Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vậtNghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 Công trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà PGS.TS Lê Văn Sơn Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3: ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Vào hồi phút, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiều luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Ngun CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Các báo Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Lê Văn Sơn (2014), “Nghiên cứu biểu protein Interleukin tái tổ hợp vi khuẩn cherichi coli Ro ett -g mi , Tạp chí ho học - Đại học uốc gi Hà Nội, 30(6S-A), tr 101-107 Nguyễn Huy Hồng, Nguyễn Thu Gi ng, Chu Hồng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin v i trò hệ thống miễn dịch người , Tạp chí ho học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 118(04), tr 153-156 Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin phục vụ chuyển gen hệ thống thực vật , Tạp chí ho học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 134(04), tr 25-28 Nguyễn Huy Hồng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017), “Biểu protein Interleukin tái tổ hợp dòng tế bào thuốc BY-2 , Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(01), tr 1-8 Nguyễn Huy Hồng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Lê Văn Sơn (2017), “Biểu tạm thời protein Interleukin tái tổ hợp thuốc (Nicotiana benthamiana domin) phương pháp Agro-Infiltr tion , Tạp chí Sinh học, 39(02), tr 232-238, doi: 10.15625/0866-7160/v39n2.9000 Trình tự gen đăng ký ngân hàng gen quốc tế Hoang, N H., Ha, C H., Ngoc, P B and Son, L V (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Interleukine nhóm cytokine tiết phân tử tín hiệu đƣợc tìm thấy tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng hệ thống miễn dịch Chức hệ thống miễn dịch ngƣời phụ thuộc chủ yếu vào interleukine, thiếu hụt interleukin dẫn đến bệnh tự miễn thiếu hụt miễn dịch Interleukine (hIL-7) cytokine có vai trò tăng trƣởng dòng tế bào B T Đây dòng tế bào có chức quan trọng hệ miễn dịch ngƣời, đích cơng virus, mầm bệnh xâm nhập vào thể ngƣời Trong y học ngày nay, protein có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị nhƣ loại hormone, enzyme tái tổ hợp Trƣớc đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất loại protein chủ yếu tách chiết từ phận động vật Tuy nhiên, nhu cầu ngày cao nguồn cung từ động vật hạn chế, giá thành lại đắt dễ nhiễm mầm bệnh nguy hiểm cho ngƣời, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp đƣợc đặt cách cấp thiết Trong thập niên gần đây, với bƣớc tiến lớn lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein khơng khó khăn nhƣ trƣớc nhờ phƣơng pháp tổng hợp sinh học Thực tế phƣơng pháp đƣợc áp dụng rộng rãi để tổng hợp số loại protein làm thuốc nhƣ insulin, hormone v.v… mà để tổng hợp nhiều hợp chất khác nguồn nguyên liệu hạn chế đƣờng tổng hợp hố học gặp khó khăn Hiện nay, biểu protein tái tổ hợp thực vật đƣợc quan tâm nghiên cứu ƣu điểm vƣợt trội so với hệ thống biểu khác nhƣ chúng sinh trƣởng mơi trƣờng tƣơng đối đơn giản, protein đƣợc tiết môi trƣờng nhiều phần tích luỹ tế bào nên việc thu hồi tinh dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an tồn cho ngƣời so với protein có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy khác mầm bệnh virus thực vật tác nhân gây bệnh ngƣời Nhằm mục đích nâng cao chất lƣợng điều trị bệnh theo hƣớng sử dụng liệu pháp sinh học góp phần hồn thiện phƣơng pháp nghiên cứu sản xuất cytokine nói chung hIL-7 nói riêng cách tối ƣu Căn vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép với phƣơng pháp khả thi, định lựa chọn thực đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu protein interleukine tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật” Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ƣu protein hIL-7 tái tổ hợp Thu nhận tinh đƣợc protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ thuốc chuyển gen Phân tích, kiểm tra đánh giá chất lƣợng hIL-7 tái tổ hợp thu đƣợc qua hệ thống nuôi cấy thực