Nghiên cứu biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Chu Hoàng Hà PGS TS Lê Văn Sơn THÁI NGUYÊN - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS TS Chu Hoàng Hà PGS TS Lê Văn Sơn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố Tạp chí Khoa học; phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn, tham khảo ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2018 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Hà, PGS TS Lê Văn Sơn, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành tới TS Phạm Bích Ngọc, TS La Việt Hồng, ThS Lê Thu Ngọc, ThS Nguyễn Thu Giang toàn thể chú, anh chị bạn Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, người tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp đỡ tơi q trình làm thực nghiệm phịng Tơi xin chân thành cảm ơn GS TS Chu Hoàng Mậu, PGS TS Nguyễn Thị Tâm thầy cô giáo khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học Tơi xin cảm ơn phịng Đào tạo, cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi mặt quản lý suốt q trình tơi học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học phòng chức tạo điều kiện thuận lợi cho công tác để yên tâm học tập Cuối tơi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu sắc Những người luôn bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2018 TÁC GIẢ Nguyễn Huy Hoàng iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa lý luận thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa lý luận 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò cytokine interleukin hệ miễn dịch người 1.1.1 Cytokine 1.1.2 Interleukin 10 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học16 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng giới 16 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nước 18 1.3 Một số hệ thống biểu protein người tái tổ hợp 19 1.3.1 Hệ thống biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn 19 1.3.2 Dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) 20 1.3.3 Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật 22 1.3.4 Cây chuyển gen biểu cytokine tái tổ hợp 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Vật liệu thực vật 29 2.1.2 Các chủng vi khuẩn, tế bào 29 2.1.3 Các gen vector 30 2.1.4 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 2.1.5 Hóa chất thiết bị máy móc 31 2.1.6 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu protein thực vật 34 2.2.2 Thiết kế mồi 35 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp 35 2.2.4 Phương pháp biểu gen vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc BY2, rễ tơ thuốc 44 2.2.5 Phân tích tiêu sinh lý dịng chuyển gen 47 2.2.6 Phân tích dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 48 2.2.7 Tinh protein hIL-7 tái tổ hợp 50 2.2.8 Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp 50 2.2.9 Phân tích thống kê kết thực nghiệm 52 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu thực vật 53 3.2 Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc thuốc 57 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 57 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 59 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 61 3.2.4 Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 63 3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp 68 3.3.1 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp vi khuẩn 68 3.3.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY2 72 3.3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen 83 3.3.4 Biểu protein hIL-7 thuốc bằng Agro-infiltration 91 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 tái tổ hợp 99 Chương BÀN LUẬN 101 4.1 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp E coli rosetta-gami B 101 4.