

4.1 Ý nghĩa lý luận

Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua biến đổi mã di truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật

Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên nói chung

và sinh học nói riêng

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở các hệ thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá chuyển gen trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối

tế bào

Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn

5 Đóng góp mới của luận án

Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein

hIL-7 ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen

Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen Trong đó, protein biểu hiện cao nhất ở cây thuốc lá chuyển gen 5 ngày tuổi với hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao

Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về biểu hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VAI TRÕ CỦA CYTOKINE VÀ INTERLEUKINE 7 TRONG HỆ MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI

1.1.1 Cytokine

1.1.1.1 Vai trò trong hệ miễn dịch người

Cytokine là các polypeptide được sản xuất khi có kích thích của vi sinh vật hay các kháng nguyên khác nh m điều hòa các phản ứng miễn dịch và viêm của cơ thể Những phân tử này điều hòa các hoạt động chức năng của từng tế bào riêng biệt và của cả tổ chức trong trường hợp sinh lý và bệnh lý Các protein này cũng làm trung gian điều hòa trực tiếp sự tương tác giữa các

tế bào và kiểm soát các quá trình xảy ra trong khoang ngoại bào Cytokine hoạt động như những yếu tố giúp tế bào sống sót b ng cách ngăn hiện tượng apoptosis xảy ra

Cytokine gồm một số nhóm có mối liên hệ mật thiết, tác động qua lại với nhau trong hệ thống miễn dịch của người để thực hiện chức năng của chúng.Thuộc các cytokine này có chemokine, họ yếu tố hoại tử khối u (TNF),

họ các interferon và họ interleukin Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm; chúng có vai trò khá quan trọng trong các bệnh lý như: bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư,viêm gan siêu vi, nhiễm HIV v.v… Ngoài ra, cytokine còn được dùng làm các tác nhân trị liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt sử dụng trong huyết học) hay các đích điều trị (như các loại TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v…) [64],

[164]

1.1.1.2 Cơ chế hoạt động

a Chemokine

Chemokine là những cytokine được sản xuất trong giai đoạn sớm nhất của nhiễm trùng Chúng phát huy tác dụng hóa ứng động đến các tế bào có khả năng đáp ứng gần đó Cơ chế hoạt động của chemokine thể hiện ở khả năng tập trung các loại tế bào bạch cầu của cơ thể chủ đến vị trí nhiễm trùng Chemokine hiện diện trên tế bào nội mô tác động lên các bạch cầu đi qua làm cho các integrin bạch cầu tăng ái lực kết gắn với ligand của chúng Điều này rất quan trọng để giữ bạch cầu lại nội mô của mao mạch vùng tổn thương Ngoài ra, chemokin còn kích thích sự di chuyển của bạch cầu đến nơi có tổn thương trên cơ sở sự chênh lệch nồng độ của chemokin tại nơi tổn thương và các nơi khác Các chemokin khác nhau kích thích các tế bào khác nhau nhờ thế mà kiểm soát được thành phần của các tế bào tại ổ viêm Chemokin điều hòa sự lưu thông của tế bào lympho và các bạch cầu khác trong các mô lympho ngoại biên Các chemokin có khả năng thúc đẩy các tế bào đã được hoạt hóa và tế bào T di chuyển đến các mô không phải thuộc hệ lympho bao gồm cả da và niêm mạc [64], [152]

b Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)

TNF có khả năng kích thích tập trung tế bào trung tính và tế bào mono đến nơi nhiễm trùng và hoạt hoá những tế bào này để tiêu diệt vi khuẩn Ngoài ra, TNF còn có khả năng kích thích tế bào nội mô và đại thực bào tiết

ra chemokine nh m tăng cường ái lực của integrin bạch cầu đối với ligand của chúng, tạo nên sự tập trung bạch cầu; đặc biệt chúng còn kích thích thực bào đơn nhân tiết interleukine 1 - là chất có tác dụng rất giống với TNF [82]

TNF tác động lên tế bào gan làm tăng tổng hợp protein huyết thanh, dưới tác động của TNF, interleukine 1 và interleukine 6 tạo nên đáp ứng pha cấp của phản ứng viêm Với nồng độ thấp, TNF tác động lên bạch cầu và nội

mô để khởi động phản ứng viêm.Ở nồng độ trung bình, TNF làm trung gian cho các tác động toàn thân của phản ứng viêm.Đặc biệt, với nồng độ cao TNF

có thể gây ra các bất thường bệnh lý của sốc nhiễm trùng có thể gây tử vong [154], [158]

c Họ interferon (IFN)

