Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà muscadomestica trong vi khuẩn escherichia coli

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Nghiên cứu biểu gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica vi khuẩn Escherichia coli Học viên: Đặng Văn Tiến Lớp: CHST _ K15 Hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính Hà Nội, 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.1.2 Nghiên cứu, sản xuất ứng dụng Bt Việt Nam 1.1.3 Vị trí, đặc điểm hình thái sinh thái học Bt 1.1.3.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 1.1.4 Đặc điểm phân loại 1.1.5 Hệ gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 11 1.1.6 Cơ chế tác động protein tinh thể diệt côn trùng 15 17 1.3 Tổng quan côn trùng thử nghiệm 18 1.3.1 Phân loại khoa học ruồi nhà (Musca domestica) 19 1.3.2 Vòng đời ruồi nhà (Musca domestica) 19 1.3.3 Ảnh hưởng ruồi sức khỏe cộng đồng 21 1.3.4 Một số phương pháp diệt phòng chống ruồi .22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Sinh phẩm 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.1 Phân loại Bacillus thuringiensis phương pháp huyết miễn dịch 27 2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học .27 2.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 29 2.2.4 Phương pháp tinh plasmid E coli .30 2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A 30 2.2.6.Phương pháp điện di gel agarose .30 2.2.7 Phương pháp tách dòng gen cry2 .31 2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit đoạn gen tách dòng 32 2.2.9 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 12,6 % 32 2.2.10 Phương pháp biểu gen 34 2.2.11 Khảo sát điều kiện biểu thích hợp cho trình biểu .34 2.2.12 Xác định khả hoà tan protein .35 2.2.13 Tinh chế protein dung hợp cột Probond Nikel Resin .35 CHƢƠNG 3: ẢO LUẬN 37 Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37 3.2 Phân loại chủng Bacillus thuringiensis 38 Musca domestica chủng Bt phân lập đƣợc 40 3.4 Phát gen cry2A từ chủng Bacillus thuringiensis phân loại huyết phƣơng pháp PCR 42 đọc trình tự gen cry2A 43 2A .43 2A 45 3.6 Nghiên cứu biểu gen cry2A vi khuẩn E coli BL21 (DE3) 48 3.6.1.Thiết kế vector biểu mang gen cry2A 48 3.6.2 Gắn đoạn gen cry2A vào vector biểu pET22b(+) 49 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.6.3 Tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen cry2A 50 3.6.3.2 Kiểm tra tồn cry2A plasmid tái tổ hợp 50 3.6.4 Nghiên cứu biểu gen cry2A E coli BL21 54 3.7 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin 58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 61 62 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho hoàn thành khóa học luận án Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người bên tôi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ết tắt STT ết đầy đủ Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis CFU Colony Forming Unit dH2O Deion water DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate ĐC Đối chứng E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 10 EtBr Ethidium Bromide 11 kDa Kilo Dalton 12 OD Optical density - mật độ quang học 13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi 14 SDS Sodium dodecyl sulphate 15 Sol Solution 16 TE Tris EDTA 17 X-gal 5- bromo- Cloro- indolyl β- d galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bt Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A Bảng 3.1: Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bt Bảng 3.2: Kết phân loại dƣới loài chủng Bacillus thuringiensis phƣơng pháp huyết Bảng 3.3: Kết thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica chủng Bt sau ngày thử nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) bào tử (Spore) Hình 1.3 Mô hình cấu trúc chung protein tinh thể độc tố Cry Hình 1.5 Ruồi