Biểu hiện gen Xbxs14 mã hóa xylan 1,4 β-xylosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi trong tế bào Escherichia coli rosetta (DE3)

Khung đọc mở GL0112518 gồm 1077 nucleotide (còn gọi là Xbxs14) mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase kiềm đã được khai thác từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi sinh trong ruột mối. Gen được tổng hợp nhân tạo và gắn vào vector pET22b(+) để tiến hành biểu hiện enzyme dạng tái tổ hợp cho đánh giá tính chất enzyme.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 555-561, 2017 BIỂU HIỆN GEN XBXS14 MÃ HÓA XYLAN 1,4-Β-XYLOSIDASE CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI COPTOTERMES GESTROI TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI ROSETTA (DE3) Nguyễn Minh Thu1, *, Nguyễn Minh Giang2, *, Phạm Hải Như3, Đinh Nho Thái3, Đỗ Thị Huyền1, Trương Nam Hải1, * Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: tnhai@ibt.ac.vn * Cả hai tác giả có đóng góp ngang thảo Ngày nhận bài: 19.6.2017 Ngày nhận đăng: 20.9.2017 TÓM TẮT Khung đọc mở GL0112518 gồm 1077 nucleotide (còn gọi Xbxs14) mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase kiềm khai thác từ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh ruột mối Gen tổng hợp nhân tạo gắn vào vector pET22b(+) để tiến hành biểu enzyme dạng tái tổ hợp cho đánh giá tính chất enzyme Kết cho thấy gen biểu tốt ba chủng E coli BL21, Rosetta (DE3) JM109 (DE3), hai chủng E coli BL21, Rosetta (DE3) thu sinh khối lớn hầu hết enzyme nằm pha không tan Bằng cách thay đổi điều kiện biểu bao gồm nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ nuôi cấy biểu gen thời gian thu mẫu, phần nhỏ enzyme biểu dạng tan Điều kiện thích hợp cho việc biểu Xbxs14 chủng E coli Rosetta (DE3) nuôi cấy lắc môi trường LB, cảm ứng IPTG 0,05 mM, nhiệt độ 20oC ngày Enzyme tái tổ hợp biểu pha tan (soluble fraction) có hoạt tính xylosidase, phân cắt liên kết β(1→4) glycoside chất pNPX tạo màu vàng đặc trưng nitrophenyl Trong lít mơi trường ni cấy thu 3,15 U enzyme Từ khóa: DNA metagenome, biểu gen, Coptotermes gestroi, Escherichia coli,xbxs14 MỞ ĐẦU Sinh khối thực vật nguồn nguyên liệu tái tạo tiềm sử dụng nhiều lĩnh vực khác Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, nguồn sinh khối ngày tận dụng có hiệu để chuyển hóa thành sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn sống tái chế rác thải thành lượng sinh học, chế biến thức ăn chăn ni, sản xuất giấy, sợi, hóa chất,… (Howard đồng tác giả, 2003) Việc sử dụng hữu hiệu sinh khối thực vật phụ thuộc chủ yếu vào khả chuyển hóa hiệu nguồn chất lignocellulose chúng thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao Một cơng đoạn quan trọng q trình chuyển hóa thủy phân lignocellulose enzyme Vì vậy, năm gần đây, nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm enzyme có hoạt tính mong muốn theo ba hướng chính: (1) Sàng lọc phân lập gen từ chủng tự nhiên; (2) Tìm kiếm phát gen từ quần thể vi sinh vật kỹ thuật Metagenomics Hướng cho phép khai thác gen quý từ vi sinh vật không nuôi cấy vốn chiếm 99,0-99,9% vi sinh vật có mơi trường sinh thái (Riesenfeld đồng tác giả, 2004); (3) Gây đột biến định hướng số gen mã hóa enzyme nghiên cứu để làm tăng hoạt tính enzyme Trong đó, hướng sử dụng kỹ thuật