IFN là những protein kháng virus được tế bào sản xuất khi bị nhiễm virus gây bệnh nào đó Chúng có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm trùng virus và thúc đẩy đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật nội bào IFN ức chế sự nhân lên của virus b ng cách kích thích tế bào sản xuất ra nhiều loại enzyme như 2’,5’-oligoadenylate synthetase ngăn cản sự sao chép của virus DNA hoặc RNA và sự nhân lên của chúng[106]

IFN có tác dụng làm bộc lộ phân tử MHC lớp I Tế bào T CD8+

có khả năng nhận diện kháng nguyên lạ liên kết với MHC lớp I, qua đó tế bào gây độc nhận ra tế bào chứa virus và tiêu diệt chúng Ngoài ra, IFN còn có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào Th1 trong hệ miễn dịch của người, giúp gia tăng hoạt tính ly giải tế bào của tế bào NK [64], [142]

d Họ Interleukine

Interleukine (IL) là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người Chúng có chức năng điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển

và bám dính Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch của cơ thể [25], [82]

Interleukine được chia thành nhiều loại khác nhau từ IL-1 đến IL-36 dựa vào đặc điểm cấu trúc của chúng Ví dụ, IL-1 được phân biệt với các IL khác bởi sự gấp nếp nhiều hơn ở chuỗi [158] Ngoài ra, chúng còn được xếp vào các nhóm khác nhau gọi là cytokine nhóm I và cytokine nhóm II IL-10

và IL-28 được xếp vào cytokine nhóm II vì có cấu trúc phân tử gần giống

nhau, đều có sáu hoặc bảy xoắn  xếp song song nhau [39], [76], [170] IL-28 cũng có cấu trúc intron-exon tương tự IL-10 [135]

Kích thích tế bào T hỗ trợ; bảo

vệ và kích hoạt tế bào B, tế bào NK

IL-2 Tế bào Th1

CD25/IL2RA, CD122/IL2RB, CD132/IL2RG

Tham gia kích hoạt tế bào B,

T và NK

IL-3

Tế bào T hỗ trợ, tế bào mast, NK

CD123/IL3RA, CD131/IL3RB

Hỗ trợ tế bào mast tổng hợp histamin

IL-4 Tế bào Th2,

đại thực bào

CD124/IL4R, CD132/IL2RG

Tham gia kích hoạt tế bào B,

hỗ trợ tăng sinh tế bào T

IL-5 Tế bào Th2, tế

bào mast

CD125/IL5RA, CD131/IL3RB

Tham gia sản xuất eosinophils

và IgA

IL-6

Tế bào Th2, tế bào B, tế bào hình sao, nội mạc

CD126/IL6RA, CD130/IL6RB

Hỗ trợ và bảo vệ các tế bào B,

T và NK; cân b ng nội môi,

mô, đại thực bào

CXCR1/IL8R, CXCR2/IL8RB/CD128

Tác động hướng hoá lên bạch cầu trung tính, tế bào lympho

IL-9 Tế bào Th2 CD129/IL9R Kích thích tế bào mast

IL-10

Tế bào Th2, monocytes, CD8+ T

IL-11 Tuỷ xương IL11RA Sản xuất protein pha cấp, kích

thích tạo máu

IL-12

Tế bào đuôi gai, tế bào lympho B, T, đại thực bào

CD212/IL12RB1IL12RB2

Tham gia kích hoạt tế bào T, kích thích tế bào NK sinh IFN-γ, TNF-α

IL-13

Tế bào NK, tế bào mast, tế bào Th2 đang hoạt động

IL13R

Kích thích sự tăng trưởng và biệt hoá của tế bào B (IgE), ức chế tế bào Th1 và sản xuất các cytokine gây viêm đại thực bào (IL-1, IL-6) và giảm IL-8, IL-10, IL-12

