Nghiên cứu biểu hiện gen paga mã hóa kháng nguyên bảo vệ pa của vi khuẩn bacillus anthracis trong vi khuẩn e coli bl21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PHƢỢNG MINH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN PAGA MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ PA CỦA VI KHUẨN BACILLUS ANTHRACIS TRONG VI KHUẨN E COLI BL21 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGƠ ĐÌNH BÍNH HÀ NỘI - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ, hỗ trợ thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn tất tình cảm q báu Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngơ Đình Bính, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán phịng Di truyền Vi sinh, Viện cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian dài thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng cán Viện Hóa học Mơi trường Quân nơi công tác tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình, người ủng hộ suốt thời gian qua! Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2013 Học viên Nguyễn Phượng Minh Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Acid Adenozin Triphosphate B anthracis/ Ba Bacillus anthracis bp base pair CA Casamino Acid dH2O deion water DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EF Edema Factor FAO Food Agricultural Organisation h kDa Kilo Dalton LB Lauria Betani LF Lethal Factor MPA Meat Pepton Agar MPB Meat Pepton Broth ORF Open Reading Frame PA Protective Antigen PCR Polymerase Chains Reaction SDS Sodium Dodecylsulphate TAE Tris – Acetate EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc bệnh than 1.1.1 Lịch sử xuất phát triển bệnh than 1.1.2 Các dạng bệnh than 1.1.2.1 Bệnh than thể da 1.1.2.3 Bệnh than hô hấp 1.1.2.4 Bệnh than thể màng não 1.1.3 Bệnh than chiến tranh sinh học 1.2 Tác nhân gây bệnh than 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis 10 1.2.2 Độc tố vi khuẩn B anthracis 11 1.2.2.1 Độc tố vỏ nhày 11 1.2.2.2 Độc tố than 12 1.2.2.2.1 Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA) 12 1.2.2.2.2 Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF) 13 ện gen gây độc vi khuẩn B anthracis 15 1.3 Kháng nguyên bảo vệ PA 17 1.3.1 Vai trò kháng nguyên bảo vệ PA 17 1.3.2 Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA 18 1.3.3 Cơ chế dẫn truyền độc tố kháng nguyên bảo vệ PA 20 1.4 Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA 22 1.5 Biểu gen pagA 23 1.5.1 Vector biểu 23 1.5.2 Lựa chọn chủng biểu 25 1.5.3 Phƣơng pháp biểu 26 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu 28 28 2.2 Hố chất mơi trƣờng 29 2.2.1 Hoá chất, dung dịch 29 2.2.2 Môi trƣờng 34 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn [30] 35 2.3.2 Phƣơng pháp tinh plasmid [30] 35 2.3.3 Phƣơng pháp PCR 36 2.3.4 Phƣơng pháp điện di gel agarose [30] 36 2.3.5 Phƣơng pháp cắt enzym giới hạn [30] 37 2.3.7 Phƣơng pháp làm tế bào khả biến E coli 39 2.3.8 Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30] 39 2.3.9 Phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide 12,6 % [30] 40 2.3.10 Phƣơng pháp biểu gen 41 2.3.11 Khảo sát điều kiện biểu thích hợp cho trình biểu 41 2.3.12 Xác định khả hoà tan protein 42 2.3.13 Tinh chế protein dung hợp cột Probond Nikel Resin 42 2.3.14 Phƣơng pháp Western Blot [3, 25] 44 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Tách chiết DNA tổng số 46 3.2 Khuếch đại đoạn gen pagA phản ứng PCR 46 3.3 Tách dòng gen pagA 47 3.3.1 Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 47 3.3.2 Kiểm tra tồn gen pagA vector tái tổ hợp 47 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.3 Đọc trình tự nucleotide gen pagA 51 3.4 Biểu gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54 3.4.1 Thiết kế vector biểu mang gen pagA 54 3.4.2 Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu pET-TRX-FUS 54 3.4.3 Tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA 55 3.4.