Nghiên cứu biểu hiện gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú her2 trong tảo chlamydomonas reinhardtii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ VÚ HER2 TRONG TẢO CHLAMYDOMONAS REINHARDTII Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS Lấ QUANG HUN H Ni 2010 Trần Thị Hun Trang LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu mà thân tơi trực tiếp thực Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Trần Thị Huyền Trang CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang LI CM N Trc tiờn, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn- Trưởng phịng cơng nghệ Tế bào Động vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình làm khố luận Trong q trình thực tập thực đề tài phịng thí nghiệm, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình KS Đặng Thị Minh Lụa tồn thể cán nhân viên phịng Công nghệ Tế bào Động vật, muốn gửi lời cảm ơn chân thành giúp đỡ q báu Để hồn thành khố luận khơng thể khơng nói tới cơng lao thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, Viện Đào tạo Sau đại học - Đại học Bách Khoa - Hà Nội giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan công tác Chi cục Bảo vệ Bảo vệ thực vật – Hà Nội bên cạnh động viên, chia sẻ khó khăn giúp tơi hồn thành khoá học thực tốt khoá luận Một lần cho xin cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010 Học viên Trần thị Huyền Trang CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang MC LC Trang M U Chương TỔNG QUAN……………………………………………………… 1.1 Tổng quan bệnh ung thư vú……………………………………………… 1.1.1 Khái niệm ung thư vú (UTV) 3  1.1.2 Phân loại 3  1.1.3 Nguyên nhân gây UTV 6  1.1.4 Các phương pháp điều trị ung thư vú………………………………………… 1.2 Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú……………………………….  1.2.1 Cấu trúc gen HER2   1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên HER2………………………………………………   1.2.3 Cơ chế hoạt động thụ thể HER2………………………………………   11 1.3 Ung thư vú dương tính HER2 11 1.4 Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2…………………………… 13 1.4.1 Khái niệm 13 1.4.2 Kháng thể đơn dòng ứng dụng điều trị ung thư vú 16 1.5 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng……………………………… 18 1.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma………………………………… 18 1.5.2 Phương pháp tái tổ hợp…………………………………………………… 19 1.6 Các hệ thống biểu gen truyền thống……………………………………… 20 1.6.1 Hệ thống biểu tế bào vi khuẩn………………………………………… 20 1.6.2 Hệ thống biểu tế bào nấm men………………………………………… 21 1.6.3 Hệ thống biểu tế bào động vật có vú………………………………… 21 1.6.4 Hệ thống biểu tế bào thực vật…………………………………………… 21 1.6.5 Hệ thống biểu vi tảo………………………………………………… 22 1.7 Hệ biểu tảo Chlamydomonas reinhardtii……………………………… 23 1.7.1 Đặc điểm sinh học………………………………………………………… 23 1.7.2 Ứng dụng tảo Chlamydomonas reinhardtii công ngh gen 25 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang 1.8.Phng pháp chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardti thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………………………………………………… 27 1.8.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens……………………………………… 28 1.8.2 Cơ chế chuyển gen Agrobacterium tumefaciens………………………… 29 1.8.3 Hệ thống vector dùng chuyển gen……………………………………… 29 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………………… 31 2.1 VẬT LIỆU 31 2.1.1 Sinh phẩm 31 2.1.2 Hố chất mơi trường……………………………………………………… 31 2.1.3 Thiết bị máy móc …………………………………………………………… 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………… 33 2.2.1 Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E coli ……………………………… 33 2.2.2 Phương pháp khuếch đại gen PCR……………………………………… 35 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose ……………………………………… 36 2.2.4 Phương pháp thu DNA từ gel agarose……………………………………… 36 2.2.5 Phương pháp cắt, gắn AND………………………………………………… 37 2.2.6 Phương pháp biến nạp plasmid vào E coli…………………………………… 38 2.2.