nhà (Con ruồi đực - Bên trái; Con ruồi - bên phải) Hình 1.6 Vòng đời ruồi nhà (Musca domestica) Hình 1.7 Trứng ruồi nhà (Musca domestica) Hình 3.1 Hình dạng bào tử tinh thể vi khuẩn Bt Hình 3.2 Hình ảnh ngƣng kết chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết dƣới kính hiển vi quang học Hình 3.3 Ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica chủng Bt phân lập Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pCR2.1- cry2A vào vi khuẩn E.coli DH5α Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide từ dòng khuẩn lạc pCR2.1 cry2A - LNT7.12 pCR2.1 - cry2A - MSS8.4 agarose 1% Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt đoạn gen cry2A Hình 3.8 So sánh trình tự gen chủng MSS8.4 LNT7.12 với AJ488143.1 Hình 3.9 sơ đồ thiết kế vector biểu gen cry2A Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt mở vòng vector pET22b(+) Hình 3.11 Điện di sản phẩm cắt đoạn gen cry2A từ vector tái tổ hợp pCR2.1 – cry2A Hình 3.12 Khuẩn lạc E coli DH5α môi trƣờng LBA Hình 3.13 Điện di plasmid từ khuẩn lạc E coli DH5a gel % agarose Hình 3.16 Trình tự acid amin protein Cry2A lý thuyết Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.17 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli chủng BL21 môi Hình 3.18 Điện di biểu protein rCry2A gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.19 Điện di protein tái tổ hợp Cry2A theo nhiệt độ gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.20 Điện di biểu protein tái tổ hợp Cry2A theo nồng độ IPTG Hình 3.21 Điện di mẫu protein Cry2A theo thời gian gel 12,6 % polyacrylamide Hình 3.22 Điện di protein sau tinh gel 12,6 % polyacrylamide Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp rCry2A, tế bào E coli BL21 đƣợc cấy lắc điều kiện nhiệt độ khác là: 25, 28, 30, 37oC Sau nuôi cấy, thu tế bào Điện di mẫu gel 12,6 % polyacrylamide để tìm nhiệt độ tốt cho trình biểu Kết đƣợc thể hình 3.19: kDa 200 150 100 085 70 60 50 72 40 30 20 10 Hình 3.19 Điện di protein tái tổ hợp Cry2A theo nhiệt độ gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 2, 3, 4, 5: Mẫu cảm ứng 25, 28, 30, 37oC Hình 3.19 cho thấy biểu 37oC tế bào cảm ứng tổng hợp protein tốt đó, lựa chọn nhiệt độ biểu 37oC tốt Nồng độ IPTG yếu tố quan trọng việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp Cry2A Do đó, sau lựa chọn nhiệt độ cảm ứng 37oC, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho trình lên men sinh tổng hợp Cry2A Kết nghiên cứu nồng độ cảm ứng IPTG 0,2; 0,5; 0,7; 1; mM thử nghiệm cho thấy tổng hợp protein Cry2A tối ƣu đƣợc cảm ứng 1mM (hình 3.20) 56 200 150 100 085 70 60 50 72 40 30 20 10 Hình 3.20 Điện di biểu protein tái tổ hợp Cry2A theo nồng độ IPTG Giếng 1-5: Thang protein chuẩn (Fermentas), mẫu cảm ứng, 0,2; 0,5; 0,7; 1mM Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới suất biểu protein tái tổ hợp Cry2A, lƣợng protein đƣợc tổng hợp thời điểm khác Nếu thu sớm protein chƣa đƣợc tổng hợp tối đa, thu muộn sinh chất ức chế phân hủy protein đƣợc tạo thành Chính vậy, cố định nhiệt độ cảm ứng 37oC, nồng độ IPTG cảm ứng mM khảo sát biểu protein tái tổ hợp theo thời gian (1, 2, 3, 4, giờ) Mẫu đƣợc xử lý điện di kiểm tra gel 12,6 % polyacrylamide Kết thể hình 3.21 kDa 200 150 100 085 70 60 50 40 72 30 20 10 Hình 3.21 Điện di protein rCry2A theo thời gian gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 2, 3, 4, 5, 6: Lần lƣợt mẫu đƣợc cảm ứng với IPTG lúc 1, 2,3,4,5 57 Hình 3.21 cho thấy lƣợng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian Lƣợng protein đƣợc tạo thành thời điểm tƣơng tự nhƣ thời điểm Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lƣợng protein tái tổ hợp giảm trình lên men tạo chất ức chế phân hủy Do đó, lựa chọn thời điểm để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lƣợng sản phẩm