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E coli DH5α 55 3.4.3.2 Kiểm tra tồn pagA plasmid tái tổ hợp 55 3.4.3.3 Kiểm tra khung đọc vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA 57 3.4.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E coli BL21 (DE3) 58 3.4.4 Nghiên cứu biểu gen pagA E coli BL21 59 3.4.4.1 Nghiên cứu điều kiện biểu gen pagA 59 3.4.4.2 Xác định khả hoà tan định khu protein 62 3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin 63 3.6 Khẳng định biểu protein tái tổ hợp PA phản ứng Western blot 64 66 66 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than Hình1 4: Não người bị nhiễm bệnh Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) bào tử (B) vi khuẩn B anthracis 10 Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF 13 Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF 14 Hình 1.8: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA 18 Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam kháng nguyên bảo vệ PA 20 Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố kháng nguyên bảo vệ PA 20 Hình 1.11: Vector biểu 23 Hình 1.12: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vectơ pET-28a(+) 25 Hình 2.1: Mơ hình phản ứng Western blot 44 Hình 3.1 Điện di DNA tổng số gel 0,8% agarose 46 Hình3.2 Điện di sản phẩm PCR gen pagA gel 0,8% agarose 46 Hình 3.3 Khuẩn lạc E coli DH5α môi trường LBA chứa X - gal ampicillin 47 Hình 3.4 Điện di DNA plasmid từ dòng khuẩn lạc xanh trắng gel 0,8 % agarose 48 Hình 3.5 Điện di sản phẩm cắt EcoRI gel 1,5% agarose 49 Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng dòng 1, 10 enzyme BamHI XhoI gel % agarose 50 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 BA2 từ dòng khuẩn lạc 1,2 gel 0,8% agarose 51 Hình 3.8 So sánh trình tự gen pagA chủng B anthracis VCM1167 với Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ trình tự cơng bố ngân hàng gen quốc tế 52 Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu pET-TRX-FUS-pagA 54 Hình 3.10 Điện di sau thơi gel gel 1% agarose 55 Hình 3.11 Khuẩn lạc E coli DH5α môi trường LBA 55 Hình 3.12 Điện di plasmid từ khuẩn lạc E coli DH5a gel % agarose 56 Hình 3.13 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp gel % agarose 56 Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR gel % agarose 57 Hình 3.15 Trình tự acid amin protein kháng nguyên bảo vệ lý thuyết 58 Hình 3.16 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli chủng BL21 môi trường LBA 58 Hình 3.17 Điện di biểu protein PA gel 12,6 % polyacrylamide 59 Hình 3.18 Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ gel 12,6 % polyacrylamide 60 Hình 3.19 Điện di biểu protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG 61 Hình 3.20 Điện di mẫu protein PA theo thời gian gel 12,6 % polyacrylamide 62 Hình 3.21 Điện di protein tan không tan gel 12,6 % polyacrylamide 63 Hình 3.22 Điện di protein sau tinh gel 12,6 % polyacrylamide 64 Hình 3.22a Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin màng lai PVDF 65 Hình 3.22b Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA màng lai PVDF 65 Hình 3.22c Phản ứng western blot protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên 65 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh than bệnh nhiễm khuẩn cấp tính vi khuẩn Bacillus anthracis (B anthracis) gây cho gia súc, đặc biệt cho động vật ăn cỏ trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả lây nhiễm sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao Bệnh có nhiều dạng biểu khác tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhìn chung, bệnh than bao gồm dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu hoá than thể màng não Bệnh than bệnh vơ nguy hiểm Nó mang số đặc điểm trung tâm kiểm soát ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết trường hợp làm vũ khí sinh học thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh chống chịu với điều kiện khắc nghiệt Chính vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than tác nhân gây bệnh than quan trọng Kháng nguyên tái tổ hợp Protective Antigen (PA) loại độc tố than vi khuẩn Bacillus anthracis PA nhân tố định tính độc vi khuẩn than Bản thân PA không gây độc kết hợp với nhân tố gây chết Lethal Factor (LF) hay nhân tố gây phù thũng Edema Factor (EF) lại sinh sản độc tố gây chết phù thũng cho tế bào vật chủ Ngồi ra, PA cịn có chứa vùng liên kết thụ thể có khả gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than Chính vậy, có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đốn bệnh than tạo vaccine phịng chống bệnh than Xuất phát từ tính cấp thiết tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu biểu gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn Bacillus anthracis vi khuẩn E coli BL21” Mục tiêu đề tài: Biểu Protein PA vi khuần Bacillus anthracis vi khuẩn E coli BL21, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thu nhận kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu chuyên sâu Nhiệm vụ đề tài: Tách dịng giải trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, Thiết kế vector biểu pET-TRX-FUS mang gen pagA, Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA, Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp cho q trình biểu nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), thời gian, Tinh protein PA cột sắc ký lực Probond Nikel Resin, Kiểm tra khả phản ứng protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA phản ứng Western blot Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.12 Điện di plasmid từ khuẩn lạc E coli DH5a gel % agarose Giếng 2,6: Dòng khuẩn lạc mang gen pagA Giếng 1,3,4,5,7,8: Dòng khuẩn lạc khơng mang gen pagA Dựa hình 3.12 dự đốn DNA plasmid dịng khuẩn lạc số mang gen pagA Do đó, plasmid tái tổ hợp hai dòng khuẩn lạc tiếp tục kiểm tra phương pháp cắt enzyme giới hạn PCR a Phƣơng pháp cắt giới hạn BamHI XhoI Chúng sử dụng enzyme giới hạn BamHI XhoI Kết điện di sản phẩm cắt gel agarose thể hình sau: kb 5,8 2,2 kb Hình 3.13 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp gel % agarose Giếng 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp Giếng 3: Vector pET- TRX - FUS Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Kết hình cho thấy, giếng xuất hai băng, băng có kích thước tương tự kích thước vector pET-TRX-FUS (5,8 kb), băng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ có kích thước khoảng 2,2 kb tương tự kích thước đoạn gen pagA Do sản phẩm cắt DNA plasmid dịng khuẩn lạc tạo băng hồn tồn phù hợp lý thuyết b.Kiểm tra có mặt gen kb vector biểu phương pháp PCR Sau tách chiết DNA plasmid chủng biểu 2,2 kb E coli DH5α, tiến hành kiểm tra có mặt đoạn gen pagA phản ứng PCR Phản ứng thực sử dụng cặp mồi BA1 Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR gel % agarose Giếng 1: DNA plasmid pCR2.1-pagA Giếng 2,3: DNA plasmid từ dòng Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas) BA2, có tham gia emzyme Taq polymerase dNTPs với chu trình nhiệt thích hợp thiết kế Sản phẩm PCR gen pagA kiểm tra điện di gel % agarose, thể hình sau: Kết hình 3.14 cho băng có kích thước ~ 2,2 kb Băng sản phẩm tương tự băng sản phẩm thu từ DNA plasmid tái tổ hợp pCR2.1 pagA 3.4.3.3 Kiểm tra khung đọc vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA Dữ liệu trình tự dịng plasmid tái tổ hợp thu được sử dụng để dịch mã acid amin lý thuyết nhằm kiểm tra khung đọc gen sử dụng cơng cụ EXPASY Kết cho thấy trình tự gen pagA dịch mã thông, bao gồm 735 acid amin: 10 20 30 40 50 60 EVKQENRLLN ESESSSQGLL GYYFSDLNFQ APMVVTSSTT GDLSIPSSEL ENIPSENQYF 70 80 90 100 110 120 QSAIWSGFIK VKKSDEYTFA TSADNHVTMW VDDQEVINKA SNSNKIRLEK GRLYQIKIQY Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 130 