Metagenomics để giải tồn trình tự DNA metagenome hệ vi sinh vật hệ sinh thái mini quan tâm Xylan 1,4-βxylosidase enzyme thuộc nhóm hemicellulase tham gia chuyển hóa sinh khối thực vật với nhóm cellulase khác Đây coi enzyme quan trọng phá vỡ liên kết glycoside hemicellulose (Jordan Wagschal, 2010) Enzyme có khả cắt (1,4)-β-D- xylan từ đầu khơng khử để giải phóng gốc đường D-xylose (Biely, 555 Nguyễn Minh Thu et al 1985) Xylan 1,4-β-xylosidase có mặt động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm Tuy nhiên, vi sinh vật cung cấp lượng lớn xylan 1,4-β-xylosidase đáp ứng cho sản xuất, đem lại giá trị thương mại cao (Howard đồng tác giả, 1960, Mattéotti đồng tác giả, 2011) Do đó, xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc vi sinh vật đối tượng nghiên cứu ứng dụng nhiều sản xuất Trong nghiên cứu trước (Do đồng tác giả, 2014), sử dụng kỹ thuật Metagenomics để phân tích tồn DNA metagenome vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Trong số 125431 ORF thu được, phần mềm tin sinh học ước đốn 41 ORF mã hóa cho enzyme xylan 1,4-β-xylosidase Để khai thác trình tự gen hiệu từ liệu metagenome, tiến hành xây dựng mẫu dò (probe) cho nhóm enzyme xylan 1,4-βxylosidase, họ GHF43 với độ dài 507 amino acid Probe giúp tìm kiếm lựa chọn trình tự gen mang mã số GL0112518 mã hóa cho xylan 1,4-β-xylosidase (Xbxs14) từ liệu metagenome (Nguyễn Minh Giang đồng tác giả, 2017) Enzyme dự đốn hoạt động tốt mơi trường kiềm (Nguyễn Minh Giang đồng tác giả, 2016) Dựa trình tự nucleotid biết, gen xbxs14 đặt tổng hợp chuyển vào vector pET22b(+) vị trí enzyme giới hạn NcoI, XhoI (được gọi pET22-xbxs14) Trong nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu biểu gen xbxs14 E coli với mục đích thu enzyme tinh để đánh giá hoạt tính sinh học pháp sốc nhiệt (Sambrook, Russell, 2001) Sau chọn khuẩn lạc rời từ đĩa biến nạp chuyển vào môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối 100 µg/ml (mơi trường LBA), lắc 200 vòng/phút 37oC qua đêm Dịch ni cấy chuyển sang môi trường LBA để đạt OD600 ban đầu 0,1 sau ni tiếp khoảng 37oC OD600 đạt 0,6 – 0,7 tiến hành bổ sung thêm IPTG để cảm ứng sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp Nồng độ IPTG khảo sát khoảng từ đến mM Mẫu nuôi cấy tiếp điều kiện lắc 200 vòng/phút nhiệt độ khác để lựa chọn nhiệt độ thích hợp Dịch tế bào ly tâm 5000 vòng/phút, phút để loại bỏ dịch Tủa tế bào hòa lại đệm PBS (8 g NaCl; g KCl; 0,24 g KH2PO4; 1,42 g Na2HPO4 bổ sung nước lít) cho OD600=10 Tế bào giữ -80oC đến phân tích Protein tế bào kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% Phương pháp thu protein tan không tan Để đánh giá protein tái tổ hợp biểu pha tan hay không tan, tế bào từ -80oC làm tan nhanh nước ấm (40-50oC) sau phá vỡ siêu âm với chu kỳ 10 giây siêu âm 20 giây nghỉ tổng khoảng 30 đến 40 xung tần số 20 khz Dịch siêu âm ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút để tách protein pha tan pha không tan Pha tan phần dịch thu lại, phần cặn pha khơng tan hòa trở lại PBS với thể tích thể tích phần dịch vừa hút để điện di kiểm tra VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase Vật liệu Sử dụng chất pNPX để thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase theo bước: Hỗn hợp phản ứng 180 µl gồm có mM pNPX hòa 50 mM