IL-14

Tế bào T và một số tế bào B

ác tính

-

Kiểm soát sự tăng trưởng và phát triển của các tế bào B, ức chế tiết Ig

IL-15 Thực bào đơn

nhân, các đại IL15RA

Kích thích sản xuất các tế bào miễn dịch tự nhiên (tế bào

thực bào sau nhiễm trùng bởi virus

NK), tế bào T CD8+

IL-16

Tế bào lympho, biểu mô, bạch cầu ái toan, tế bào CD8+ T

IL-17 Tế bào Th17 CDw217/IL7R

AIL7RB

Tăng nồng độ các cytokine trong phản ứng viêm

IL-18 Đại thực bào CDw218a/IL18

R1

Kích thích sản xuất yếu tố IFN, tăng hoạt động của tế bào NK

IL21R

Tham gia hoạt hoá CD8+ T, tăng cường NK độc tế bào, thúc đẩy sự phân hoá của các

tế bào Th17

IL-22 Tế bào hỗ trợ

Sản xuất defensins từ các tế bào biểu mô Hoạt hoá STAT1

và STAT3, làm tăng protein pha cấp như amyloid huyết thanh A và haptoglobin trong

tế bào gan

IL-23 Đại thực bào, IL23R Bảo vệ các tế bào sản xuất

IL-tế bào đuôi gai 17, làm giảm xâm nhập CD8

T

IL-24 Tế bào T, bạch

cầu đơn nhân IL20R

Tham gia ức chế khối u, làm lành vết thương và bệnh vẩy nến, biểu hiện cytokine viêm

IL-25

Tế bào T, bạch cầu ái toan, đại thực bào

LY6E Kích thích sản xuất IL-4, IL-5,

IL-13

IL-26 Tế bào T, tế

bào mono IL20R1

Tăng tiết IL-10 và IL-8; biểu hiện CD54 trên tế bào biểu

mô

IL-27 Đại thực bào,

tế bào đuôi gai IL27RA

Điều hoà hoạt động của tế bào lympho B và T

chống lại virus

chống lại vi khuẩn

IL-31 Tế bào Th2 IL31RA Có thể đóng vai trò trong viêm

da

Kích thích bạch cầu đơn nhân

và đại thực bào tiết TNF-, IL-8 và CXCL2

sản xuất cytokine typ 2

IL-35 Tế bào T - Ức chế hoạt hoá tế bào T hỗ

trợ

đuôi gai và tế bào lympho T

1.1.2 Interleukine 7

1.1.2.1 Cấu trúc gen hIL-7

hIL-7gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4

kDa và được ổn định b ng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu

nối disulfide nội phân tử[169] Ở người, genhIL-7 có kích thước 33Kb, gồm

có 6 exon và 5 intron n m trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13 Cấu trúc

phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh (2,1 - 8,0) [33] Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung

2-mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết cầu nối

disulfide có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [14]

Hình 1.1.Cấu trúc proteinhIL-7[65]

hIL-7 cấu tạo gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, liên kết với nhau bằng gốc N-glycosyl hóa hoặc O-glycosyl hóa và các cầu nối disulfide hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex

[102] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989[103].hIL-7 có vai trò

quan trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [97], [98]

hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [102], [163] Ngoài ra, các tế bào khác như các tế bào tủy [47], nội mạc ruột [162]và tế bào sừng trên da [57] cũng có thể sản xuất hIL-7 Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra r ng hIL-7 còn được sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào

T của hạch bạch huyết [84]

1.1.2.2 Thụ thể của hIL-7

hIL-7 có hai thụ thểlà IL-7Rα và thụ thể γc Trong đó, thụ thể IL-7R

(CD127) cũng là thụ thể của các lymphoprotein mô đệm tuyến ức (TSLP)[175] và chuỗi  (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 và IL-

21 [29], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ miễn dịch người [41] Trong khi thụ thể c thường thấy ở các tế bào tạo máu thì IL-7R lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết Gen mã hóa cho protein thụ thể hIL-7 n m ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí của thụ thể hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào bạch cầu có đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thểhIL-7[57]

Khối lượng phân tử của protein thụ thể hIL-7 là 80kDa Chuỗi γc là thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và thụ thể hIL-7 Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và dạng hòa tan Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [57]

Hình 1.2 Thụ thể hIL-7[151]

hIL-7 có chung chuỗiγc với IL-2, IL-4, IL-9, IL-15, IL-21

và chung chuỗi IL-7Rα với TSLP

1.1.2.3 Cơ chế tác động

Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi c [146] trong khi Jak1 gắn với IL-7R[125] Sự đột biến ở chuỗi c [24], [37], [111] hoặc Jak3 [16], [109], [117] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng AIDS ở người, đặc trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK[110] Khi hIL-7 gắn với IL-7R mang theo chuỗi c liên kết với Jak1 và Jak3, sẽ làm hoạt hoá kinase và phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7R[62] Sau đó, các thụ thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2-phosphothyrosine để thực hiện các chức năng.Các tiểu đơn vị p85 của PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2