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide DNA………………………… 39 2.2.8 Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào Agrobacterium tumefaciens phương pháp xung điện……………………………………………………………… 39 2.2.9 Phương pháp chuyển gen vào tảo C reinhardtii nhờ A Tumefaciens……… 41 2.2.10 Phương pháp đếm tế bào…………………………………………………… 42 2.2.11 Phương pháp kiểm tra biểu gen GUS nhuộm hố mơ tế bào…… 42 2.2.12 Phương pháp tách ADN tổng số tảo…………………………………… 42 2.2.13 Phương pháp tách protein tổng số từ tảo…………………………………… 43 2.2.14 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide……………………… 43 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………………… 45 3.1 Khuếch đại đoạn gen mã hoá kháng thể tái tổ hợp từ vector pStrepHis1525/antiHER2 CNSHK810 45 Trần Thị Huyền Trang 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2……………………………………………………………………… 51 3.3 Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp vào vi khuẩn A tumefaciens………… 58 3.4 Chuyển gen vào tảo Chlamydomonas reinhardtii…………………… 60 3.4.1 Phương pháp điều kiện chuyển gen vào tảo C reinhardtii thông qua A tumefaciens………………………………………………………………………… 60 3.4 Kiểm tra chuyển gen antiHER2 vào tảo C reinhardtii phản ứng PCR…………………………………………………………………………… 63 3.5 Kiểm tra biểu gen GUS………………………………………………… 66 3.6 Kiểm tra biểu gen antiHER2 tảo C reinhardtii…………… 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………………… 71 Kết luận……………………………………………………………………………… 71 Kiến nghị…………………………………………………………………………… 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PH LC CNSHK810 80 Trần Thị Huyền Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A tumefaciens DNA RNA AS bp BRCA C reinhardtii CBB CBD CTAB ddNTP dNTP E coli EDTA EGFR ER EtBr Fab Fc Fv GF GUS HER2 Ig Kb kDa LB MAbs MAPK mARN Agrobacterium tumefaciens Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Acetosyringone Base pair Breast cancer = ung thư vú Chlamydomonas reinhardtii Coomasie Brilliant Blue Chitin Binding Domain Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Dideoxyonucleotit triphosphat Deoxyonucleotit triphosphat Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Epidermal Growth Factor Receptor = Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì Estrogen Ethidium bromide Fragment antigen binding Fragment cristallisable Fragment constant Growth Factor β-glucuronidase Human Epidermal Growth Factor Receptor Immunoglobulin Kilobases kiloDaltons Left Border Monoclonal antibody = Kháng thể đơn dòng Mitogen-activated protein kinases Messenger acid ribonucleic CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang Nos NPTII PCR PI3K PR RB scFv SDS SDS-Page Taq T-DNA TAE TAP TE Ti-plasmid TNM UTV v/ph VH Vir VL X- Glu Nospaline synthease Neomycin phosphotransferase gene Polymerase chain reaction Phosphoinositide 3-kinases Progesterone receptor Right border single chain Fv Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Thermus aquaticus polymerase Transfer- DNA Tris acid acetic EDTA Tris-Acetate-Phosphate Tris- EDTA Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Tumor- nodes - metastasis Ung thư vú Vòng/phút Variable region of heavy chain = vùng biến đổi chuỗi nặng Virulence region = vùng gây độc Variable region of light chain = vùng biến đổi chuỗi nhẹ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide CNSHK810 TrÇn ThÞ Hun Trang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Một số mảnh kháng thể đơn chuỗi 16 3.1 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen AntiHER 47 3.2 3.3 3.4 3.