140 150 160 170 180 QREDPTEKGL DFKLYWTDSQ NKKEVISSDN LQLPELKQKS SNSKKRRSTS AGPTVPDRDN 190 200 210 220 230 240 DGIPDSLEVE GYTVDVKNKR TFLSPWISNI HEKKGLTKYK SSPEKWSTAS DPYSDFEKVT 250 260 270 280 290 300 GRIDKNVSPE ARHPLVAAYP IVHVDMENII LSKNEDQSTQ NTDSQTRTIS KNTSTSRTHT 310 320 330 340 350 360 SEVHNGAEVH ASFFDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL AGERTWAETM GLNTADTARL 370 380 390 400 410 420 NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA 430 440 450 460 470 480 LNAQDDFSST PITMNYNQFL ELEKTKQLRL DTDQVYNGIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV 490 500 510 520 530 540 LPQIQETTAR IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNNGL 550 560 570 580 590 600 QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL IRDKRFHYDR 610 620 630 640 650 660 NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRY 670 680 690 700 710 720 DMLNISSLQQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG 730 IKRILIFSKK GYEIG Hình 3.15 Trình tự acid amin protein kháng nguyên bảo vệ lý thuyết 3.4.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E coli BL21 (DE3) Sau thu vector biểu tái tổ hợp mang gen pagA với khung đọc chuẩn, tiến hành biến nạp vào E coli BL21 phương pháp sốc nhiệt Dịch nuôi lắc 37oC (1 giờ) cấy trải mơi trường LBA có chứa knamycin Sau ủ qua đêm 37oC, đĩa petri xuất khuẩn lạc hình 3.16: Hình 3.16 Khuẩn lạc E coli BL21 môi trường LBA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Như vậy, tạo chủng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pETTRX-FUS mang gen pagA 3.4.4 Nghiên cứu biểu gen pagA E coli BL21 3.4.4.1 Nghiên cứu điều kiện biểu gen pagA Tiến hành lựa chọn bốn khuẩn lạc ni hoạt hóa qua đêm mơi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 37oC Sau đó, dịch ni cấy chuyển % nuôi tiếp để OD đạt 0,5-0,8 (khoảng 2-3 giờ) Một phần mẫu hút làm đối chứng, phần lại cảm ứng IPTG với nồng độ cuối mM Cả mẫu đối chứng cảm ứng ni 37oC với tốc độ 200 vịng/phút Thu mẫu điện di gel 12,6 % polyacrylamid (Hình 3.17): kDa 10 116 66 45 35 25 18,4 Hình 3.17 Điện di biểu protein PA gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1, 3, 6, : Mẫu sau cảm ứng IPTG Giếng 2, 4, 7, 9: Mẫu không cảm ứng Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Protein tái tổ hợp Thioredoxin-pagA-Histag hình thành kết nối protein với nhau: TrxTag với 127 acid amin, PA với 735 acid amin đuôi Histag với acid amin, tổng cộng 868 acid amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.17 cho thấy, giếng có cảm ứng 1, 3, 6, xuất băng protein lạ có kích thước khoảng gần 100 kDa tính tốn lý thuyết Như sơ kết luận q trình biểu thành cơng kiểm sốt promotor T7 Ngồi ra, dịng cảm ứng giếng số cho kết biểu tốt Do đó, lựa chọn dịng cho nghiên cứu Để xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA, tế bào E coli BL21 cấy lắc điều kiện nhiệt độ khác là: 25, 28, 30, 37oC Sau nuôi cấy, thu tế bào Điện di mẫu gel 12,6 % polyacrylamide để tìm nhiệt độ tốt cho trình biểu Kết thể hình 3.18: 10 kDa 116 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.18 Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng Giếng 2: Thang protein chuẩn (Fermentas), Giếng 3, 5, 7, 9: Mẫu cảm ứng 25, 28, 30, 37oC Giếng 4, 6, 8, 10: Mẫu không cảm ứng 25, 28, 30, 37oC Hình 3.18 cho thấy biểu 30oC 37oC tế bào cảm ứng tổng hợp protein tốt 37oC nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động thuỷ phân protein tái tổ hợp tạo thành Do đó, lựa chọn nhiệt độ biểu 30oC tốt Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nồng độ IPTG yếu tố quan trọng việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp PA Do đó, sau lựa chọn nhiệt độ cảm ứng 30 oC, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho trình lên men sinh tổng hợp PA Kết nghiên cứu nồng độ cảm ứng IPTG 0,2; 0,5; 0,7; 1; mM thử nghiệm cho thấy tổng hợp protein PA tối ưu cảm ứng 1mM 116 