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY-2, rễ tơ 103 4.3 Biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc 106 4.4 Tăng cường biểu protein thực vật với ELP tinh mITC 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC 138 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự AIDS Tiếng Anh Tiếng Việt Acquired immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch syndrome mắc phải người A tumefaciens Agrobacteria tumefaciens A rhizogenes Agrobacteria rhizogenes AS Acetosyringone bp Base pairs Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết bò BY2 Bright yellow Cal Calreticulin cDNA Complementary DNA ADN bổ sung Cetyl trimethyl Chất hoạt động bề mặt ammonium ammonium bromide bromide DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate DTT Dithiothreitol E Coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic Enzyme-linked xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên immunosorbent assay kết với enzyme CTAB ELISA ELP Elastin-like peptide FDA Food & drug administration FGF8b Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào isoform b sợi isoform b hIL-7 Human interleukin Interleukin người HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E HPV Human papilloma virus Virus papilloma người HRP Horseradish peroxidase IFN Interferon IL Interleukin IMAC IPTG Immobilized metal ion affinity chromatography Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo danton LB Luria and Bertani MHC Major histocompatibility complex mITC mRNA Sắc kí ion cố định kim loại Membrane-based inverse transition cycling ARN messenger Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn theo Luria Bertani Phức hệ phù hợp tổ chức Đảo ngược theo màng ARN thông tin Môi trường dinh dưỡng MS Murashige and Skoog nuôi cấy mô thực vật theo Murashige Skoog NK cell Natural killer cell tế bào giết tự nhiên Neomycin phosphotransferase Gen kháng kháng sinh II gen kanamycine OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate nptII PBST Phosphate buffer saline + tween 20 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng western blot Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ thực vật RNAi RNA interference ARN can thiệp RNase Ribonuclease phân giải ARN Rpm Revolutions per minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis siRNA small interfering RNA TAE Tris acetate EDTA TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine UV Ultraviolet Tia tử ngoại vir Virulence region Vùng gây độc v/v Volume/volume thể tích/thể tích WPM Woody plant medium WT Wild type Chủng hoang dại w/v weight/volume khối lượng/thể tích YEB Yeast extract broth YMB Yeast malnitol broth Môi trường nuôi cấy theo Mccown 130 126.Sanchez-Hernandez C., Gutierrez-Ortega A., Aguilar-Leon D., Hernandez-Pando R., Gomez-Lim M., Gomez-Garcia B (2010), “In vivo activity of plant-based interleukin-12 in the lung of Balb/c mouse”, BMC Res Notes, 3:151, doi: 10.1186/1756-0500-3-151 127 Santos R B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T (2016), “Putting the Spotlight Back on Plant Suspension Cultures”, Front Plant Sci., 7:297, doi: 10.3389/fpls.2016.00297 128 Sardana R K., Alli Z., Dudani A., Tackaberry E., Panahi M., Narayanan M., Ganz P., Altosaar I (2002), “Biological activity of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor is maintained in a fusion with seed glutelin peptide”, Transgenic Research, 11(5), 521-531, doi: 10.1023/A:1020343501475 129 Sardana R., Dudani A K., Tackaberry E., Alli Z., Porter S., Rowlandson K., Ganz P., Altosaar I (2007), “Biologically active human GM-CSF produced in the seeds of transgenic rice plants”, Transgenic Res., 16(6), pp 713-721, doi:10.1007/s11248-006-9062-y 130 Savino A M., Izraeli S (2017), “Interleukin-7 signaling as a therapeutic target in acute lymphoblastic leukemia”, Expert Rev Hematol., 10(3), pp 183-185, doi: 10.1080/17474086.2017.1292121 131 Scheller J., Leps M., Conrad U (2006), “Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptides”, Plant Biotechnol J., 4(2), pp 243-249, doi: 10.1111/j.1467-7652.2005.00176.x 132.Schwertschlag U S., Trepicchio W L., Dykstra K H (1999), “Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin11”, Leukemia, 13(9), pp 1307-1315 131 133 Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R (2003), “Interleukin and T cell receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells”, Nature Immunol, 4(7), pp 680-686, doi: 10.1038/ni946 134 Sevon N., Oksman-Caldentey K M (2002), “Agrobacterium rhizogenesmediated transformation: root cultures as a source of alkaloids”, Planta Med, 68(10): p 859-868, doi: 10.1055/s-2002-34924 135 Sheppard P., Kindsvogel W., Xu W., Henderson K., Schlutsmeyer S., Whitmore T