Các PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các genPDK1 và Akt [137].Akt sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến

triển của chu kì tế bào như GSK3, P27 hIL-7 điều khiển quá trình này b ng việc phosphoryl hoá GSK3, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân

tử tín hiệu của tế bào -catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố phiên mã khác như TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [101]

hIL-7 có tính đặc hiệu cao với thụ thể hIL-7 Sweeney và cộng sự đã chứng minh yếu tố DAB389gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có mặt thụ thể hIL-7, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nh m chống lại các khối u ác tính mang thụ thể hIL-7 Sự biểu hiện của thụ thể hIL-7 cũng có thể được coi là mục tiêu điều trịcác khối u ác tính[147]

Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R bởi khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [47]

1.1.2.4 Hoạt tính sinh học của hIL-7

hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại các yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T[104] và kích thích tế bào lympho B và lympho T phát triển[14], [33].hIL-7 giúp tăng cường sự phát triển của tế bào thực bào tự nhiên và thúc đẩy sự sinh trưởng và biệt hoá của các dòng tế bào lympho T [119], [124], [138], đồng thời tăng cường hệ thống,kích thích sự hoạt động của bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi [14] hIL-7

có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong trạng thái giảm bạch cầu lympho như ở những bệnh nhân AIDS [47], [111] hoặc sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ trị [57], [101]

Apoptosis là một quá trình phức tạp của các hoạt động thông qua các yếu tố trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng cytokine cần thiết hoặc do sự tham gia của một thụ thể chết với TNF làm tế bào tự chết theo một chu trình Theo nhiều nghiên cứu, hIL-7 có khả năng ngăn chặn hoặc làm chậm lại quá trình apotosis Morrissey (1991) đã chỉ ra r ng tế bào lympho T đáp ứng với phorbal myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình apoptosis Khi loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá

trình apoptosis của tế bào bị chặn lại, tế bào lympho T sẽ sống sót lâu hơn [97] Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng của hIL-7 để ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis Cytokine sử dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2, IL-4, IL-9

và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định hIL-7 có thể duy trì khả năng tồn tại của tế bào b ng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc kích hoạt yếu tố “thúc đẩy sự sống” [98]

Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình apoptosis b ng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [14], [41] Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế bào chết b ng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad hoặc Bax [57], [68],[114] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với gen V, D, J tái tổ hợp để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong

sự hiện diện của hIL-7 tái tổ hợp [162].Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào quá trình cân b ng nội môi của tế bào T CD8+

ở các tế bào lymphopenic

và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của IL-15 [133]; làm tăng khả năng sinh kháng thể chống ung thư [120]

1.1.2.5 Vai trò của hIL-7

Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh như bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [65], [130], bệnh cúm A [10], một

số bệnh tự miễn [27]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm đường mật cấp tính [145], ung thư đại trực tràng (CRC) [78], bệnh viêm gan B[173] v.v… đã thu được nhiều kết quả khả quan

Hình 1.3 Vai trò của hIL-7[151]

hIL-7 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch type I, hoạt hóa tế bào LAK, ngăn cản hiện tượng apoptosis, thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào lympho T CD4 + và CD8 + , giảm sản xuất TGF β trong điều trị các khối u

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨUVÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một cytokine có hoạt tính chống virus Trong những thập niên vừa qua, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm

Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như: bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm đại tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến ), viêm gan siêu vi, nhiễm HIV v.v Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân trị liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các đích điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v )

Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học Hàng loạt các cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng nhưhIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [79], [92] Ngoài ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn hạn chế do chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ khác như TNF-, hIL-12 v.v…

Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động theo bốn hướng chính

Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây bệnh Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF 

trong điều trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng thấp v.v…

Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể: erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong điều trị giảm bạch cầu v.v…

Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch hIL-6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng

thể hIL-6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào huyết tương và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất kháng thể b ng cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B thông qua sự sản xuất IL-21 v.v… Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus viêm gan b ng interferon, hIL-12 [48], [70], điều trị ung thư b ng hIL-2 v.v…

Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị bệnh nhưhIL- 11 và hIL-3 được sử dụng để điều trị bệnh thrombocytopenia

do chúng có khả năng kích thích sự tạo thành tiểu cầu [132] hIL-2 được sử dụng để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết, đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi phục mạch bạch huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm

hệ miễn dịch như HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các

tế bào bạch cầu lympho T CD4+ và T CD8+ hIL-12 được sử dụng để làm tá chất cho sản xuất vaccine [12], [15]

Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho

sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV Những sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon, infergen) và peginterferon (PEG-IFN) Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ thể b ng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao hơn đường tiêm [18]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao

công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh cho con người

Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất

interleukin-2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm interleukin-2010 do PGS TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [2] Điều này mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của

tổ chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của bản đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư [166]

Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM đang tiến hành các nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL-1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005 Cytokine hIL-33 giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của

cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều trị hen suyễn ở chuột Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [3]

1.3 MỘT SỐ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

1.3.1 Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn

Những năm gần đây, cùng với sự bùng nổ của ngành công nghệ sinh học với nhiều nghiên cứu, ứng dụng trong cuộc sống, ngành công nghệ sinh phẩm với các chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật ứng dụng trong y học ngày càng được quan tâm chú trọng Số lượng protein tái tổ hợp, trong đó có các loại cytokine được tạo ra cho mục đích chữa bệnh cho con người ngày càng tăng

Vi khuẩn E colilà vi khuẩn gram âm, có kích thước khoảng 1,0 x 6,0

µm có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, thời gian sinh trưởng nhanh, khả năng thu nhận protein đích với hàm lượng cao v.v… nên thường được lựa chọn là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp Tuy

nhiên, hệ thống biểu hiện E.coli cũng có những hạn chế như khi biểu hiện

protein của gen eukaryote cần phải thay đổi các codon hiếm ở gen ban đầu

b ng các codon phổ biến ở E coli,protein ngoại lai thường tích lu ở dạng thể

vùi trong tế bào làm giảm hoặc mất hoạt tính sinh học, quá trình cắt methionine đầu N của protein ngoại lai khó khăn; mức độ biểu hiện còn phụ thuộc nhiều yếu tố như: đặc điểm của gen ngoại lai (bộ ba mã hiếm, hàm lượng GC v.v…) [36], điều kiện biểu hiện (nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng v.v…), tính chất của protein (số lượng cầu disunfide, trọng lượng phân tửv.v…) [140] Đặc biệt, khi sản xuất các loại protein sử dụng trong y học ở

E colicòn có sự tích lu của các chất gây sốt có thành phần là

lipopolysaccharide, là một nội độc tố đối với con người, gây phản ứng phụ cho người khi sử dụng qua đường tiêm nếu không được loại bỏ sau khi tinh sạch protein [150]

Hiện nay, có rất nhiều chủng E coli được nghiên cứu để biểu hiện protein tái tổ hợp với các vector biểu hiện khác nhau như BL21, BL21 (DE3)

pLysS, M15, Tuner, Rosetta, Origami, Rosetta-gami, AD494 v.v Trong đó,

chủng Rosetta-gami có nguồn gốc từ chủng Origami, mang plasmid pRARE

mã hoá cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng

cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất và có thể sử dụng cùng với các vector chuyển gen pET-44, pET-43.1, pET32 (a, b, c) để tăng cường khả năng biểu hiện protein của gen có nguồn gốc từ eukaryote

Mặc dù còn hạn chế, nhưng hiện nay hệ thống biểu hiện protein ở vi khuẩn vẫn được nghiên cứu sử dụng nh m mục đích thử nghiệm, so sánh mức

độ biểu hiện protein tái tổ hợp giữa các hệ thống nuôi cấy, đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trước khi biểu hiện ở các hệ thống khác Theo Sanchez-Garcia (2016), hiện nay vẫn có tới 86% protein tái tổ hợp dùng trong

điều trị ung thư là biểu hiện và thu nhận qua hệ thống E coli, nên đây vẫn là

một hệ thống đang được quan tâm hiện nay

1.3.2 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)

Những thập niên gần đây, cùng với các hệ thống biểu hiện vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng, tế bào động vật v.v… thì hệ thống thực vật đang ngày càng tỏ ra có nhiều ưu điểm hơn khi biểu hiện các loại protein tái tổ hợp [59], [60], [128] Trong đó, hệ thống dòng tế bào huyền phù BY2 mang nhiều ưu điểm hơn so với các hệ thống khác như tránh được thời tiết bất thường của tự nhiên, loại bỏ được nguy cơ việc du nhập gen ra ngoài môi trường và không tiềm ẩn những bệnh lây nhiễm trên động vật[96] BY2 có khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng từ 80-100 lần trong vòng một tuần [74] Một đặc điểm ưu việt khác nữa là