đệm phốt phát (pH 6,0) ủ với protein pha tan có chứa enzyme Xbs14 37oC (tổng thể tích hỗn hợp 250 µl) Mẫu đối chứng (ĐC1) có thành phần tương tự enzyme ủ riêng rẽ trộn với chất trước dừng phản ứng Mẫu đối chứng (ĐC2) có thành phần tương tự dịch protein dịch thu từ chủng E coli Rosetta (DE3) mang pET22b(+) không mang gen Xbxs14 Phản ứng dừng lại bổ sung 750 µl Na2CO3 M đo mẫu bước sóng 405 nm Kết phản ứng enzyme với chất tạo màu vàng dung dịch Sự đổi màu từ trắng sang vàng dung dịch hoạt động xylan 1,4-βxylosidase Khi enzyme cắt liên kết β(1→4) Chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3), Rosetta (DE3), Soluble BL21 (DE3) JM109 (DE3) sử dụng thí nghiệm biểu gen; vector pET22b(+) mang gen xbxs14 dùng làm vector biểu Cơ chất p-nitropheny-β-xylopyranoside (pNPX) (Sigma) gồm phân tử β-D-xylanpyranose liên kết với nitrophenyl liên kết β(1→4) glycoside để thử hoạt tính xylan 1,4-βxylosidase Phương pháp nghiên cứu Biểu gen Xbxs14 Vector pET22-Xbxs14 biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3), Rosetta (DE3), Soluble BL21 (DE3) JM109 (DE3) phương 556 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 555-561, 2017 glycoside pNPX, nitrophenyl giải phóng mơi trường, tạo màu vàng đặc trưng nitrophenyl Lượng enzyme phản ứng tính tốn dựa vào đường chuẩn pNP Đường chuẩn thiết lập với thang 11 nồng độ pNP từ mM đến mM pNP pha PBS 1x, pH6 Mỗi ống phản ứng tích 200 µl lặp lại lần Kết đường chuẩn tuân theo hàm y = 4,4454x + 0,0068 với R2 = 0,9937 Trong đó, y giá trị OD bước sóng 405 nm, x hàm lượng pNP (µmol) Một đơn vị hoạt tính β-xylosidase (U) lượng enzyme cần thiết để giải phóng µmol p-nitrophenol phút (Dashtban et al., 2010) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biểu gen Xbxs14 Gen vector pET22b(+) nhận từ hãng Genscript giải trình tự để kiểm tra Kết quả, trình tự gen 100% so với trình tự đặt tổng hợp Plasmid biến nạp vào chủng biểu để biểu gen Kết cho thấy mẫu protein thu sau nuôi cấy cảm ứng chủng E coli Rosetta, JM109 BL21 mang Xbxs14 xuất băng protein kích thước khoảng 40 kDa khác với mẫu không cảm ứng có kích thước với kích thước xylan 1,4-β-xylosidase biểu Kết nhận cho thấy chủng E coli kể có khả biểu gen Xbxs14 Các mẫu cảm ứng không cảm ứng IPTG chủng E coli Soluble cho lượng protein Do đó, chủng khơng tổng hợp XBXS14 enzyme sau tổng hợp bị protease nội bào cắt bỏ (Hình 1) Tại thời điểm thu mẫu, chủng E coli Rosetta BL21 cho lượng sinh khối lớn (OD600 tương ứng 2,1 3,2) so với chủng JM109 (OD600 tương ứng 0,8) lượng protein tái tổ hợp thu lớn Từ kết lựa chọn mẫu biểu chủng E coli Rosetta BL21 để kiểm tra xem enzyme tái tổ hợp tổng hợp pha tan hay pha tủa tế bào Kết điện di cho thấy 100% enzyme tổng hợp chủng BL21 dạng không tan, khoảng 1/4 lượng enzyme tổng hợp chủng Rosetta dạng tan (Hình 2) Vì vậy, lựa chọn chủng Rosetta để nghiên cứu lựa chọn điều kiện cho biểu enzyme tái tổ hợp Hình 1.Phân tích sản phẩm biểu gen Xbxs14 bốn chủng biểu gel polyacrylamide 12,6% M: Protein chuẩn (Fermentas); 1-, 2-, 3- : Dòng khơng cảm ứng IPTG (đối chứng); 1+, 2+, 3+: Dòng cảm ứng 1mM IPTG Lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho biểu gen Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới tốc độ sinh trưởng chủng nên gián tiếp ảnh hưởng tới tốc độ sinh tổng hợp protein, cuộn xoắn protein thành cấu trúc có hoạt tính sinh học Vì vậy, thí nghiệm chúng tơi tiến hành kiểm tra khả sinh tổng hợp enzyme XBXS14 điều kiện 16, 20, 28, 37oC Kết lượng enzyme protein tổng số thu nhiệt độ nuôi cấy gần tương đương Tuy nhiên, enzyme tổng hợp pha tan nuôi chủng 16oC 20oC (Hình 3) Lượng protein tan tổng hợp 16oC 20oC nhau, nhiên việc kiểm sốt nhiệt độ ni cấy ni cấy nhiệt độ thấp khó khăn 20oC nhiệt độ thích hợp lựa chọn cho thí nghiệm biểu xylan 1,4-β-xylosidase 557 Nguyễn Minh Thu et al Hình 2.Phân tích sản phẩm kiểm tra khả tan xylan 1,4-β-xylosidase E coli BL21 E coli Rosetta gel polyacrylamide 12,6% M: Protein chuẩn (Fermentas); (-): Dòng khơng cảm ứng IPTG; TS: Protein tổng số; Tan: Protein pha tan; Tủa: Protein pha tủa Hình Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu (A) điện di đồ kiểm tra biểu gen Xbxs14 tế bào E coli Rosetta nhiệt độ khác M: Thang protein chuẩn (Fermentas); (-): Dòng chứa pET22b(+); TS: Protein tổng số; Tan: Protein tan; Tủa: Protein tủa Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG IPTG chất cảm ứng khởi động promoter T7 vector pET22Xbxs14 phiên mã sinh tổng hợp gen Xbxs14 Mười ba nồng độ IPTG khác tiến hành khảo sát là: mM; 0,05 mM; 0,2 mM; 0,5 558 mM; 0,8 mM; mM; 1,2 mM; 1,4 mM; 1,6 mM; 1,8 mM; mM; 2,5 mM mM Chủng E coli Rosetta tái tổ hợp nuôi cấy điều kiện 20oC, lắc 200 vòng/phút Sau ngày ni cấy, phần dịch ni cấy giữ lại để kiểm tra protein tổng số điện di gel polyacrylamide 12,6% để Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 555-561, 2017 kiểm tra sinh khối đạt mức độ biểu xylan 1,4-β-xylosidase Biểu đồ sinh trưởng dòng tế bào nuôi cấy với nồng độ IPTG khác cho thấy, sau cảm ứng IPTG sinh khối tế bào bị sụt giảm nghiêm trọng Ngay với nồng độ IPTG thấp, 0,05 mM, sinh khối tế bào giảm gần nửa so với không cảm ứng (Hình 4A) Điều chứng tỏ biểu gen làm ảnh hưởng tới trình trao đổi chất chủng chủ Tuy nhiên, tăng nồng độ chất cảm ứng sinh khối tế bào khơng thay đổi nhiều, đồng thời khả sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp trì tương tự cảm ứng với mức IPTG thấp Kết gợi ý việc tổng hợp enzyme XBXS14 ảnh hưởng tiêu cực tới trình trao đổi chất tế bào dẫn đến khả sinh trưởng tế bào giảm hẳn Enzyme tái tổ hợp XBXS14 biểu tất nồng độ IPTG Do nồng độ IPTG 0,05 mM sử dụng để cảm ứng sinh tổng hợp xylan 1,4-βxylosidase Hình Điện di đồ kiểm tra biểu gen Xbxs14 tế bào E coli Rosetta, cảm ứng nồng độ IPTG khác M: Protein chuẩn (Fermentas); – 3: Nồng độ IPTG Hình Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu dòng biểu thời gian thu mẫu khác (A) điện di đồ kiểm tra biểu gen Xbxs14 theo thời gian thu mẫu (B) tế bào E coli Rosetta (DE3) gel polyacrylamide 12,6% M: Protein chuẩn (Fermentas); (-): Dòng chứa pET22 b(+); TS: Protein tổng số, Tan: Protein pha tan; Tủa: Protein pha tủa Khảo sát thời gian thu mẫu Thời gian cảm ứng có liên quan chặt chẽ đến hàm lượng chất lượng protein tái tổ hợp biểu Thông thường, thời gian dài, hàm lượng protein tái tổ hợp tổng hợp nhiều Tuy nhiên thời gian dài chất dinh dưỡng mơi trường bị cạn kiệt, q trình tổng hợp protein bị hạn chế protein tái tổ hợp bị cắt protease nội bào Tiến hành khảo sát thời điểm thu mẫu khác là: 12h, 18h, 36h, 48h, với nồng độ IPTG mM, 20oC Dịch protein