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBI101 pJet1.2 mang gen antiHER2 BamH I Sac I Thành phần phản ứng ghép nối gen antiHER2 vào pBI101 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại đoạn AntiHER2 từ ADN tổng số tảo C reinhardtii Tỷ lệ chuyển gen GUS 53 55 64 67 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang DANH MC CC HèNH Hình Tên Hình Trang 1.1 Các dạng ung thư vú 1.2 Cấu trúc protein HER2 10 1.3 Cơ chế gây ung thư biểu mức HER2 12 1.4 Sơ đồ cấu tạo kháng thể 14 1.5 Sơ đồ cấu tạo mảnh kháng thể đơn chuỗi 16 1.6 Cấu tạo tế bào tảo Chlamydomonas reinhardtii 24 1.7 Vòng đời Chlamydomonas 25 3.1 Cấu trúc kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu HER2 46 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi AntiHER2F /AntiHER2R 48 3.3 Sơ đồ vector PJET1.2/blunt 48 3.4 Vi khuẩn E coli mang vector tái tổ hợp mọc mơi trường có 49 chứa Amppicllin sau 15 ni cấy 370C 3.5 Sản phẩm cắt pJet1.2 tái tổ hợp Enzyme giới hạn BamH I, 50 Sac I 3.6 Đoạn T- DNA vector chuyển gen pBI101 52 3.7 Sản phẩm cắt loại bỏ gen GUS pBI101 enzyme 54 BamH I, Sac I 3.8 Kết tách plasmid từ E coli TG1 biến nạp pBI101 tái tổ hợp 55 3.9 Kết sản phẩm PCR từ plasmid tách từ khuẩn lạc E coli TG1 56 sau biến nạp 3.10 Một đoạn Chromatograph gen antiHER2 57 3.11 Kết biến nạp vector pBI101 tái tổ hợp vào A tumefaciens 59 sau 24 nuôi cấy nhiệt độ 28oC 3.12 Kết sản phẩm PCR từ khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp 59 3.13 Hình thái tế bào tảo C reinhardtii mơi trường TAP sau 61 ngy nuụi cy CNSHK810 Trần Thị HuyÒn Trang Bảng 3.5 Tỷ lệ chuyển gen GUS Tổng số tế bào Tế bào dương tính GUS Tỷ lệ (%) 32 37 24 46 65 9,3 10,8 8,8 10,9 12,3 10,42 % Trung bình Tỷ lệ chuyển gen GUS = Tổng số tế bào nhuộm xanh/ tổng số tế bào tảo x100% Theo hiệu suất chuyển gen vào hoạt tính biểu gen GUS đạt 10,42 % Theo số công bố chuyển gen ngoại lai vào C reinhardtii nhờ Agrobacterium thành cơng hiệu suất chuyển gen dựa vào hoạt tính biểu gen GUS 8- 10% 11% [41,42] Như vậy, bước đầu kiểm tra biểu gen GUS thị để đánh giá khả chuyển gen thành công chủng C58C1 (pGV226) vector chuyển gen pBI101 Ngồi ra, q trình nhiễm chủng A tumefaciens mang vector pBI101 mang gen GUS thực song song, điều kiện với trình nhiễm chủng A tumefaciens mang vector pBI101- antiHER2 nên khả gen antiHER2 chuyển thành công gắn vào gen tảo, chép biểu với tỷ lệ phần trăm tương đương tỷ lệ 10,42% dương tính với biểu gen GUS Tuy nhiên cần phải có thêm số thí nghiệm khẳng định điều 3.6 Kiểm tra biểu gen antiHER2 tảo C reinhardtii Để bước đầu kiểm tra biểu gen antiHER2 tảo C reinhardtii, tiến hành tách protein tổng số dịch nuôi cấy tảo chuyển gen dung dịch đệm tách chiết protein tổng số, điện di gel polyacrylamide 12,5% 67 CNSHK810 TrÇn ThÞ Hun Trang Hình 3.18 Kết điện di kiểm tra protein tổng số tảo C reinhardtii Đường chạy M: Thang protein chuẩn Đường cháy số 1: Mẫu tảo không chuyển gen antiHER2 Đường chạy số 2,3; Mẫu tảo chuyển gen antiHER2 Nhìn hình 3.18, đường chạy số xuất băng khác biệt so với đường chạy số dòng tảo khơng chuyển gen, vị trí băng protein nằm băng 66,2 kDa băng 45 kDa thang protein chuẩn, kích thước lý thuyết đoạn protein tái tổ hợp khoảng 59,5 kDa Cùng với kết kiểm tra khả biểu gen GUS, sơ đánh giá hệ promoter Nos trình tự polyadenyl vector nhị thể pBI101 lựa chọn thực chức chúng tế bào tảo C reinhardtii Điều giúp chúng tơi bước đầu nhận định khả biểu thành công kháng thể tái tổ hợp kháng kháng nguyên ung thư vú HER2 tảo C reinhardtii Hơn thập kỷ qua, liệu pháp chữa bệnh dựa vào loại protein (kháng thể) có nhiều thành cơng định Như phân tích phần tổng quan tài liệu dựa vào ưu điểm so với hệ biểu truyền thống, giới, nhà khoa