BY2 đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen b ng vi khuẩn Agrobacterium[100],

và bản thân BY2 là tế bào nhân thực nên nó có thể thực hiện nhiều quá trình cải

biến sau dịch mã, điều này mở ra triển vọng biểu hiện các protein tái tổ hợp để giữ được hoạt tính giống như protein ngoài tự nhiên [80] Hiện nay, chưa có một nghiên cứu lâm sàng nào chỉ ra được sự khác nhau về khả năng tạo đáp ứng miễn dịch giữa một loại protein tái tổ hợp sản xuất từ thực vật với sản xuất

b ng tế bào động vật; điều này cho thấy khả năng thu nhận được protein tái tổ hợp từ tế bào thực vật nói chung và tế bào huyền phù BY2 nói riêng có cấu trúc

và hoạt tính sinh học rất giống với protein tự nhiên[127], [149]

Bảng 1.2.Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2

Cytokine Đặc điểm của cassette biểu hiện Hàm lƣợng protein thu đƣợc

Erythropoietin Promoter và terminator 35S 25 pg/l[93]

G-CSF Promoter 35S cùng trình tự tăng

cường biểu hiện, nos terminator 105 µg/l[58]

GM-CSF Promoter 35S, his tag, terminator T7 150 µg/l (trong tế bào); 250

µg/l (tiết ra môi trường) [40] IL-2 Promoter 35S, terminator T7 0,09 mg/l[89]

IL-4 Promoter 35S CaMV, terminator T7 0,45 mg/l[89]

IL-12 Promoter 35S cùng hai trình tự

Ngoài ra, dòng tế bào BY2 có thể được sử dụng làm mô hình để nghiên cứu sự biểu hiện, sự hoàn thiện và ổn định của các protein tái tổ hợp mong muốn [120] như kháng thể biscFv [44], kháng thể đơn dòng của người kháng kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (mAb against HbsAg) [167], albumin huyết thanh người tái tổ hợp (recombinant human serum albumin-rHSA) [144] Một số nghiên cứu đã chuyển sang giai đoạn sản xuất protein tái

tổ hợp ở quy mô công nghiệp b ng hệ thống BY2 như sản xuất protein tái tổ hợp hydrophobin [123]

Với các ưu điểm của BY2 và những thành công trong nghiên cứu đã đạt được, việc sản xuất protein tái tổ hợp trong các dòng tế bào thuốc lá BY2 là một trong những hướng nghiên cứu có triển vọng, cũng như kiểm tra mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật trước khi được chuyển vào cây chủ

1.3.3 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các loại dược chất quan trọng đối với con người Ngày nay, từ những thành tựu của khoa học hiện đại, bao gồm cả công nghệ sinh học phân tử giúp cho thực vật trở thành nguồn sản xuất các hợp chất có giá trị như: các cytokine, kháng nguyên vaccine và kháng thể v.v… [21], [22], [23], [52], [85], trong đó, rễ tơ được sử dụng cho mục đích sản xuất protein tái tổ hợp và các chất chuyển hóa thứ cấp do có nhiều ưu điểm như chi phí sản xuất tương đối thấp, quá trình vận hành đơn giản, sản xuất các hợp chất đặc trưng cho các tế bào nhân chuẩn có hoạt tính sinh học

do chúng có khả năng cải biến sau dịch mã, an toàn đối với con người do cũng giống như hệ thống huyền phù BY2, chúng không có các loại virus và mầm bệnh gây hại cho người [153]

A B

Hình 1.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)

A Trên môi trường đặc B Trên môi trường lỏng

Rễ tơ (hairy root), bản chất là một bệnh gặp ở thực vật gây ra bởi vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes, đây là một loại vi khuẩn đất thuộc nhóm

Gram âm Khi xâm nhiễm vào thực vật, dưới sự kiểm soát của vùng gây độc, hai vùng phân tán của Ri-plasmid gồm TL (T-left T-DNA) và TR (T-right T-DNA) Trong đó, TR T-DNA chứa các gen sản xuất opine (mannopine hoặc agropine) và các dòng được định rõ đặc điểm nhờ các gen opine đặc trưng của chúng Mặt khác TR T-DNA còn chứa hai gen mã hóa cho sự tổng hợp auxin,

các gen này có độ tương đồng rất cao với các gen auxin của A.tumefaciens Ngược lại, TL T-DNA không tương đồng với T-DNA của A.tumefaciens