tổng số thu kiểm tra gel polyacrylamide Kết điện di (Hình 5B) cho thấy xylan 1,4-β-xylosidase biểu khoảng 12-48h nuôi cấy 20oC, với nồng độ chất cảm ứng 559 Nguyễn Minh Thu et al IPTG 0,05 mM Băng protein xylan 1,4-β-xylosidase thời điểm thu mẫu khác Tuy nhiên sinh khối thu (đánh giá dựa giá trị OD600 thu mẫu) 48 lớn nhất, đồng nghĩa với việc hàm lượng protein tái tổ hợp thu lớn (Hình 5A) Do đó, chúng tơi định chọn 48 thời gian thu mẫu thích hợp Như vậy, gen Xbxs14 biểu điều kiện khác lượng enzyme thu thấp Điều chủng chủ biểu chưa phù hợp gen Tuy nhiên việc đánh giá hoạt tính enzyme cần thiết để khẳng định biểu thấp enzyme biểu có hoạt tính sinh học dự đốn Kiểm tra hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase Để kiểm tra hoạt tính enzyme, chất pNPX sử dụng Kết thử hoạt tính cho thấy, mẫu xylan 1,4-β-xylosidase ủ với chất pNPX 37oC giờ, chuyển sang màu vàng đặc trưng dung dịch chứa nitrophenyl Kết xác định hoạt tính cho thấy lít mơi trường ni cấy, lượng enzyme tổng hợp pha tan đạt 3,15 U enzyme xylan 1,4-β-xylosidase Trong mẫu đối chứng (ĐC1) có thành phần (cơ chất pNPX, đệm, xylan 1,4-β-xylosidase) ủ riêng rẽ 37oC tương tự mẫu kiểm tra hoạt tính trộn vào với trước ngừng phản ứng enzyme giữ nguyên màu trắng Kết tương tự ghi nhận mẫu đối chứng (ĐC2), mẫu thực với điều kiện giống mẫu Xbxs14, enzyme xylan 1,4-β-xylosidase thay protein thu từ dòng mang pET22b (đối chứng) (Hình 6) Hình Thử hoạt tính xylan 1,4-β-xylosidase biểu pha tan từ chủng E coli tái tổ hợp 1: Đối chứng 1, enzyme chất ủ riêng rẽ trộn vào bổ sung Na2CO3 để ngừng phản ứng; : Ống chứa enzyme xylan 1,4-β-xylosidase ủ chung chất; 3: Đối chứng 2, ủ chất với protein thu từ dòng mang pET22b(+) không mang Xbxs14 KẾT LUẬN Gen Xbxs14 mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn ruột mối biểu E coli Enzym xylan 1,4-β-xylosidase tái tổ hợp dạng tan có hoạt tính sinh học chất pNPX Lời cảm ơn: Cơng trình thực nguồn kinh phí Đề tài độc lập “Nghiên cứu metagenome số hệ sinh thái mini tiềm nhằm khai thác gen mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu lignocelluloses“, mã số 560 ĐTĐLCN.15/14 trang thiết bị Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen TÀI LIỆU THAM KHẢO Biely P (1985) Microbial xylanolytic systems Trends Biotechnol3: 286–290 Dashtban M, Maki M, Leung KT, Mao C, Qin W (2010) Cellulase activities in biomass conversion: measurement methods and comparison Crit Rev Biotechnol30: 302–309 Do TH, Nguyen TT, Nguyen TN, Le QG, Nguyen C, Kimura K, Truong NH (2014) Mining biomass-degrading Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 555-561, 2017 genes through Illumina-based de novo sequencing and metagenomic analysis of free-living bacteria in the gut of the lower termite Coptotermes gestroi harvested in Vietnam J Biosci Bioeng118: 665–671 Howard BH, Jones G, Purdom MR (1960) The pentosanases of some rumen bacteria Biochem J74: 173–180 Howard RL, Abotsi E, Rensburg ELJ, Van, Howard S (2003) Review - Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production African J Biotechnol2(12): 602-619 Jordan DB, Wagschal K (2010) Properties and applications of microbial beta-D-xylosidases featuring the catalytically efficient enzyme from Selenomonas ruminantium Appl Microbiol Biotechnol86: 