E., Kuestner R., Garrigues U., Birks C., Roraback J., Ostrander C., Dong D., Shin J., Presnell S., Fox B., Haldeman B., Cooper E., Taft D., Gilbert T., Grant F J., Tackett M., Krivan W., McKnight G., Clegg C., Foster D., Klucher K M (2003), “IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R”, Nat Immunol, 4(1), pp 63-68, doi: 10.1038/ni873 136 Shin Y J., Hong S Y., Kwon T H., Jang Y S., Yang M S (2003), “High level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture”, Biotechnol Bioeng, 82(7), pp.778-783, doi:10.1002/bit.10635 137 Shiroki F., Satoshi M., Tomomitsu D., Mari F., Yoshito M., Takashi K., Harumi S., Shigeo K (2007), “The p85α regulatory subunit of class IA phosphoinositide 3-kinase regulates beta-selection in thymocyte development”, Journal of Immunology, 178(3), pp 1349–1356, doi: 10.4049/jimmunol.178.3.1349 138 Silva M R., Hoffman R., Srour E F., Ascensao J L (1994), “Generation of human natural killer cells from immature progenitors does not require marrow stromal cells”, Blood, 84, pp 841-846 139 Sijmons P C., Dekker B M., Schrammeijer B., Verwoerd T C., van den Elzen P J., Hoekema A (1990), “Production of correctly processed 132 human serum albumin in transgenic plants”, Nature Biotechnology, 8, pp 217-222, doi:10.1038/nbt0390-217 140 Song H., Nakayama E E., Likanonsakul S., Wasi C., Iwamoto A., Shioda T., (2007), “A three-base-deletion polymorphism in the upstream noncoding region of human interleukin (IL-7) gene could enhance levels of IL-7 expression”, Int J Immunogenet, 34(2), pp 107-113 141 Streatfield S I., Mayor M., Barker D K., Brooks C., Lamphcar B., Woodard S L., Beifuss K K., Vicuna D V., Massey L A., Horn M E., Delaney D E., Nikolov Z L., Hood E E., Jilka J M., Howard J A (2002), “Development of edible subunit vaccine in corn against enterotoxigenic strains of Escherichia coli”, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 38(1), pp 11-17, doi:10.1079/IVP2001247 142 Stephanie D F., Thomas W (2016), “Effects of interferons and viruses on Metabolism”, Frontiers in Immunology, 7:630, doi: 10.3389/fimmu.2016.00630 143 Sun H J., Cui M., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett, 580(2), pp 620-626, doi: 10.1016/j.febslet.2005.12.080, pubmed ID: 16406368 144 Sun Q., Ding L., Lomonossoff G., Sun Y., Luo M., Li C., Jiang L., Xu Z (2011), “Improved expression and purification of recombinant human serum albumin from transgenic tobacco suspension culture”, J Biotechnol, 155(2), pp.164-172, doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.06.033 145 Matsuyama R., Goto K., Kadokura T., Sato M., Mori R., Kumamoto T., Taguri M., Miyasho T., Endo I (2017), “IL-7 and procalcitonin are useful biomarkers in the comprehensive evaluation of the severity of acute cholangitis”, J Hepatobiliary Pancreat Sci, 24(2), pp 81-88, doi:10.1002/jhbp.420 PMID: 28002647 133 146 Suzuki K., Nakajima H., Watanabe N., Kagami S., Suto A., Saito Y., Saito T., Iwamoto I (2000), “Role of common cytokine receptor-γ chain- and Jak3-dependent signaling in the proliferation and survival of murine mast cells”, Blood, 96(6), pp 2172–2180 147 Sweeney E B., Foss F M., Murphy J R., Spek J C (1998), “Interleukin (IL-7) receptor-specific cell killing by DAB389 IL-7: a novel agent for the elimination of IL-7 receptor positive cells”, Bioconjug chem.,9(2), pp 201 - 207, doi: 10.1021/bc9701757 148 Tekoah Y., Shulman A., Kizhner T., Ruderfer I., Fux L., Nataf Y., Bartfeld D., Ariel T., Gingis-Velitski S., Hanania U., Shaaltiel Y (2015), “Large-scale production of pharmaceutical proteins in plant cell culturethe protalix experience”, Plant Biotechnology J., 13(8), 1199 - 1208, doi: 10.1111/pbi.12428 149 Tekoah Y., Shaaltiel Y (2016), “Plant specific N-glycan not have proven adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp 706708, doi:10.1038/nbt.3556 150.Terpe K (2006), “Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnology, 72(2), pp 211-22 151 Tery J F., Crystal L M (2002), “Interleukin-7: from bench to clinic”, Blood, 99(11), pp 3892-3904 152 Ting‑ Ting C., Jaw‑ Wen C (2016), “Emerging role of chemokine CC motif ligand related mechanisms in diabetes mellitus and cardiovascular disease: friends or foes?”, Cardiovasc