vật Ý nghĩa lý luận thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa lý luận Luận án cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng y học thực vật thông qua biến đổi mã di truyền hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung luận án đƣợc sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo cho giảng viên sinh viên trƣờng khối khoa học tự nhiên nói chung sinh học nói riêng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Luận án cung cấp quy trình biểu protein hIL-7 tái tổ hợp hệ thống ni cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, thuốc chuyển gen quy mơ phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích ni cấy thu sinh khối tế bào Bƣớc đầu đánh giá đƣợc hoạt tính sinh học protein hIL-7 tái tổ hợp thu đƣợc sau tinh hệ thống nuôi cấy, tiền đề cho nghiên cứu sâu Đóng góp luận án Luận án thiết kế thành công cấu trúc vector biểu protein hIL-7 tế bào thuốc BY2, rễ tơ thuốc chuyển gen Đã biểu thành cơng protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc chuyển gen Trong đó, protein biểu cao thuốc chuyển gen ngày tuổi với hàm lƣợng 36,7 ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao Đây cơng trình nghiên cứu Việt Nam giới biểu protein hIL-7 hệ thống nuôi cấy thực vật Cấu trúc luận án: Luận án có 157 trang kể tài liệu tham khảo đƣợc chia thành chƣơng, phần: Mở đầu (3 trang), Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (25 trang); Chƣơng 2: Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu (24 trang); Chƣơng 3: Kết nghiên cứu (48 trang); Chƣơng 4: Bàn luận kết nghiên cứu (8 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Các cơng trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Summary (3 trang); Tài liệu tham khảo (26 trang); Phụ lục (7 trang) Luận án có 10 bảng; 39 hình tham khảo 175 tài liệu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 175 tài liệu, có tài liệu tiếng Việt, 164 tài liệu tiếng Anh địa trang web vấn đề liên quan: (1) Vai trò cytokine interleukine hệ miễn dịch ngƣời; (2) Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học; (3) Nghiên cứu biểu hIL-7 tái tổ hợp hệ thống vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc Interleukine nhóm cytokine, đóng vai trò quan trọng hệ miễn dịch ngƣời Chúng có chức điều hoà miễn dịch, bao gồm phát triển tế bào, trƣởng thành, di chuyển bám dính Ngồi ra, chúng có khả kích hoạt phản ứng miễn dịch thể (Chad et al., 2010) Interleukine gồm chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lƣợng phân tử 17,4 kDa đƣợc ổn định gốc N - glycosyl hóa O - glycosyl hóa cầu nối disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016) Ở ngƣời, gen hIL-7 có kích thƣớc 33Kb, gồm có exon intron nằm nhiễm sắc thể số 8, vị trí 8q21.13 Hiện nay, việc nghiên cứu sử dụng loại cytokine tái tổ hợp mở hƣớng điều trị tích cực y học Hàng loạt cytokine khác đƣợc nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm điều trị lâm sàng nhƣ: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 EPO (Kwon et al., 2003) Các loại cytokine có vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu khơng đặc hiệu, hƣớng nghiên cứu tập trung vào tác dụng điều trị cytokine nhƣ tác nhân dƣợc lý đích tác động đƣợc quan tâm nghiên cứu Chính lý nên u cầu cấp bách đặt phải hoàn thiện quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung interleukine nói riêng, phục vụ y học Các hệ thống biểu protein thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ: hệ thống vi khuẩn, hệ thống biểu tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu rễ tơ hệ thống biểu tạm thời thực vật Trong đó, hệ thống biểu thực vật thể khả ƣu việt so với hệ thống khác do: khả tạo sinh khối, khả thu nhận protein tái tổ hợp, tốn cơng chăm sóc v.v… Đặc biệt mầm bệnh, virus thực vật đối tƣợng gây bệnh cho ngƣời, nên phù hợp để biểu loại protein tái tổ hợp ngƣời phục vụ y học Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 V T LI U Luận án sử dụng dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum L Cv Bright Yellow 2), thuốc N benthamiana N tabacum K326 phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Các