học bắt đầu phát triển hệ thống biểu protein tái tổ hợp loài tảo lục đơn bào, chlamydomonas reinhardtii, ú cú biu hin thnh cụng 68 CNSHK810 Trần Thị HuyÒn Trang số protein tái tổ hợp kháng thể IgA đơn chuỗi hay cấu trúc protein VP1 virus gây lở mồm long móng nối với tiểu phần B độc tố gây bệnh tả biểu từ lạp thể trình gấp nếp xác chứng minh…[49,61] Hệ biểu tảo C reinhardtii tỏ hệ biểu mang nhiều ưu điểm Các nhà nghiên cứu nắm giữ thuận lợi 80 năm phát triển ngành công nghệ gen 30 năm ngành công nghệ sinh học phân tử để bắt đầu kỹ thuật biểu hiệu protein chữa bệnh quan trọng C reinhardtii ứng cử viên hấp dẫn để biểu protein chữa bệnh cho người đặc biệt loại kháng thể đơn dòng dựa vào đặc điểm sinh vật học vốn có sinh vật, dễ dàng ni cấy, quy mơ phát triển tốc độ dòng chuyển gen tái sinh nhanh cần vài tuần mà từ tế bào chuyển gen ban đầu ni tăng sinh lên tới quy mơ thể tích lớn Gen ngoại lai chuyển vào gen nhân lạp thể tảo mở hội lớn để biểu nhiều loại protein khác hệ biểu đơn giản đặc biệt protein phức tạp kháng thể tái tổ hợp Ngoài ra, so với hệ biểu động vât hay thực vật bậc cao chi phí để tạo sản phẩm protein tái tổ hợp tảo thấp Vì vậy, nghiên cứu phần mở hội biểu thành cơng kháng thể đơn dịng nói chung, kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2 nói riêng nhằm góp phần tạo chế phẩm điều trị bệnh người vừa hiệu quả, vừa an toàn đặc biệt chi phớ thp 69 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang KT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế thành công vector vận chuyển gen pBI101-antiHER2 Đã biến nạp thành công vector pBI101 tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng C58C1 (pGV2260) Đã chuyển thành công gen kháng thể tái tổ hợp kháng kháng nguyên HER2 vào tảo Chlamydomonas reinhardtii nhờ Agrobacterium tumefaciens phương pháp đồng nuôi cấy Bước đầu kiểm tra biểu kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2 tảo Chlamydomonas reinhardtii 70 CNSHK810 TrÇn ThÞ Hun Trang Kiến nghị Trên kết bước đầu khả biểu kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2 tảo Chlamydomonas reinhardtii Do vậy, cần có nghiên cứu cách toàn diện về: - Tối ưu trình biểu gen kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 vào tảo Chlamydomonas reinhardtii - Nghiên cứu điều kiện tinh kháng thể tái tổ hợp thu - Nghiên cứu hoạt tính kháng thể tái tổ hợp thu 71 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang TI LIU THAM KHO Ting vit Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học cơng nghệ Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Bá Đức, (2001), Bài giảng ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 72 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang Lờ Duy Thnh (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2006), Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Tiếng Anh Apt, K.E Kroth-Pancic, P.G., and Grossman, A.R (1996), Stable nuclear transformationof the diatom Phaeodactylum tricornutum Mol Gen Genet 252, 572–579.6 Berrington de Gonzalez, A., and Darby, S (11/28/2007), “Risk of cancer from diagnosticX-rays”, http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/breast/riskfactors/ (9 of 11).17 10 Bianco AR, (2004), “Targeting c-erb2 and other receptors of the c-erB family: rationale and clinical applications”, J Chemother; 16:52-54.18 11 Biscardi, J.S., Ishizawar, R.C., Silva, C.M and Parsons, S.J (2000), “Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer”, Breast Cancer Res 2, 203-10.21 12 Borg, J.