Diabetol, 15(1), pp.117, doi: 10.1186/s12933-016-0439-9 134 153 Tomasz K., Marta L., Janusz S., Tomasz S (2016), “Hairy roots culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med Dosw (online), 70, pp.1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186 154 Toussirot E., Aubin F (2016), “Paradoxical reactions under TNF-α blocking agents and other biological agents given for chronic immunemediated diseases: an analytical and comprehensive overview”, RMD Open, 2(2), doi:10.1136/rmdopen-2015-000239 155 Vandana K., Laura A P., Yevgeniy Y., Florian M B., Surojit S (2015), “Quiescence of Memory CD8(+) T Cells Is Mediated by Regulatory T Cells through Inhibitory Receptor CTLA-4”, Immunity, 42(6), pp 1116-1129 156 Van den Bergh J M., Lion E., Van Tendeloo V F., Smits E L (2017), “IL-15 receptor alpha as the magic wand to boost the success of IL-15 antitumor therapies: The upswing of IL-15 transpresentation”, Pharmacology & Therapeutics, 170, pp 73-79, doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.10.012 157 Vaquero C., Sack M., Chandler J., Drossard J., Schuster F., Monecke M., Schillberg S., Fischer R (1999), “Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves”, Proc Natl Acad Sci U S A, 96(20), pp 11128-11133 158 Veerapandian B., Gilliland G L., Raag R., Svensson A L., Masui Y., Hirai Y., Poulos T L (1992), “Functional implications of interleukin-1 beta based on the three-dimensional structure”, Proteins, 12(1), pp 10-23, doi: 10.1002/prot.340120103 159 Wang D J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A M., Ma S (2008), “A novel platform for biologically active recombinant human interleukin13 production”, Plant Biotechnology J., 6(5), pp 504–515, doi: 10.1111/j.1467-7652.2008.00337 135 160 Wang M L., Goldstein C., Su W., Moore P H., Albert H H (2005), “Production of biologically active GM-CSF in sugarcane: A secure biofactory”, Transgenic Res., 14(2), pp 167-178 161 Wang X B., Wu Q., Ito T., Cillo F., Li W X., Chen X., Yu J L., Ding S W (2010), “RNAi-mediated viral immunity requires amplification of virus-derived siRNAs in Arabidopsis thaliana”, Proc Natl Acad Sci U S A, 107(1), pp 484-9, doi: 10.1073/pnas.0904086107 162 Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H., Aiso S., Hibi T., Ishii H (1995), “Interleukin is produced by human intestinal epithelial-cells and regulates the proliferation of intestinal mucosal lymphocytes”, J Clin Investigation, 95(6), pp 2945-2953, doi: 10.1172/JCI118002 163 Wiles M V., Ruiz P., Imhof B A (1992), “Interleukin-7 expression during mouse thymus development”, Eur J Immunology, 22(4), pp 1037-1042, doi: 10.1002/eji.1830220424 164 Williams P., Galipeau J (2011), “GMCSF-Interleukin fusion cytokines induce novel immune effectors that can serve as biopharmaceuticals for treatment of autoimmunity and cancer”, J Intern Medicine, 269(1), pp 74–84, doi: 10.1111/j.1365-2796.2010.02314.x 165 Wongsamuth R., Doran P M (1997), “Hairy roots as an expression system for production of antibodies”, In: Doran PM, ed: Hairy Roots: Culture and Applications, Amsterdam: Harwood Academic, pp 89-97 166 World Health Organization (2016), Vietnam has among world’s highest cancer fatality rates, https://www.vietnambreakingnews.com/2016/10/vietnam-has-amongworlds-highest-cancer-fatality-rates/, ngày 01/01/2017 136 167 Yano A., Maeda F., Takekoshi M (2004), “Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis B virus surface antigen”, J Med Virol, 73(2), pp.208-215, doi: 10.1002/jmv.20077 168 Yoko S., Hong B., Konstantin M., Amy R., April H., Gourgopal R., Brian G., Moneim S., Christine E F., Barbara T., Nutan M., Natalia U (2009), “Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine, 27(7), pp 1087-1092, doi:10.1016/j.vaccine.2008.11.108 169 Yoseph S., Yoram T (2016), “Plant specific N-glycan not have proven adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp 706-708, doi:10.1038/nbt.3556 170 Zdanov A., Schalk-Hihi C., Gustchina A., Tsang M., Weatherbee J., Wlodawer A (1995), “Crystal structure of interleukin-10 reveals the functional dimer with an unexpected topological similarity to interferon gamma”, Structure, 3(6), pp 591-601, doi: 10.1016/S0969- 2126(01)00193-9 