chủng vi khuẩn E coli DH-5α, A tumefaciens, A rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt nam cung cấp Tế bào 2E8 Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp Các vector: pK7WG2D.1, pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.2 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất, KIT đƣợc sử dụng hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm nghiên cứu luận án đƣợc thực Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Luận án hồn thành Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phƣơng pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ƣu biểu protein thực vật Khai thác trình tự nucleotide trình tự mRNA Tiến hành thay codon gen hIL-7 codon phổ biến thực vật Thêm trình tự cmyc, histag, vị trí nhận biết enzyme giới hạn vào trình tự Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide trình tự acid amin trƣớc sau đổi mã 2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp Trong nội dung luận án, thiết kế vector chuyển gen: (1) pET32c(+)/IL7; (2) pENTR221/cal/IL7; (3) pK7WG2D.1/cal/IL7; (4) pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP; (5) pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 2.3.3 Phƣơng pháp biểu gen vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc BY-2, rễ tơ thuốc thuốc Phƣơng pháp chuyển gen vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2 rễ tơ thuốc thuốc đƣợc thực gián tiếp thông qua A tumefaciens A rhizogene theo phƣơng pháp Topping (1998) 2.2.4 Nhóm phƣơng pháp phân tích dòng chuyển gen 2.2.4.1 Phân tích tiêu sinh lý dòng chuyển gen Các tiêu sinh lý dòng tế bào chuyển gen BY2 rễ tơ chuyển gen đƣợc đánh giá thông qua số khối lƣợng tƣơi khối lƣợng khô đƣợc nuôi cấy môi trƣờng l ng Quá trình đánh giá đƣợc thực theo phƣơng pháp Phạm Bích Ngọc năm 2009 (Ngoc et al., 2009) 2.2.4.2 Phân tích dòng chuyển gen b ng thuật sinh h c phân t Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR, xác định protein tái tổ hợp lai miễn dịch Western blot Phân tích biểu protein điện di protein theo Laemmli (1970) Western blot Định lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp ELISA theo phƣơng pháp Sun cs (2006) Protein đƣợc tinh theo phƣơng pháp IMAC mITC đƣợc đánh giá hoạt tính sinh học dòng tế bào 2E8 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ƣu biểu thực vật Sử dụng trình tự gen hIL-7 đƣợc cơng bố Ngân hàng Gen có mã số: J04156.1 bảng tần suất codon phổ biến thực vật (Codon Usage Database) với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại b thay khoảng 10% codon gen hIL-7 codon phổ biến thực vật mà không làm thay đổi thành phần trật tự acid amin Sử dụng công cụ Graphical Codon Usage Analyzer kiểm tra mức độ phù hợp codon gen hIL-7 trƣớc sau cải biến mã di truyền Ngồi ra, chúng tơi tiến hành loại b trình tự ATTTA gen hIL-7 đƣợc cho gây bất ổn trình phiên mã mRNA (Hood et al, 2002), kết hợp sử dụng phần mềm Invitrogen để giảm thiểu hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp Kết thay đổi thành công mã di truyền gen hIL-7 với độ tƣơng đồng nucleotide so với trình tự gen gốc 63,6 %, độ tƣơng đồng acid amin 100% Ngồi ra, trình tự nhận biết enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII, trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc epitope his-tag đƣợc thêm vào đầu 5’ 3’ gen hIL-7 Trình tự nucleotide sau tối ƣu có kích thƣớc 536bp, 12 kiện khác nhau; (+) Đối chứng dương: 150 ng protein scFv; M Thang chuẩn protein (Fermentas) 3.3.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY2 Sử dụng dòng BY2 chuyển gen dòng khơng chuyển gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách protein tan tổng số, điện di gel 12,6% SDS polyacrylamide tiến hành phản ứng Western blot để đánh giá chất lƣợng protein thông qua protein c-myc, phát có mặt protein hIL-7 kháng thể kháng c-Myc Độ nhạy phản ứng Western blot đƣợc đánh giá đối chứng dƣơng protein tái tổ hợp scFV có gắn c-Myc Kết thể hình 3.24 cho thấy, băng protein đƣờng chạy rõ, sắc nét chứng t protein thu đƣợc sạch, bị đứt gãy Các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất băng khoảng 23 kDa Trong đó, dòng