1647–1658 Mattéotti C, Haubruge E, Thonart P, Francis F, De Pauw E, Portetelle D, Vandenbol M (2011) Characterization of a new β-glucosidase/β-xylosidase from the gut microbiota of the termite (Reticulitermes santonensis) FEMS Microbiol Lett314: 147–157 Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2016) Sử dụng số cơng cụ tinh sinh khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học14: 39–47 Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2017) Xây dựng probe để khai thác chọn gen mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ liệu giải trình tự metagenome Tạp chí Công nghệ Sinh học.Chấp nhận đăng Riesenfeld CS, Schloss PD, Handelsman J (2004) Metagenomics: genomic analysis of microbial communities Annu Rev Genet38: 525–552 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHL Press) EXPRESSION OF XBSX14 CODING XYLAN 1,4-Β-XYLOSIDASE DERIVED FROM BACTERIA IN COPTOTERMES GESTROI TERMITE GUTIN ESCHERICHIA COLI ROSETTA (DE3) Nguyen Minh Thu1, Nguyen Minh Giang2, Pham Hai Nhu3, Dinh Nho Thai3, Do Thi Huyen1, Truong Nam Hai1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Techology Ho Chi Minh University of Pedagogy Science of University, Vietnam National University, Hanoi SUMMARY A gene GL0112518 consisting of 1077 nucleotides (also called Xbxs14) encodes alkaline xylan 1,4-βxylosidase was determined from DNA metagenome data of bacteria in Coptotermes gestroi termite gut The gene was artificially synthesized and ligated into pET22b(+) vector for expression of recombinant enzyme with purpose of enzyme characterization As a result, the gene was expressed in three strains of E coli BL21, Rosetta (DE3) and JM109 (DE3), of which two strains of E coli BL21, Rosetta (DE3) grew better to obtain greater biomass Most recombinant protein was expressed as inclusion body After modification of expression conditions including the IPTG concentration, the temperature of culture to express gene and the duration of cultivation, small amount of the recombinant enzyme was expressed in soluble form The appropriate conditions for the expression of Xbxs14 in Rosetta E coli strains (DE3) were shaking culture in LBA medium with IPTG concentrations of 0.05 mM, temperature of 20oC and sampling after days The recombinant enzyme expressed in the soluble fraction exhibited activity of the enzyme xylan β-1,4-xylosidase, cleavage β (1 → 4) glycoside in the substrate p-nitropheny-β-xylopyranosit (pNPX) to nitrophenyl Xylan β-1,4-xylosidase activity in liter of culture was 3.15 U Keywords: DNA metagenome, Coptotermes gestroi, Escherichia coli, Expression,xbxs14 561 ... enzyme xylan 1,4- β-xylosidase ủ chung chất; 3: Đối chứng 2, ủ chất với protein thu từ dòng mang pET22b(+) khơng mang Xbxs14 KẾT LUẬN Gen Xbxs14 mã hóa xylan 1,4- β-xylosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn. .. thử hoạt tính xylan 1,4- βxylosidase Phương pháp nghiên cứu Biểu gen Xbxs14 Vector pET22 -Xbxs14 biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3), Rosetta (DE3), Soluble BL21 (DE3) JM109 (DE3) phương... metagenome vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Trong số 125431 ORF thu được, phần mềm tin sinh học ước đốn 41 ORF mã hóa cho enzyme xylan 1,4- β-xylosidase Để khai thác trình tự gen hiệu từ