98 kDa 66 45 35 25 Hình 3.19 Điện di biểu protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG Giếng 1-7: Mẫu trƣớc cảm ứng, thang protein chuẩn (Fermentas), mẫu không cảm ứng, 0,2; 0,5; 0,7; 1; mM Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới suất biểu protein tái tổ hợp PA, lượng protein tổng hợp thời điểm khác Nếu thu sớm protein chưa tổng hợp tối đa, thu muộn sinh chất ức chế phân hủy protein tạo thành Chính vậy, chúng tơi cố định nhiệt độ cảm ứng 30oC, nồng độ IPTG cảm ứng mM khảo sát biểu protein tái tổ hợp theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, giờ) Mẫu xử lý điện di kiểm tra gel 12,6 % polyacrylamide Kết thể hình 3.20: Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ kDa 116 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.20 Điện di mẫu protein PA theo thời gian gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng Giếng 2: Thang protein chuẩn chuẩn (Fermentas) Giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8: lần lƣợt mẫu đƣợc cảm ứng với IPTG lúc 0,1 3,4,5 Hình 3.20 cho thấy lượng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian Lượng protein tạo thành thời điểm tương tự thời điểm Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lượng protein tái tổ hợp giảm trình lên men tạo chất ức chế phân hủy Do đó, lựa chọn thời điểm để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm chi phí lên men 3.4.4.2 Xác định khả hoà tan định khu protein Để kiểm tra khả hòa tan protein kháng nguyên bảo vệ PA, làm sở cho nghiên cứu sau, nghiên cứu khả hòa tan protein PA qua việc so sánh khả tổng hợp protein pha tan phần cặn sau siêu âm phá tế bào Sau cảm dòng E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp 30oC, mM IPTG Ly tâm thu tế bào phá tế bào siêu âm đệm xử lý mẫu Phần tan phần cặn sau xử lý điện di gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.21): Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ kDa 116 98 kDa 98 kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.21 Điện di protein tan không tan gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu cảm ứng lúc 4h Giếng 2: Mẫu trƣớc cảm ứng Giếng 3: Mẫu không cảm ứng Giếng 4: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 5: protein hồ tan Giếng 6: protein khơng tan Khả hòa tan PA tái tổ hợp đánh giá sở so sánh pha tan pha không tan lần cảm ứng Pha tan phần dịch nổi, pha không tan (thể vùi-inclusion body) phần cặn thu sau phá tế bào siêu âm ly tâm Kết hình 3.21 cho ta thấy protein tái tổ hợp PA tổng hợp chủ yếu dạng thể vùi Theo tài liệu cơng bố tượng xảy phổ biến gen biểu mạnh E coli dẫn đến tượng sản phẩm protein tạo không kịp gấp nếp (folding) tập trung với nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn dạng hạt thể vùi Do khơng thể tinh điều kiện bình thường mà phải siêu âm phá tế bào tinh điều kiện biến tính 3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin Do protein tái tổ hợp có lực 6x histidine, sử dụng cột sắc kí lực, chất giá dùng để nhồi cột Ni(+) 8ml dịch phá tế bào ly tâm, phần dịch có chứa protein tái tổ hợp đưa lên cột Các protein có Histag có lực với Ni(+) bám chặt chất giá cột Sau rửa cột đệm rửa protein E coli bị trơi khỏi cột cịn protein có lực giữ lại Sau protein có lực đẩy khỏi cột Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhờ đệm đẩy, thu phân đoạn, phân đoạn ml Sau tinh chế protein kiểm tra độ điện di gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22): 10 kDa 116 98 kDa 66 45 Hình 3.22 Điện di protein sau tinh gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy khỏi cột (7- 1) Giếng 8: Protein trƣớc tinh Giếng 9: Mẫu không cảm ứng Giếng 10: Thang protein chuẩn (Fermentas) Sau tinh hình 3.22 xuất băng tương đương với kích thước protein tái tổ hợp trước tinh (98 kDa) Như vậy, protein tái tổ hợp PA tinh thành công cột sắc ký lực Histag 3.6 Khẳng định biểu protein tái tổ hợp PA