-P., Marchetto, S., Le, Bivic, A., Ollendorff, V., Jaulin-Bastard, F., Saito, H., Fournier, E., Adélaïde, J., Margolis, B., and Birnbaum, D, (2000), “ERBIN: a basolateral PDZ protein that interacts with the mammalian ERBB2/HER2 receptor”, Nat Cell Biol 2, 407-14 23 13 Cereghino, J L and Cregg, J M (2000), Heterologousprotein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS Microbiol Lett 24, 45–66 14 Chirstoph Griesbeck, Iris Kobl, Markus Heizer (2006), Chlamydomonas reinhardtii A protein expression system for pharmaceutical and biotechnological proteins, Molecular biotechnology review, Vol 34, 213221 73 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang 15 Cho, H S, Mason, K., Ramyar, K X., Stanley, A M., Gabelli, S B., Denney, D W., Jr., & Leahy, D J, (2003), “Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab”, Nature 421, 756-60 30 16 Cho, H-S, Leahy DJ, (2002), “Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether”, Science 297, 1330-3 29 17 Christos Sotirou and Lajos Pusztai (2008), Molecular origin of cancer: gene-expression signatures in breast cancer, , N Engl J Med 360:790 18 David F Stern, (2000), “Tyrosine kinase signalling in breast cancer ErbB family receptor tyrosine kinases”, Breast Cancer Res, 2:176–183 39 19 Debuchy, R., Purton, S., and Rochaix, J D (1989), The argininosuccinate lyase gene of Chlamydomonas reinhardtii: an important tool for nuclear transformation and for correlating the genetic and molecular maps of the ARG7 locus EMBO J 8, 2803–2809 40 20 Ding Z S., Zhao M., Jing Y.X., Li L B and Kuyang T Y (2006), "Efficient Agrobacterium - Mediated transformation of Rice by Phosphomanose Isomerase/Mannose selection", Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.295-303 21 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005), "The plant cell defense and Agrobacterium tumefaciens", FEMS Microbiology letters, 247, pp.207213 22 Doyle, J.J and Doyle, J.L (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12, 13–15.18 23 Endogenous Hormones Breast Cancer Collaborative Group (2003), “Body Mass Index, Serum Sex Hormones, and Breast Cancer Risk in Postmenopausal Women”, JNCI Cancer Spectrum, 95; 16; 1218-1226 41 24 European Patent Application EP0108580 Method for introducing foreign genes into green algae utilizing T-DNA of agrobacterium 74 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang 25 Falciatore, A., Casotti, R., Leblanc, C., Abrescia, C., and Bowler, C (1999), Transformation of nonselectable reporter genes in marine diatoms Mar Biotechnol 1,239–251.8 26 Fischer, R and Emans, N (2000), Molecular farming of pharmaceutical proteins Transgenic Res 9, 279–299 13 27 Franklin, S E and Mayfield, S P (2004), Prospects for molecular farming in the green alga Chlamydomonas Curr Opin Plant Biol 7, 159–165 10 28 Gao, B and Tsan, M F (2003), Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor alpha release by murine macrophages.J Biol Chem 278, 174–179 29 Gelvin S B (2003), "Agrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the "Gene- jockeying" Tool", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp 16-37 30 Gelvin S.B (2000), Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration, Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.51, 223– 256 31 Harari D, Yarden Y, (2000), “Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer”, Oncogene; 19:6102-6113 50 32 Harris, E H (2001), Chlamydomonas as a model organism Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52, 363–406.29 33 Harris, E.H (1989) The Chlamydomonas Source Book: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use Academic Press, New York.2 34 Hendriks, B S, Opresko, L K., Wiley, H S., Lauffenburger, D, (2003), “Quantitative analysis of HER2-mediated effects on HER2 and epidermal growth factor receptor endocytosis: distribution of homo- and heterodimers depends on relative