số 13, 39 không xuất băng protein hIL-7 kết kiểm tra PCR cho kết dƣơng tính; điều tƣợng gen chuyển khơng hoạt động (Sun et al., 2006) Hình 3.24 Kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào huyền phù BY2 Western blot M Thang protein chuẩn; (+) Đối chứng dương (protein scFv 150 ng); () Đối chứng âm (dòng tế bào BY2 hoang dại); - 5: dòng tế bào BY2 13 Hàm lƣợng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) chuyển gen; Phản ứng lai sử dụng kháng thể anti c- myc Từ kết cho thấy, thiết kế biểu thành công protein hIL-7 tái tổ hợp tế bào huyền phù BY2 Chúng sử dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ biểu protein hIL-7 dòng BY2 chuyển gen dƣơng tính kiểm tra Western blot Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn đuôi c-myc đƣợc tính tốn dựa phƣơng trình đƣờng chuẩn protein scFv gắn c-myc Kết thể hình 3.25 Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp tích luỹ tế bào huyền phù chuyển gene BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số Tuy nhiên, mức độ tích luỹ protein hIL-7 tái tổ hợp thấp so với protein tổng số 3,5 2,5 1,5 0,5 3,25 2,25 Dòng Dòng Dòng 32 Dòng BY2 chuyển gen Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp dòng BY2 chuyển gen 14 Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy tế bào huyền phù chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số 3.3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen Chúng tơi sử dụng A.rhizogenes ATCC15834 để chuyển vector pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mảnh thuốc để cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen Sau qua trình chọn lọc, kiểm tra mơi trƣờng chứa kháng sinh kỹ thuật PCR, chọn đƣợc dòng rễ tơ sinh trƣởng, phát triển tốt mang gen chuyển để đánh giá biểu protein hIL-7 tái tổ hợp Sử dụng kỹ thuật Western blot để phân tích biểu protein hIL-7 dòng rễ tơ chuyển gen Kết thể hình 3.30 Kết kiểm tra cho thấy, dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa protein hIL-7 xuất băng kích thƣớc khoảng 23 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc protein hIL-7 gắn thêm c-myc histag theo tính tốn lý thuyết Trong đƣờng chạy đối chứng âm dòng rễ tơ khơng chuyển gen khơng xuất băng protein Điều cho thấy gen mã hóa protein hIL-7 đƣợc chuyển biểu thành công rễ tơ thuốc 15 Hình 3.30 Kết biểu protein hIL-7 dòng rễ tơ Western blot M Thang protein chuẩn; - 5: dòng rễ tơ chuyển gen; (+) Đối chứng dương (protein scFv 150 ng), (-) Đối chứng âm: dòng rễ tơ khơng chuyển gen Phản ứng lai sử dụng kháng thể kháng c-myc Hàm lƣợng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) 30 25 23,3 22 20 19,93 20 17,84 15 10 Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng rễ tơ chuyển gen Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 dòng rễ tơ chuyển gen Chúng sử dụng phƣơng pháp ELISA để xác định hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen Kết thể hình 3.31 cho thấy, hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận từ dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg 16 protein tan tổng số Trong đó, biểu protein hIL-7 tái tổ hợp cao dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số, thấp dòng 5, đạt 17,84 ng/µg protein tan tổng số Đặc biệt, hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp biểu dòng dòng khơng có khác biệt đáng kể 3.3.4 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc phương pháp Agro-infiltration Chúng sử dụng chủng A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP để biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc phƣơng pháp Agro-infiltration Sau ngày biến nạp, tiến hành thu bảo quản 80oC Để kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp, tiến hành tách chiết protein tổng số đo nồng độ theo phƣơng pháp Bradford (1976), sau sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot vị trí biểu tạm thời non, bánh tẻ già Hình 3.35 Kiểm tra biểu protein hIL-7 thuốc Western blot M Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); Lá non, Lá bánh tẻ, Lá già; (-) Đối chứng âm (lá thuốc không chuyển gen) Kết thể hình 3.35 cho thấy đƣờng chạy 1, 2, xuất băng có kích