phản ứng Western blot Để khẳng định protein biểu ghi nhận SDS-PAGE dạng dung hợp Thioredoxin, sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng Thioredoxin đánh dấu HPR (Hình 3.25a) Ngồi ra, sau thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng PA kháng thể kháng bệnh than tự nhiên thỏ, tiến hành kiểm tra phản ứng với protein tái tổ hợp Western blot (Hình 3.25b,c) Cả phản ứng lai phát kháng thể anti-rabbit IgG-HPR Kết cho thấy có vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính tốn lý thuyết Như vậy, dựa kết Western blot khả kích thích thể sản sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng bệnh than cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa biểu protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ kDa 170 130 98 kDa 95 72 55 Hình 3.22a Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin màng lai PVDF Giếng Thang chuẩn protein kDa 170 130 95 72 55 98 kDa Hình 3.22b Phản ứng protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA màng lai PVDF Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 8: Đối chứng (Huyết thỏ trước gây miễn dịch) Ngoài ra, khả phản ứng protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng bệnh than tự nhiên cho thấy protein PA có khả sử dụng làm kit phát kháng thể kháng PA huyết bệnh nhân 98 kDa 170 130 95 72 55 Hình 3.22c Phản ứng western blot protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên Giếng 1: Mẫu huyết thỏ sau gây miễn dịch Giếng 4: Thang protein chuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Đã tách dịng đọc trình tự trình tự có kích thước 2210 bp, gen pagA, gen pagA đọc độ tương đồng 99 % so với gen pagA B anthracis ngân hàng gen quốc tế (M22589) 404322 pagA vị trí thay đổi nucleotide Trong có vị trí nucleotide thay đổi cơng bố vị trí thay đổi nucleotide Đã thiết kế thành cơng vector biểu pET-TRX-FUS-pagA vector pET-TRX có chứa trình tự mã hóa protein Thioredoxin acid amin Histidine Đã biểu thành công gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn B anthracis E coli BL21, nhiệt độ thích hợp cho cảm ứng tổng hợp protein PA 30oC, nồng độ IPTG 1mM thời gian kết thúc cảm ứng Protein PA tái tổ hợp có khối lượng phân tử 98 kDa Đã tinh protein PA cột Probond Nikel Resin Đã kiểm tra khả phản ứng protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA kháng thể tự nhiên kháng bệnh than Western blot Protein PA vi khuẩn Bacillus anthracis sinh có phản ứng miễn dịch với kháng thể PA tái tổ hợp KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu vùng kháng nguyên bảo vệ PA Theo tài liệu công bố gần đây, vùng vùng liên kết thụ thể chứa vị trí epitop định kháng nguyên Vùng chứng minh có khả đáp ứng miễn dịch Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt ê Bacillus anthracis 2003 NXB KHKT, Hà Nội 150 – 154 , Ngu Bacillus anthracis NXB KHKT 42– 45 Bacillus anthracis 870 Tài liệu tiếng Anh Ash C, Farrow JA, Dorsch M, Stackebrandt E, Collins MD (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA Int J Syst Bacteriol 41(3): 343 – 346 Brachman PS, Gold H, Plotkin SA, Fekety FR, Werrin M, Ingraham NR (1962) Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine Am J Public Health Nations Health 52 (4): 632 – 645 Brossier F, Weber–Levy M, Mock M, Sirard JC (2000) Role of toxin functional domains in anthrax pathogenesis Infect Immun 68 (4): 1781 – 1786 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Dixon TC, Meselson M, Guillemin J, Hanna PC (1999) Anthrax N Engl J Med 341 (11): 815 – 826 Ezzell JW Jr, Abshire TG (1988) Immunological analysis of cell–associated antigens of Bacillus anthracis Infect Immun 56 (2): 349 – 56 Gupta P, Waheed SM, Bhatnagar R (1999) Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis Protein Expr Purif 16 (3): 369 – 376 10 Green BD, Battisti L, Koehler TM, Thorne CB, Ivins BE (1985) Demonstration of a capsulee plasmid