HER2 levels, J Biol Chem 278, 2334351.51 75 CNSHK810 Trần Thị HuyÒn Trang 35 Jahanzeb M (August 2008) "Adjuvant trastuzumab therapy for HER2positive breast cancer" Clin Breast Cancer (4): 324–33 36 Jefferson, R.A (1987), Assaying chimeric genes in plants: the uidA gene fusion system Plant Mol Biol Rep 5, 387–405.17 37 Jeffrey S Ross and Jonathan A Fletcher, (1998), “The HER-2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predictive Factor, and Target for Therapy”, Stem Cells; 16; pp.413-428 58Kelsey, J.L., Gammon, M.D and John, E.M (1993), “Reproductive factors and breast cancer” Epidemiol Rev 15; 1; 36-47 63 38 Kindle, K.L (1990), High frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii Proc Natl Acad Sci USA 93, 13689– 13693.11 39 Kindle, K.L., Schnell, R.A., Fernandez, E., and Lefebvre, P.A (1989), Stable nuclear transformation of Chlamydomonas using the Chlamydomonas gene for nitrate reductase J Cell Biol 109, 2589– 2601.10 40 Kroes, H W., Growth interactions between Chlamydomonas globosa Snow and Chlorococcum ellipsoideum Deason and Bold: The role of extracellular substances Limnol Oceanogr., 1972, 17, 423–432 11 41 Kumar, S.V., Misquitta, R.W., Reddy, V.S., Rao, B.J., and Rajam, M.V (2004), Genetic transformation of the green alga—Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacterium tumefaciens, Plant Sci 166, 731–738 42 Kumar, S V., Rajam, M V (2007), Induction of Agrobacterium tumefaciens vir genes by the green alga, Chlamydomonas reinhardtii, Current Science, Vol 12, No 12, 1727- 1729 43 Lacroix M (2006), "Significance, detection and markers of disseminated breast cancer cells", Endocr Relat Cancer, 13 (4): 1033-67 66 76 CNSHK810 Trần Thị Hun Trang 44 Lến−Bares, R., González-Ballester, D., Galvan, A and Fernández, E (2004) Transgenic microalgae as green cell-factories Trends Biotech 22, 45–52.1 45 Leon-Banares, R., Gonzalez-Ballester, D., Galvan, A., and Fernandez, E (2004), Transgenic microalgae as green cell-factories Trends Biotechnol 22, 45–52 16 46 Malten, M., Barg, H., Martens, J.H., Biedendieck, R., Palme, O., Moser, Künkel, A and Jahn, D, (2003), “Bacillus megaterium – a tool for biotechnology”, VAAM-Jahrestagung, Berlin, 23 – 26/03 (Poster) 74 47 Manchikatla V Rajam and S Vinod Kumar, Green Alga (Chlamydomonas reinhardtii) Methods in Molecular Biology, vol 344: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 2, pp 421-433 48 Mayfield, S P and Franklin, S E (2005), Expression of human antibodies in eukaryotic micro-algae Vaccine 23, 1828–1832 19 49 Mayfield, S P., Franklin, S E., and Lerner, R A (2003), Expression and assembly of a fully active antibody in algae Proc Natl Acad Sci USA 100, 438–442 24 50 Merck Manual, Professional Edition, Ch 253, Breast Cancer 51 Meric-Bernstam and Mien-Chie Hung, (2006), “Advances in Targeting Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 Signaling for CancerTherapy”, Clin Cancer Res; 12(21).77 52 Moasser MM (2007) The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis Oncogene , 26(45):6469-87 53 Muthuswamy SK, Gilman M, Brugge JS (1999), “Controlled dimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signaling by homo- and heterodimers”, Mol Cell Biol 19, 6845-57 80 54 Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J Biotechnol 74, 277.81 77 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang 55 Muyldermans, S., Lauwereys, M (1999), “Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies”, J Mol Recognit 12:131-140.82 56 Patent application US000006932980.69 57 Reichert J M, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz (2005), “Monoclonal antibody successes in the clinic”, Nature Biotechnology, 