thƣớc khoảng 64 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc protein hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag ELP; 17 đƣờng chạy đối chứng âm, thuốc không chuyển gen khơng xuất băng 3.3.4.4 Phân tích định lượng tinh protein hIl-7 tái tổ hợp Sau biểu thành công protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc lá, tiến hành tinh protein phƣơng pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh định lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp Đây phƣơng pháp hiệu để tinh protein tái tổ hợp liên kết với his-tag Phƣơng pháp dựa nguyên lý histidine tạo phức hợp với kim loại hoá trị II (niken) nồng độ pH trung tính Sự tƣơng tác protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH Protein đích sau liên kết với cột tinh sạch, đƣợc hoà tan thu lại cách giảm pH dung dịch tăng nồng độ đệm ion nồng độ đệm EDTA imidazole Sau tinh sạch, kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp điện di SDS-PAGE phƣơng pháp lai miễn dịch Western blot Kết thể hình 3.34 cho thấy, chúng tơi thu đƣợc băng protein có kích thƣớc khoảng 64 kDa, theo tính tốn lý thuyết 64 Hình 3.36 Kết tinh định lượng protein hIL-7 phương pháp IMAC (A) Điện di SDS-PAGE: 1A Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3A Protein hIL-7 sau tinh 18 (B) Kết Western blot: 1B Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3B Protein hIL-7 sau tinh (C) Định lượng protein hIL-7 western blot sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C protein hIL-7 sau tinh (30 µg protein tổng số/giếng) Sau tinh theo phƣơng pháp IMAC, nồng độ protein tổng số đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp Bradford protein hIL-7 đƣợc định lƣợng phần mềm ImageJ màng lai Kết thu đƣợc 27,86 ng/µg protein tan tổng số So sánh với số nghiên cứu biểu protein tạm thời khác biểu protein hIL-7 thuốc N Benthamiana tƣơng đối cao Kết cho thấy hiệu phƣơng pháp biểu tạm thời tinh protein hIL-7 từ thuốc N benthamiana thời gian ngắn, dễ thực Để thu đƣợc protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lƣợng cao hơn, tiếp tục định lƣợng tinh phƣơng pháp mITC dựa đặc tính gắn kết ELP với protein đích hIL-7 Chúng tơi sử dụng 100 gam thuốc đƣợc biến nạp phƣơng pháp agroinfiltration để tinh thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp theo phƣơng pháp mITC Kết hình 3.37 cho thấy, đƣờng chạy xuất băng có kích thƣớc khoảng 64 kDa 130 kDa (trạng thái dimer) protein có gắn ELP; đƣờng chạy dịch chiết protein kh i màng lọc sau đƣa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất băng protein nào, điều chứng t protein IL7 có gắn ELP đƣợc giữ lại màng lai không bị rửa trôi protein khác Ở đƣờng chạy số dịch chiết sau rửa màng nƣớc 19 milipore-Q lạnh nồng độ ion thấp có băng protein có kích thƣớc khoảng 64 kDa tƣơng ứng với kích thƣớc protein hIL-7 tái tổ hợp theo tính tốn Hình 3.37 Kết tinh protein hIL-7 phương pháp mITC M Thang protein chuẩn; Protein hIL-7 tinh sau rửa màng nước lạnh; Dịch chiết khỏi màng sau đưa dịch thô qua màng; Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 phương pháp mITC Dịch chiết Protein Protein Hiệu suất Độ tinh protein tổng số (mg) tái tổ hợp (mg) thu hồi (%) (%) Dịch thô 1634,7 38,3 100 X trƣớc tinh Dịch hIL-7 45,8 36,7 95,82 86,3 tinh Từ kết xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein hIL-7 phƣơng pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh đạt 86,3% Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp protein hòa tan tổng số 20 2,34%, kết tƣơng đƣơng với nghiên cứu trƣớc hàm lƣợng protein tái tổ hợp protein hòa tan tổng số: 2% (Lamphear et al., 2004), (Streatfield et al., 2002); 2,2% (C.H.Ha et al, 2015); 3% (Gil, 2001) Hình 3.38 Kết định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp Western blot Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước tinh (30 µg/giếng); Protein hIL-7 tách khỏi màng rửa màng nước milipore-Q lạnh; 3, 4, 5, Đối chứng dương với nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng Phƣơng pháp gắn kết ELP vào protein đích t có nhiều ƣu điểm nhƣ dễ dàng thu nhận tinh protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt ELP, đồng thời hàm lƣợng protein tái tổ hợp thu đƣợc thƣờng cao Shoj cộng (2009) thu nhận đƣợc 200 mg HA/kg tƣơi, Mortimer cộng (2012) thu nhận đƣợc 675 mg HA/kg tƣơi sản xuất kháng nguyên virus cúm gia cầm H5N1 phƣơng pháp Trong nghiên cứu biểu protein hIL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, thu nhận đƣợc 36,7 ng/µg protein tan tổng số Kết cho thấy biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc N benthamiana cao, sở để 21 tiến hành sản xuất lƣợng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng y học 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh h c protein hIL-7 tái tổ hợp Để đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 sử dụng mẫu protein hIL7 biểu tạm thời thuốc phƣơng pháp agro-infiltration nồng độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; µg/ml; 1,5 µg/ml; µg/ml; 2,5 µg/ml khả hoạt hoá tế bào 2E8 Kết thí nghiệm đƣợc trình bày bảng 3.10 hình 3.39 Bảng 3.10 Kết hoạt hố dòng tế bào 2E8 protein interleukin Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8 Nồng độ protein hIL-7 (%) 0,125 µg/ml 35,7 0,25 µg/ml 45,3 0,5 µg/ml 53,3 µg/ml 63,8 1,5 µg/ml 73,6 µg/ml 82,5 2,5 µg/ml 79,3 Giá trị ED50 (g/ml) 0,35 100 80 60 40 Protein IL-7 thực vật 20 0.125 0.25 0.5 1.5 2.5 Hình 3.39 Khả hoạt hóa dòng tế bào 2E8 protein IL-7 22 Qua bảng 3.10 hình 3.39 cho thấy, protein hIL-7 tái tổ hợp đƣợc biểu tạm thời thuốc thể hoạt tính sinh học việc hỗ trợ sinh trƣởng hoạt hố dòng tế bào 2E8, với khả hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 khơng bổ sung hIL-7 vào môi trƣờng nuôi cấy) Ở nồng độ chất thử hIL-7 tăng dần, % hoạt hóa tế bào mẫu tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học mẫu thử ổn định; đó, khả hoạt hóa cao nồng độ µg/ml 82,5% Sau khả hoạt hóa mẫu khơng tăng mà lại giảm đi, điều đƣợc giải thích protein hIL-7 liều lƣợng cao gây ức chế cho sinh sản hoạt hóa tế bào, chí gây chết cho tế bào Qua kết trên, bƣớc đầu khẳng định protein hIL-7 tái tổ hợp có khả thể hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở khả sản xuất lƣợng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ y học nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho ngƣời Chƣơng BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Biểu protein interleukin E.coli rosetta-gami B Trong nội dung nghiên cứu luận án, sử dụng vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp để biểu protein hIL-7 vi khuẩn E.coli Rosetta-gami B dƣới điều khiển promoter T7lac nhờ hoạt tính T7 RNA polymerase tế bào chủ đƣợc biến đổi phage T7 Chủng rosetta-gami B mang plasmid pRARE mã hoá cho tRNAs chủng K-12 đột biến trxB/gor có khả tăng cƣờng hình thành cầu nối disulfide tế bào chất kết hợp với vector biểu pET32c có chứa đoạn DNA mã hoá cho oligo-histidine (His-tag) hỗ trợ việc phát tinh chế protein hIL-7 nhằm thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp có cấu trúc giống tự nhiên để kiểm tra hoạt động gen hIL-7 tái tổ hợp trƣớc chuyển vào hệ thống nuôi cấy thực vật 23 Khi đƣợc biểu hiện, protein hIL-7 dung hợp với protein Thiodedoxin (Trx.Tag) pET32c(+) để tăng cƣờng khả cuộn, gấp biểu dạng tan giúp cho việc thu nhận tinh protein hIL-7 dễ dàng Khi có nhiều protein đƣợc tạo hình thành thể vùi vi khuẩn Đây tinh thể đậm đặc protein cuộn gấp sai hoạt động chức Vì lý đó, nên chúng tơi sử dụng hệ thống biểu pET, hai hệ thống biểu thƣờng đƣợc sử dụng E coli để kiểm sốt q trình biểu protein Các dòng vector pET có promoter T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site) trình tự kết thúc T7 Việc phiên mã từ promoter T7/lac đòi h i phải có T7 RNA polymerase Tế bào chủ E coli có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, nhƣng bị protein lac operon, lacI ức chế kìm hãm biểu gen Khi IPTG đƣợc bổ sung trình biểu protein tái tổ hợp, cảm ứng giải phóng lacI kh i operator lac operon trình phiên mã đƣợc bắt đầu T7 RNA polymerase đƣợc tạo bám vào promoter T7/lac protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất Trong nghiên cứu luận án, xác định đƣợc hàm lƣợng IPTG tối ƣu 0,4mM điều kiện nhiệt độ 37oC cho khả sản xuất