in Bacillus anthracis Infect Immun 49 (2): 291 – 297 11 Haines Bw, Klein F, Lincoln Re (1965) Quantitative assay for crude anthrax toxins J Bacteriol 89: 74 – 83 12 Hoffmaster AR, Koehler TM (1999) Control of virulence gene expression in Bacillus anthracis J Appl Microbiol (2): 279 –281 13 Hoffmaster AR, Koehler TM (1999) Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon J Bacteriol 181 (15): 4485 – 4492 14 Koehler TM, Dai Z, Kaufman–Yarbray M (1994) Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans–acting element activate transcription from one of two promoters J Bacteriol 176 (3): 586 – 595 15 Leppla SH (1982) Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations of eukaryotic cells Proc Natl Acad Sci U S A 79 (10): 3162 – 3166 16 Little SF, Knudson GB (1986) Comparative efficacy of Bacillus anthracis live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig Infect Immun 52 (2): 509 – 512 17 Meselson M, Guillemin J, Hugh–Jones M, Langmuir A, Popova I, Shelokov A, Yampolskaya O (1994) The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979 Science 266 (5188): 1202 – 1208 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 Mock M, Fouet A (2001) Anthrax Annu Rev Microbiol 55: 647 – 671 19 Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC (1997) Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen Nature 385 (6619): 833 – 838 20 Price LB, Hugh–Jones M, Jackson PJ, Keim P (1999) Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis J Bacteriol 181 (8): 2358 – 2362 21 Puziss M, Manning Lc, Lynch Jw, Barclaye, Abelow I, Wright Gg (1963) Large–scale production of protective antigen of Bacillus anthracis in anaerobic cultures Appl Microbiol 11: 330 – 334 23 Puziss M, Wright Gg (1954) Studies on immunity in anthrax IV Factors influencing elaboration of the protective antigen of Bacillus antracis in chemically defined media J Bacteriol 68 (4): 474 – 482 24 Puziss M, Wright Gg (1963) Studies on immunity in anthrax X Gel– adsorbed protective antigen for immunization of man J Bacteriol 85: 230 – 236 25 Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1992) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications Biotechnology 24: 145 – 149 26 Ristroph JD, Ivins BE (1983) Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium Infect Immun 39 (1): 483 – 486 27 Strange Re, Thorne Cb (1958) Further purification studies on the protective antigen of Bacillus anthracis produced in vitro J Bacteriol 76 (2): 192 – 202 28 Welkos SL, Lowe JR, Eden–McCutchan F, Vodkin M, Leppla SH, Schmidt JJ (1988) Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis Gene 69(2):287–300 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 29 Wright Gg, Green Tw, Kanode Rg Jr (1954) Studies on immunity in anthrax V Immunizing activity of alum–precipitated protective antigen J Immunol 73 (6): 387 – 391 30 Sambroo J and Rusell WD (2001) Molecular cloning: A laboratory manual , 3rd , ed Cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor NY Các trang web 31 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/anthrax.html 32 http://en.wikipedia.org/wiki/2001_anthrax_attacks 33 http://dantri.com.vn/c7/s7–241922/13–truong–hop–mac–benh–than.htm Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... giải trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, Thiết kế vector biểu pET-TRX-FUS mang gen pagA, Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA, Nghiên cứu tìm điều kiện... Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.3 Đọc trình tự nucleotide gen pagA 51 3.4 Biểu gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54 3.4.1 Thiết kế vector biểu mang gen pagA. .. Betani LF Lethal Factor MPA Meat Pepton Agar MPB Meat Pepton Broth ORF Open Reading Frame PA Protective Antigen PCR Polymerase Chains Reaction SDS Sodium Dodecylsulphate TAE Tris – Acetate EDTA