chi phí lên men 3.7 Tinh chế protein tái tổ hợp cột sắc kí lực Probond Nikel Resin Do protein tái tổ hợp có đuôi lực 6x histidine, sử dụng cột sắc kí lực, chất giá đƣợc dùng để nhồi cột Ni(+) 8ml dịch phá tế bào đƣợc ly tâm, phần dịch có chứa protein tái tổ hợp đƣợc đƣa lên cột Các protein có đuôi Histag có lực với Ni(+) đƣợc bám chặt chất giá cột Sau rửa cột đệm rửa protein E coli bị trôi khỏi cột protein có lực đƣợc giữ lại Sau protein có lực đƣợc đẩy khỏi cột nhờ đệm đẩy, thu đƣợc phân đoạn, phân đoạn ml Sau tinh chế protein đƣợc kiểm tra độ điện di gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22) kDa 72 kDa Hình 3.22 Điện di protein sau tinh gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy khỏi cột (7- 1) Giếng 8: Thang protein chuẩn (Fermentas) 58 Sau tinh hình 3.22 xuất băng tƣơng đƣơng với kích thƣớc protein tái tổ hợp trƣớc tinh (72 kDa) Nhƣ vậy, protein tái tổ hợp Cry2A đƣợc tinh thành công cột sắc ký lực Histag 59 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 45 chủng vi khuẩn Bt sƣu tập xác định đƣợc chủng có phản ứng dƣơng tính với typ huyết H3a,3b thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis serovar kurstaki chiếm 14,71% chủng dƣơng tính với typ huyết H14 thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis serovar israelensis chiếm 5,88% số chủng đƣợc phân loại Đã thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca dometisca chủng phân lập Kết thu đƣợc sau - ngày nồng độ 107 109 tỷ lệ chết đạt tƣơng đối cao Ở 107 46,67 - 109 63,33 60 - 76,67 - Đặc biệt, chủng LNT7.12 có tỷ lệ ấu trùng chết cao sau ngày 93,33% Bằng phƣơng pháp PCR phát đƣợc chủng MSS6.3; LD2.21; MSS4.2; LNT16.6; MSS1.1; MSS8.4; LNT7.12 mang gen cry2A với kích thƣớc đoạn gen 1902 bp Đã tách dòng giải trình tự gen chủng LNT7.12 MSS8.4 mã hóa protein cry2A diệt côn trùng cánh (ruồi nhà Musca dometisca) so sánh hủng MSS8.4 có độ tƣơng đồng Ngân hàng Gen Quốc tế Tr 99% so với trình tự công bố Ngân hàng Gen Quốc tế (Accession No AJ488143.1) Các vị trí sai khác nuleotide 60: C - T, vị trí nucleotide 1854: T C Trong đó, chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng công bố Đã thiết kế đƣợc hệ vector biểu pET22 –Cry2A chủng Bt MSS8.4 vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Xác định đƣợc thông số tối ƣu cho trình cảm ứng là: nồng độ IPTG 1mM, nhiệt độ 370C thời gian 60 Đã tinh đƣợc protein Cry2A tái tổ hợp cột sắc ký lực Probond Nikel Resin 4.2 Kiến nghị Protein cry2A protein có khả diệt ấu trùng ruồi nhà với tỷ lệ cao Mặt khác Việt Nam chƣa có chế phẩm sinh học diệt côn trùng ruồi nhà đƣợc nghiên cứu Vì nghị cần đƣợc nghiên cứu tiếp để tạo chế phẩm sinh học diệt côn trùng ruồi nhà phục vụ bảo vệ sức khỏe cộng đồng vệ sinh môi trƣờng 61 * TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Công Bình, Lê Xuân Thiện, Phạm Bá Nhạ, Lê Chiến Phƣơng, Ngô Đình Bính, Trần Thanh Lan Phƣơng, 1978 Hiệu lực diệt sâu chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất điều kiện phòng thí nghiệm Báo cáo nghiên cứu khoa học sinh vật 236-246 Nguyễn Công Bình, Phan Bá Nhạn, Ngô Đình Bính, 1982 Kết nghiên cứu phương pháp sản xuất chế phẩm vi khuẩn Bacillus thuringiensis diệt sâu Báo cáo nghiên cứu khoa học sinh vật học 246-253 , 2009 47, 5, 45 – 53 , 2010 1975 - 2010 288-300 Ngô Đình Bính 2005 Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 2000-2001 296-303 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Phạm Minh Hƣơng, Vi Thị Đoan Chính 1995 Nghiên cứu bảo quản lâu dài chủng giống vi sinh vật Kỷ yếu NXB Khoa học kĩ thuật, trang 378-383 62 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính 2004 Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghiệp miền núi, Thái Nguyên 2004 NXB KHKT 59-62 Trịnh Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Luy, Phạm Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Hiền, Ngô Đình Bính 2013 Sự phân bố gen cry, cyt hoạt tính diệt ấu trùng muỗi số chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ rừng ngập mặn Thái Bình Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học 2013, 71-75 10.Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh Di truyền, tập NXB Đại học Sƣ phạm Trang 49-53 11.Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB Khoa học Kỹ thuật Trang 137-140, 206-210 12 Đặng Văn Tiến, Nguyễn Thị , Trƣơng Phúc Hƣng, Ngô Đình Bính 2013 Tách dòng đọc trình tự gen vip3A mã hóa protein ngoại độc tố diệt côn trùng cánh vẩy lepidoptera Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học 2013, 225-229 */ TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 Abbott, W.S., 1925 A method of computing the effectiveness of an insecticide Journal of Economic Enthomology 18: 265-267 14.Barjac D H & Frachon E.1990 Classification of Bacillus thuringiensis strains Entomophaga 35, 233-240 15.Barjac D H 1981 Indentification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36-42 Burges H.D (edited) In microbial control of pests anđ plant Diseasis 1970- 1980 16.Bernhard, K., P Jarrett, M Meadows, J Butt, D J Ellis, G M Roberts, S Pauli, P Rodgers, and H D Burges 1997 Natural isolates 63 of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests J Invertebr Pathol 70:59-68 17 Binh Ngo Dinh, Thanh Le Thi Minh, Hoa Nguyen Thi, Chinh Tang Thi, Shin-Ichiro Asano and Hisanori Bando 2013 Screening, expression and characterization of scarabcidal protein a strain (MHB11.3) of Bacillus thuringiensis serovar galleriae in Vietnam African Journal of Microbiology Research, 7(24): 3018-3025 18 Ngo Dinh Binh, Nguyen Dinh Tuan, Trinh Thi Thu Ha, Vu Thi Nhung, Nguyen Thi Anh Nguyet, Pham Kieu Thuy, Le Thi Minh Thanh, Ohba Michio, Bando Hisannori, Hidetaka Horo, 2009 Sereening, evaluation and exploiting of insecticidal genes of Bacillus thuringensis of Vietnam Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa Proceedings of the 2nd Internation Meeting Ed by Ngo Dinh Binh, Hidetaka Hori, Keiichi Okazali, Nguyen Ngoc Chau Science and Technics Publishing House 2, 347- 353 19 Ngo Dinh Binh, Nguyen Quynh Chau, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Xuan Canh, Julien Herrou, Pham Minh Huong, Nguyen Dinh Tuan, Shin Ichiro Asanno, and Toshihiko Iizuka, 2005 Distribution of Bacillus thuringiensis in soil of Vietnam In Biotechnology of Bacillus thuringiensis Proceedings of the 5th Pacific Rim Conference Ed by Ngo Dinh Binh, Ray J Akhurst, Donald H Dean Science and Technics Publishing House 5, 4556 20 Ngo Dinh Binh, 2005 Research, Production and Appication of Bacillus thuringiensis in Vietnam In Biotechnology of Bacillus thuringiensis Proceedings of the 5th Pacific Rim Conference Ed by Ngo Dinh Binh, Ray J Akhurst, Donald H Dean Science and Technics Publishing House 5, 2129 64 21 Ngo Dinh Binh, Shinichio, Hisanori Bando, and Toshihiko Lizuka, 2002 Identification of cry1-type genes of Bacillus thuringiensis isolated from Vietnam Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its environmental impact Proceedings of the 4th Pacific Rim Conference 142-145 22 Ngo Dinh Binh, Nguyen Quynh Chau, Nguyen Van Thuong, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Xuan Canh, 2002 Technology Assessment of biopesticide production from Bacillus thuringiensis Workshop on Technology Assessment for R&D Institutions, S&T Policy Makers, Hanoi 2002 96-100 23.Bietlot, H P., J P Schernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R S Bhella, and H Kaplan 1993 Evidence that the CryIA crystal protein from Bacillus thuringiensis is associated with DNA J Biol Chem 268:82408245 24.Bravo, A 1997 Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis δendotoxin family proteins anh their functional domains J Bacteriol., 179, 2793-2801 25.Burges H D 2001 Bacillus thuringiensis in Pest Control Pesticide Outlook P 90- 98 26.Carlson, C R., and A.