protein hIL-7 tái tổ hợp tốt Trong nghiên cứu luận án, tiến hành thiết kế vector biểu bao gồm trình tự mã hóa protein hIL-7 trình tự mã hóa cho thiodedoxin tạo protein dung hợp có kích thƣớc khoảng 37kDa gần 80 kDa (trạng thái dimer), giúp tăng cƣờng khả cuộn gấp tạo cấu trúc không gian protein hIL-7 tăng khả tiết môi trƣờng ngoại bào, giúp cho việc thu nhận protein đơn giản Tuy nhiên, biểu loại protein sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt protein ngƣời có hạn chế định, đặc biệt E coli thƣờng lẫn với lipopolysaccharide, loại nội độc tố ngƣời Vì vậy, nhiều hệ thống khác đƣợc nghiên cứu để thay hệ thống biểu 24 vi khuẩn, có hệ thống biểu protein tái tổ hợp thực vật 4.2 Biểu protein interleukin dòng tế bào BY-2, rễ tơ Sử dụng tế bào huyền phù thực vật nhƣ mơ hình sản xuất protein tái tổ hợp quy mơ phòng thí nghiệm ngày trở nên phổ biến Đặc biệt, protein sản xuất từ dòng tế bào BY-2 có chứa Nliked glycan có cấu trúc tƣơng tự tế bào động vật, điều làm tiền đề cho việc thu nhận protein tái tổ hợp có cấu trúc hoạt tính sinh học giống tự nhiên Trong nghiên cứu chúng tôi, hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp đƣợc biểu dòng tế bào BY-2 đạt 2,25 - 3,25 ng/g protein tan tổng số, tƣơng đƣơng 0,225 - 0,335% protein tan tổng số Hàm lƣợng biểu thấp so với số nghiên cứu biểu protein khác hệ thống BY-2 nhƣ: P.B Ngọc (2009) biểu protein thaumatin I tế bào BY2 cho thấy protein thaumatin I tái tổ hợp tiết khoảng 1,024 g/ml môi trƣờng nuôi cấy; La Việt Hồng (2015), hàm lƣợng protein miraculin tái tổ hợp biểu hệ thống huyền phù BY-2 dao động từ 1,13 - 3,10 ng/g protein tan tổng số, Đào Thị Sen (2016), hàm lƣợng protein GP5 tái tổ hợp thu nhận đƣợc qua hệ thống BY2 đạt 3,4% protein tổng số 4.3 Biểu tạm thời protein interleukin thuốc Phƣơng pháp có lợi mức độ biểu protein tái tổ hợp cao nhiều so với phƣơng pháp khác, nhƣ thời gian sản xuất protein nhanh hơn, không bị ảnh hƣởng vị trí gắn gen tế bào thực vật, đặc biệt khơng gặp phải vấn đề an tồn sinh thái nhƣ phƣơng pháp tạo chuyển gen Trong nghiên cứu luận án, để tránh gặp phải tƣợng RNAi làm giảm hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp, biểu đồng thời protein đích interleukin protein hỗ trợ Hc- 25 Pro virus khoai tây Y nhằm chống lại tƣợng câm gen thực vật cách ngăn cản phân giải mRNA RNA sợi đơi, từ giảm lƣợng siRNA phá h ng chức cắt enzyme cắt sợi đôi Dicer RISC [176] Kết quả, thu đƣợc protein hIL-7 tái tổ hợp biểu thuốc với hàm lƣợng cao KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Mã di truyền gen hIL-7 đƣợc thay đổi phù hợp với hệ thống biểu thực vật với độ tƣơng đồng nucleotide so với trình tự gen hIL-7 gốc 63,6 % độ tƣơng đồng acid amin 100% Đã thiết kế thành công cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/cal/IL7; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP; pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc thuốc để biểu protein hIL-7 tái tổ hợp Hàm lƣợng protein hIL-7 tái tổ hợp cao đạt 36,7 ng/µg protein tan tổng số hệ thống biểu tạm thời; thấp đạt 2,25 ng/µg protein tan tổng số hệ thống ni cấy tế bào BY2 Hoạt tính sinh học protein hIL-7 thu nhận qua hệ thống biểu tạm thời đạt 82,5% nồng độ µg/ml Đề nghị Tiếp tục thử nghiệm protein hIL-7 tái tổ hợp tinh mức độ động vật thí nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá sâu hoạt tính sinh học protein hIL-7 trƣớc sản xuất quy mô lớn Nghiên cứu tối ƣu hệ thống biểu dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc nhằm tận dụng ƣu điểm hệ thống để nâng cao hiệu suất sản xuất protein hIL-7 Đồng thời nghiên cứu biểu 26 số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein hIL-7 tái tổ hợp ... Nghiên cứu biểu protein interleukine tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ƣu protein hIL -7 tái tổ hợp Thu nhận tinh đƣợc protein. .. hIL -7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL -7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL -7 tái tổ hợp phù hợp. .. với hệ thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ thuốc chuyển gen Phân tích, kiểm tra đánh giá chất lƣợng hIL -7 tái tổ hợp thu đƣợc qua hệ