Toàn bộ TL T-DNA có tối thiểu 11 khung đọc mở, tương tự với các khung đọc mở đã được tìm thấy ở genome của eukaryote, gồm có promoter và các yếu tố polyadenine hóa cần thiết để thực hiện chức năng khi chuyển vào trong genome thực vật Sau khi xâm nhiễm vào, tại vị trí vi khuẩn xâm nhiễm sẽ hình thành nên rễ tơ [28], [30]

Rễ tơ hiện nay có tiềm năng nghiên cứu, ứng dụng rất lớn do chúng có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, dễ dàng nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn, có thể tạo sinh khối liên tục nên được xem là một trong những xu hướng mới được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Đặc biệt, rễ tơ chuyển gen có mức độ phân hóa cao, có thể sử dụng là nguồn sản xuất ổn định các hợp chất thứ cấp

Mặt khác, vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có thể chuyển T-DNA và cho

phép các gen ngoại lai biểu hiện ở rễ tơ chuyển gen và từ rễ tơ chuyển gen này có thể tái sinh thành cây chuyển gen [28]

Một ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ thực vật so với các hệ thống nuôi cấy thực vật chuyển gen khác là chúng không đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng của môi trường, mùa vụ, sản phẩm protein thu được không

mang các yếu tố độc hại từ thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và rút ngắn được thời gian sản xuất Ngoài ra, sản phẩm sinh học tái tổ hợp thu được thường được biểu hiện ra môi trường nuôi cấy, điều này giúp cho quá trình tinh sạch các sản phẩm sinh học được thuận lợi và đạt độ tinh sạch cao [77]

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã được sử dụng rộng rãi cho nhiều quá trình sản xuất protein tái tổ hợp [165] và các dược phẩm sinh học tái tổ hợp như SEAP (human secreted alkaline phosphatase) [50], kháng nguyên bề mặt HbsAg của virus viêm gan B, các tiểu đơn vị B của độc tố vi khuẩn

Vibrio cholerae, protein vỏ L1 của HPV, protein E2 của virus viêm gan E ở

người HEV, kháng nguyên HA của virus cúm, protein vỏ của virus Rota, glycoprotein của virus dại [21]; protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin

B (GFP-ricin B) [91]; các loại kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể [38]

Giống như hệ thống biểu hiện huyền phù BY2, việc sử dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật để biểu hiện protein tái tổ hợp là một hướng nghiên cứu rất triển vọng, giúp sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp

1.3.4 Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật Những kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [11] Việc sản xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt hướng dương [17], albumin trong thuốc lá và khoai tây [139] đã cho thấy hệ thống nuôi cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động vật có vú, trong đó có con người

Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất

b ng tế bào thực vật cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện

qua promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2, tuy nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan[93]

Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật Ban đầu, chúng được biểu hiện trong thuốc lá [40],[82] và dịch treo tế bào lúa[71], [72], [136] Để tăng năng suất, các loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l Ngoài biểu hiện trên cây thuốc lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây trồng khác như trong lá mía chuyển gen là 0,02% [160], trong lá thuốc lá khoảng 0,22% protein tan tổng số [53], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-CSF tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% protein tan tổng số [129], đặc biệt hàm lượng GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số với lớp vỏ protein biến đổi[174].Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính sinh học của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí nghiệm, và trên cơ thể sống trong mô hình chuột[107]

Bảng 1.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật

biểu hiện

Đặc điểm của cassette biểu hiện

Hàm lƣợng protein thu đƣợc

GM-CSF Mía Promoter Mubi-1 của ngô hoặc

Scubi-9 của mía

0,02% protein tan tổng số [156]

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và

tín hiệu peptide, nos terminator

0,005 - 0,03% protein tan tổng số [126]

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1 và tín hiệu

peptide, nos terminator

1,3% protein tan tổng số[127]

GM-CSF Lúa Promoter Gt3α, tín hiệu peptide

glutelin, nos terminator

µg/hạt[73],[105] Murine Thuốc lá Promoter RbcS1, tín hiệu 19 µg/g lá tươi;