171 Zhang B., Yang Y H., Lin Y M., Rao Q., Zheng G G., Wu K F (2003), “Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants”, Biotechnology Letter, 25(19), pp 1629-1635 172 Zhang X., Du P., Lu L., Xiao Q., Wang Q., Cao X., Ren B., Wei C., Li Y (2008), Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the accumulation of siRNAs, Virology, 374(2), pp 351-360, doi: 10.1016/j.virol.2007.12.045 173 Zhong H., Gu X., Dai Y., Wang Z., Fu D., Guo X., Wu H., Wang D., Lu Z (2016), “Interleukin-7 in Patients With Chronic Hepatitis B May Have 137 Effect on T Follicular Helper Cells and Specific Cellular Immunity”, Hepat Mon, 16(9): e36068, doi:10.5812/hepatmon.36068 174 Zhou F., Wang M L., Albert H H., Moore P H., Zhu Y J (2006), “Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana benthamiana using potato virus X vector”, Appl Microbiology Biotechnology, 72(4), pp 756-762, doi: 10.1007/s00253-005-0305-2 175 Ziegler S F., Liu Y J (2006), “Thymic stromal lymphopoietin in normal and pathogenic T-cell development and function”, Nature Immunology, 7(7), pp 709-714, doi: 10.1038/ni1360 138 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần loại môi trường Môi trường YMB đặc YMB lỏng LB đặc LB lỏng Thành phần 0.4 g/l Yeast extract + 0.5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0.1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 0.4 g/l Yeast extract + 0.5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0.1 g/l NaCl, pH = g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM đặc WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường + g thạch, pH = 5.8 WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) WPM lỏng + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường, pH = 5.8 MS đặc MS lỏng ½ MS YP 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + g thạch, pH = 5.8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5.8 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5.8 50 mM Tris-HCl 1M + 300 mM NaCl 5M + 20 mM EDTA 0.5M + 4% CTAB, pH = 8.0 139 Phụ lục Thành phần số dung dịch đệm Dung dịch đệm Đệm xử lý mẫu (Treatment buffer 6X) Đệm chạy điện di protein (running buffer protein) Thành phần Tris HCl 1M 3,75 ml Glycerol 100% ml SDS 1,2 g 2-mercaptoethanol 0,9 ml Bromophenol blue 1,2 mg pH 6,8 Tris HCl 25 mM Glycine 250mM SDS 0,1% lít running buffer 1X: 3g Tris, 18,8 g glycine, 1g SDS Đệm Staining buffer Đệm Destaining buffer Đệm chiết DNA tổng số CBBR - 250 0,25% Methanol 30% Acid axetic 10% Methanol 30% Acid axetic 10% Tris-HCl 1M 50 mM NaCl 5M 300 mM EDTA 0.5M 20 mM CTAB 4% pH 8.0 140 Phụ lục Các vector sử dụng luận án P3.1 Sơ đồ cấu trúc vector pENTRTM221 P3.2 Sơ đồ cấu trúc vector pK7WG2D.1 141 P3.3 Sơ đồ cấu trúc vector pET32c(+) 142 P3.4 Sơ đồ cấu trúc vector pBSK/IL7 P3.5 Sơ đồ cấu trúc vector pCB301 35S/IL7-histag-cMyc-100xELP 143 Phụ lục Phương trình đường chuẩn protein 0.9 0.8 y = 0.0072x + 0.0432 0.7 R² = 0.9835 OD595 nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 C (g/ml) Nồng độ chất chuẩn BSA: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/ml P4.1 Phương trình đường chuẩn theo Bradford (chất chuẩn BSA) 0.9 y = 0.0399x + 0.0769 0.8 R² = 0.9798 OD630 nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 15 Nồng độ chất chuẩn: 0; 1.25; 2; 2.5; 5; 10; 15; 20 ng/l 20 25 C (ng/l) P4.2 Phương trình đường chuẩn protein scFv gắn đuôi c-Myc 144 Phụ lục 5: Bảng phiên mã amino acid Bazo thứ T C A G Bazo thứ Bazo thứ T C A G Phe Ser Tyr Cys T Phe Ser Tyr Cys C Phe Ser Tyr Cys A Phe Ser Tyr Cys G Leu Pro His Arg T Leu Pro His Arg C Leu Pro His Arg A Leu Pro His Arg G Ile Thr Asn Ser T Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly T Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G ... ? ?Nghiên cứu biểu protein interleukin tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ưu protein hIL -7 tái tổ hợp Thu nhận tinh protein hIL -7 tái. .. tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL -7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc gen mã hóa hIL -7 tái tổ hợp phù hợp với hệ thống. .. thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ thuốc chuyển gen Phân tích, kiểm tra đánh giá chất lượng hIL -7 tái tổ hợp thu qua hệ thống nuôi cấy