-B Kolstø 1993 A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 27.Chicott, C N., Wigley, P J 1993 Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting P 43-52 28.Crickmore N, Wheeler VC, Ellar DJ 1994 Use of an operon fusion to induce expression and crystallization of a Bacillus thuringiensis δendotoxin encoded by a cryptic gene Mol Gen Genet 242: 365-368 65 29.Crickmore, N., D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, and D H Dean 1998 Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev 62:807-813 30.Deacon, J The microbial world: Bacillus thuringiensis www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 31.Donovan WP, Dankocsik CC, Gilbert MP, Gawron- Burke MC, Groat RG, Carlton BC 1988 Amino acid sequence and entomocidal activity of the P2 crystal protein J Biol Chem 263: 561-567 32.Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, AND AI Aronson 1991 Sequensing of an operon containing a novel δ- endotoxin gene from Bacillus thuringiensis FEMS microbial Lett.81-31-36 33 Duong Pham Thuy, Trịnh Thị Thu Hà, Hoang Thi Lan, Dang Van Tien, Ngo Dinh Binh 2013 Genetic diversity and characterization of native Bacillus thuringiensis straing toxic to dipteran insects Proceedings of the 2nd VAST-KAST workshop on Biodiversity and Bio-active Compounds, Hanoi – Vietnam October 28th - 29th, 2013, 297 – 304 ISBN: 978-604-913-143-1 34.Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of bacillus thuringiensis toxin and genes In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P.F Entwistle, J.S Cory, M J bailey and S Higgs 1993, 37-60 35.Eugene W Nester, linda S Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002) 100 years of bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with wide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc Natl Acad Sci USA 93, 5389-5394 36.Faiza Saleem and Abdul Rauf Shakoori 2010 Characterization of cry2A-type Gene(s) from Pakistani Isolates of Bacillus thuringiensis Toxic 66 to Lepidopteran and Dipteran Insects Pakistan J Zool., vol 42(3), pp 181-193 37.Grochulski, P., L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler 1995 Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation J Mol Biol 254:447-464 38 Trinh Thị Thu Ha, Le Thi Hong Nhung, Pham Kieu Thuy, Ngo Dinh Binh, 2011 Cloning and sequencing analyse of genes encoding crystal proteins toxic to Dipteran larvae from Bacillus thuringiensis Proceeding of the 4th International conference for the Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa (20-22 January 2011).75 – 80 39.Kalman, S., K L Kiehne, N Cooper, M S Reynoso, and T Yamamoto 1995 Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes Appl Environ Microbiol 61:3063-3068 40 Koi Chi Yasutake, Ngo Dinh Binh, Kimuko Kagoshima, Akido Uemori, Akira Ohguski, Minoru Meada, Eiizuki, Yong Man Yu, and Michio Ohba, 2006 Occurrence of parasporin-producing Bacillus thuringiensis in Vietnam Can J Microbiol 52, 365-372 41 Koichi Yasutake, Akiko Uemori, Ngo Dinh Binh, Eiichi Mizuki, and Michio Ohba, 2007 Occurrence of Bacillus thuringiensis producing parasporin, Cancer Cell-killing cry Proteins, in Vietnam Proceedings of the 6th Pacific Rim Conference Science Publishing and Creative Service Agriculture and Agri-Food Canada 63c, 124 – 125 42.Kronstad, J W., and H R Whiteley 1986 Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes Gene 43:29-40 67 43.Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S 2003 The Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Ab δ-Endotoxin Appl Environ Microbiol 69: 4648-4657 44.Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S Shotkoski, F 2003 Vip3A: A novel Insceticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity 45.Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet 1983 Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM Mol Gen Genet.191:307-313 46.Li, J., J Carroll, and D J Ellar 1991 Crystal structure of insecticidal δendotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution Nature 353:815821 47.M-M Lecadet, E Frachon, V Cosmao Dumanoir, H Ripouteaus, S Hamon, P Laurent and I Thiery 1999 Updating the H- antigen classification of Bacillus thuringiensis The society for Applied Microbiology Journal of Applied Microbiology 660:672 48.Moar, W.J., Trumble,J.T., Hice, R.H and Backman, P.A 1994 Insecticidal activity of the CryIIA protein from NRD- 12 isolate of Bacillus thuringiensis subsp kurstaki expressed in Escherichia coli an Bacillus thuringiensis and in a leaf- colonizing strain of Bacillus cereus Applied and Environmental Microbiology 60, 896-902 49.Ohba, M., and Aizawa, K 1986 Distribution of Bacillus thuringiensis in soil of Japan J invertebr Pathol Vol.47, 12-20 50.Takashi Yamamoto and Gary K Powell 1993 Bacillus thuringiensis Crystal Proteins: Recent Advances in Understanding Its Insecticidal 68 Activity Advanced Engineered Pesticides Edited by Leo Kim Marcel Dekker, Inc., NY 3-42 51 Le Thi Minh Thanh, Tran Quoc Trong, Tran Duy Quy, Ngo Dinh Binh, 2011 Construction of Ti-plasmid vector containing cry8Da gene against Cleopteran insecticide from Bacillus thuringiensis strain isolated in Vietnam to transfer into plant Proceeding of the 4th International conference for the Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa (2022 January 2011) 87 – 91 52 Le Thi Minh Thanh, Tran Nguyen Thi Hue, Tran Duy Quy, Ngo Dinh Binh, 2012 Expression and purification of cry8Da recombinant protein against Coleopteran insects of Bacillus thuringiensis in E.coli Tạp chí Khoa học công nghệ, 50, 3, 309 – 317 53 Le Minh Thanh, Pham Kieu Thuy, Asano Shinichiro, Hori Hidetaka, Donald Dean, and Ngo Dinh Binh, 2009 Characterization of ry8da genes isolated from Bacillus thuringensi strais in Vietnam Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa Proceedings of the 3rd Internation Meeting Ed by Jamalam Lumbanraja, F.X Susilo, Purnomo, Rosma Hasibuan, Ainin Niswati, Sri Yusnaini, Hidetaka Hori, Keiichi Okazali Published by the University of Lampung Press 3, 186-192 54.Thiery and E Frachon 1997 Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bacteria Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology A academic press 55-57 55.Windner WR, Whiteley HR 1989 Effect of a 20-kilodalton protein from bacillus thuringiensis subsp israelensis on production of the CytA protein by Escherichia coli J Bacteriol 173: 1748-1756 56.Yamamoto T, McLaughlin RE 1981 Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var kurstaki toxic to the 69 mosquito larva, Aedes taeniorhynchus Biochem Biophys Res Commun 103: 414-421; 57.Yamamoto T 1983 Indentification of entomocidal toxin of Bacillus thuringiensis by high-performance liquid chromatography ACS Symp Ser 432:46-60; 2595-2603 58 http://en.wikipedia.org/wiki/Muscidae 70 [...]... hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà 3 Khuếch đại gen mã hóa protein độc tố diệt ấu trùng ruồi nhà sử dụng cặp mồi đặc hiệu 4 Tách dòng gen cry2A mã hóa tinh thể protein diệt ruồi nhà 5 Đọc trình tự gen cry2A và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen Quốc tế 6 Biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E .coli BL21 (DE3) 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng... protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica trong vi khuẩn Escherichia coli Mục tiêu của đề tài: 1 Sàng lọc đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt ruồi nhà (Musca domestica) 2 Tách dòng và đọc trình tự đƣợc Gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt ruồi nhà 3 Biểu hiện đƣợc protein Cry2 diệt ấu trùng ruồi Để đạt đƣợc các mục tiêu trên cần phải thực hiện. .. tựu trong nghiên , cứu, sản xuất Bt và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống Vi c nghiên cứu hoạt tính diệt ruồi nhà của các chủng Bt phân lập ở Vi t Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ruồi Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein. .. Wu và cộng sự (1991) Các gen cry2A và cry2C xuất hiện nhƣ vùng gen thứ ba của một operon ba gen (Orf1, Orf2 và cry2A) [56] Tuy nhiên sự hình thành protein Cry2A đòi hỏi phải có gen thứ hai (Orf2), trong khi hai Orf phía đầu của gen cry2C không có vai trò trong hình thành protein Cry2C [33] Mặt khác, gen cry2B là rất khó xác định Để có đƣợc biểu hiện mạnh hơn của một gen cry2B từ Bt kurstaki HD-1, Dankocsik... 9] 1.1.5.2.3 Độc tố Vip Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry đƣợc tạo ra ở một số chủng Bt trong pha sinh trƣởng sinh dƣỡng của tế bào, các protein này gọi chung là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) do gen vip mã hóa tổng hợp Các độc tố Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào [12] Độc tố Vip đƣợc phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996... ứng dụng Bt ở Vi t Nam Vi t Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bt và phải kể đến một chặng đƣờng dài mà các nhà khoa học của Vi t Nam nghiên cứu về thuốc trừ sâu sinh học 4 Bt Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bt các nhà khoa học Vi t Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đƣa những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt... điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các loài phụ Bt khác nhau Một số nghiên cứu mối tƣơng quan về sự có mặt của plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng Các phƣơng pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã... sự Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa đƣợc tổng hợp trong suốt pha sinh dƣỡng nhƣng nó không đƣợc tiết ra ngoài Gen mã hóa protein Vip3A xuất hiện trong cả các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus Protein này có hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy nhƣ: Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea Khi côn trùng mẫn cảm ăn phải độc tố, Vip3A... sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis subsp isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự Từ đó một lƣợng lớn gen đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính của chúng Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus... phân ruồi, trong khi ăn ruồi còn luôn luôn thải phân ra ngoài môi trƣờng Vi khuẩn ở nơi bẩn thỉu theo đƣờng tiêu hóa của ruồi, sinh sôi nảy nở rồi theo phân ruồi bám lên thức ăn, vật dụng, vết thƣơng hay khóe miệng ngƣời… Vì thế mà mầm bệnh, vi khuẩn ở xa hàng cây số vẫn đƣợc ruồi mang đến lây truyền 1.3.4 Một số phƣơng pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay Hiện nay có nhiều phƣơng pháp diệt ruồi ... tính diệt ấu trùng ruồi nhà Khuếch đại gen mã hóa protein độc tố diệt ấu trùng ruồi nhà sử dụng cặp mồi đặc hiệu Tách dòng gen cry2A mã hóa tinh thể protein diệt ruồi nhà Đọc trình tự gen cry2A... phẩm sinh học diệt ruồi Xuất phát từ thực tiễn tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica vi khuẩn Escherichia coli Mục tiêu... Insecticidal Protein) gen vip mã hóa tổng hợp Các độc tố Vip protein tinh thể mà protein tiết từ tế bào [12] Độc tố Vip đƣợc phát Vip3A1 Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch cộng Gen vip3A mã hóa protein