23, PP 1073 – 1078 janice 40 hien 58 Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al (2005), Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2+ breast cancer; 353:1673–1684 and supplementary appendix 59 Serenella Eppenberger-Castori, Willy Kueng, Christopher Benz, Rosmarie Caduff, Zsuzsanna Varga, Fridolin Bannwart, Daniel Fink, Holger Dieterich, Michael Hohl, Heinz Müller, Kaja Paris, Fabrice Schoumacher, and Urs Eppenberger, (2001) Prognostic and Predictive Significance of ErbB-2 Breast Tumor Levels Measured by Enzyme Immunoassay Journal of Clinical Oncology, Vol 19, pp: 645-656 60 Shimogawara, K., Fujiwara, S., Grossman, A., and Usuda, H (1998) High efficiency transformation of Chlamydomonas reinhardtii by electroporation Genetics 148, 1821–1828.9 61 Sun, M., Qian, K., Su, N., Chang, H., Liu, J., and Chen, G (2003), Footand-mouth disease virus VP1 protein fused with cholera toxin B subunit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast Biotechnol Lett 25,1087–1092 23 62 Walker, T L., Purton, S., Becker, D K., and Collet, C (2005), Microalgae as bioreactors Plant Cell Rep 24, 629–641.18 63 WHO classification of tumours (2003), Tumours of the breast and female genital organs Ti liu t internet 78 CNSHK810 Trần Thị HuyÒn Trang 64 http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1 363?cookieSet=1&journalCode=arplant.2 65 http://en.wikipedia.org/wiki/Breast_cancer 66 http://en.wikipedia.org/wiki/Chlamydomonas_reinhardtii 67 http://www.bioinfo.pte.hu/f2/pict_f2/pJETmap.pdf 68 http://www.macmillan.org.uk/Cancerinformation/Cancertypes/Breast/Sym ptomsdiagnosis/HormoneandHER2receptors/HER2andbreastcancer.aspx 69 http://www.molecularinfo.com/MTM/K/K2/K2-1/pBI101.pdf 70 http://www.lablife.org/p?a=vdb_view&id=g2.i6yV94UwtS9Qo6Xpg2VZ8 sVKtVw71 http://www.vja.org.vn/vi/detail.php?pid=6&catid=45&id=24322&dhnam e=Ung-thu-tang-chong-mat PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ vector pBIN19 79 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang Ph lc Chu kỳ nhiệt chạy PCR khuyếch đại gen AntiHER2 Nhiệt độ (ºC) Thời gian (phút) Tác dụng Số chu kỳ 94 3:00 Biến tính 94 0:45 Biến tính 52 0:45 Gắn mồi 72 1:20 Tổng hợp 72 8:00 Bổ sung ∞ Bảo quản 30 Phụ lục Dung dịch sử dụng kiểm tra protein tổng số 80 CNSHK810 Trần Thị Huyền Trang Dung dch Húa cht Nng Đệm chạy điện di protein (1X Tris- Glycine pH 8,3) Tris base Glycine SDS H2O 3g 14,4 g 1g 1l Đệm tra mẫu protein (Protein sample buffer 4X) Tris- HCl pH= 6,8 Glycerol SDS DTT Bromophenol Blue 0,5M 60% 20% 1M 0,2% Dung dịch nhuộm protein (Comasive Brilliant Blue R250) Comasive R250 Metanol Acid acetic H2O 0,3 g 120 ml 30 ml 150 ml Dung dịch tẩy gel protein Acid acetic 7% Metanol 20% H2O 35 ml 100 ml 365 ml Phụ lục Thành phần gel polyacrylamide Thành phần Nồng độ Gel cô 4% (Stacking gel) Gel tách 10% (Separating gel) Tris- HCl, pH=6,8 0,5M 0,75 ml - Tris- HCl, pH= 8,8 1,5M - 2,25 ml SDS 10% 30 µl 90 µl Acrylamide 30% 0,4 ml 3,02 ml H2O - 1,8 ml 3,55 ml APS 10% 15 µl 45 µl - µl 4,5 µl ml ml TEMED Tổng thể tích 81 CNSHK810 ... tài: ? ?Nghiên cứu biểu gen kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2 tảo Chlamydomonas reinhardtii? ?? Mục tiêu đề tài: - Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng thể đặc hiệu. .. kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 - Nghiên cứu chuyển gen kháng thể đặc hiệu kháng nguyên HER2 vào tảo Chlamydomonas reinhardtii - Nghiên cứu khả biểu kháng thể tảo Chlamydomonas reinhardtii CNSHK810... thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho chẩn đoán mang lại hiệu cao điều trị ung thư vú [52,59] Tuy nhiên, sau có gen tái tổ hợp việc biểu để thu nhận tinh kháng thể tái tổ hợp vấn đề