2.
3.7.Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin
Do protein tái tổ hợp có đuôi ái lực 6x histidine, vì vậy sử dụng cột sắc kí ái lực, chất giá đƣợc dùng để nhồi cột là Ni(+). 8ml dịch phá tế bào đƣợc ly tâm, phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp đƣợc đƣa lên cột. Các protein có đuôi Histag có ái lực với Ni(+) và đƣợc bám chặt chất giá trên cột. Sau khi rửa cột bằng đệm rửa các protein của E. coli sẽ bị trôi khỏi cột chỉ còn các protein có ái lực đƣợc giữ lại. Sau đó protein có ái lực đƣợc đẩy ra khỏi cột nhờ đệm đẩy, chúng tôi thu đƣợc 7 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Sau khi tinh chế protein đƣợc kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22).
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide
Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột (7- 1)
Giếng 8: Thang protein chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 6 7 8
72 kDa kDa
Sau khi tinh sạch trên hình 3.22 chỉ xuất hiện một băng tƣơng đƣơng với kích thƣớc của protein tái tổ hợp trƣớc khi tinh sạch (72 kDa). Nhƣ vậy, protein tái tổ hợp Cry2A đã đƣợc tinh sạch thành công bằng cột sắc ký ái lực Histag.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
1. Từ 45 chủng vi khuẩn Bt trong bộ sƣu tập đã xác định đƣợc 5 chủng có phản ứng dƣơng tính với typ huyết thanh H3a,3b thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis
serovar kurstaki chiếm 14,71% và 2 chủng dƣơng tính với typ huyết thanh H14 thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis serovar israelensis chiếm 5,88% số chủng
đƣợc phân loại.
2. Đã thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca dometisca của các chủng phân lập. Kết quả thu đƣợc sau 3 - 5 ngày ở nồng độ 107 và 109 tỷlệ chết đạt
tƣơng đối cao. Ở 107
46,67 - 63,33 - 109
60 -
76,67 - . Đặc biệt, chủng LNT7.12 có tỷ lệ ấu trùng chết cao nhất sau 3 ngày là 93,33%.
3. Bằng phƣơng pháp PCR đã phát hiện đƣợc 7 chủng MSS6.3; LD2.21; MSS4.2; LNT16.6; MSS1.1; MSS8.4; LNT7.12 mang gen cry2A với kích thƣớc
đoạn gen 1902 bp.
4. Đã tách dòng và giải trình tự gen của 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4 mã hóa protein cry2A diệt côn trùng bộ 2 cánh (ruồi nhà Musca dometisca) so sánh trên
Ngân hàng Gen Quốc tế. Tr hủng MSS8.4 có độ tƣơng đồng
99% so với trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế (Accession No AJ488143.1). Các vị trí sai khác là nuleotide 60: C - T, vị trí nucleotide 1854: T - C. Trong khi đó, chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng công bố.
5. Đã thiết kế đƣợc hệ vector biểu hiện pET22 –Cry2A của chủng Bt MSS8.4 trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Xác định đƣợc các thông số tối ƣu cho quá
6. Đã tinh sạch đƣợc protein Cry2A tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin.
4.2. Kiến nghị
Protein cry2A là protein có khả năng diệt ấu trùng ruồi nhà với tỷ lệ rất cao. Mặt khác ở Việt Nam hiện nay chƣa có một chế phẩm sinh học diệt côn trùng ruồi nhà nào đƣợc nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi nghị cần đƣợc nghiên cứu tiếp để tạo ra những chế phẩm sinh học diệt côn trùng ruồi nhà phục vụ trong bảo vệ sức khỏe cộng đồng và vệ sinh môi trƣờng.
* TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Công Bình, Lê Xuân Thiện, Phạm Bá Nhạ, Lê Chiến Phƣơng, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngô Đình Bính, Trần Thanh Lan Phƣơng, 1978. Hiệu lực diệt sâu của chế
phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm. Báo
cáo nghiên cứu khoa học sinh vật. 236-246.
2. Nguyễn Công Bình, Phan Bá Nhạn, Ngô Đình Bính, 1982. Kết quả nghiên
cứu phương pháp sản xuất chế phẩm vi khuẩn Bacillus thuringiensis diệt sâu. Báo cáo nghiên cứu khoa học sinh vật học. 246-253.
3. , 2009. . . 47, 5, 45 – 53. 4. , 2010. 1975 - 2010. . 288-300.
5. Ngô Đình Bính. 2005. Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học
6. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt. 2002. Thu
nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis. Kỷ yếu
Viện Công nghệ Sinh học. 2000-2001. 296-303.
7. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Phạm
Minh Hƣơng, Vi Thị Đoan Chính. 1995. Nghiên cứu bảo quản lâu dài
8. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh,
Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính. 2004. Nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghiệp miền núi, Thái Nguyên 2004. NXB KHKT. 59-62
9. Trịnh Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Luy, Phạm Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Hiền, Ngô Đình Bính 2013. Sự phân bố gen cry, cyt và hoạt tính diệt ấu
trùng muỗi của một số chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ rừng ngập
mặn Thái Bình. Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học 2013, 71-75.
10.Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. Di truyền, tập 1.
NXB Đại học Sƣ phạm. Trang 49-53
11.Khuất Hữu Thanh. 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Trang 137-140, 206-210.
12.Đặng Văn Tiến, Nguyễn Thị , Trƣơng Phúc
Hƣng, Ngô Đình Bính 2013. Tách dòng và đọc trình tự gen vip3A mã hóa protein ngoại độc tố diệt côn trùng bộ cánh vẩy lepidoptera. Kỷ yếu Hội
nghị Công nghệ sinh học 2013, 225-229. */ TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13.Abbott, W.S., 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Enthomology 18: 265-267.
14.Barjac D H & Frachon E.1990. Classification of Bacillus thuringiensis strains. Entomophaga 35, 233-240.
15.Barjac D H. 1981. Indentification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis. 36-42 Burges H.D. (edited). In microbial control of pests anđ plant Diseasis 1970- 1980.
of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests. J. Invertebr. Pathol. 70:59-68
17.Binh Ngo Dinh, Thanh Le Thi Minh, Hoa Nguyen Thi, Chinh Tang Thi, Shin-Ichiro Asano and Hisanori Bando 2013. Screening, expression and characterization of scarabcidal protein a strain (MHB11.3) of Bacillus thuringiensis serovar galleriae in Vietnam. African Journal of Microbiology (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Research, 7(24): 3018-3025.
18.Ngo Dinh Binh, Nguyen Dinh Tuan, Trinh Thi Thu Ha, Vu Thi Nhung,
Nguyen Thi Anh Nguyet, Pham Kieu Thuy, Le Thi Minh Thanh, Ohba Michio, Bando Hisannori, Hidetaka Horo, 2009. Sereening, evaluation and exploiting of insecticidal genes of Bacillus thuringensis of Vietnam.
Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa. Proceedings of the 2nd Internation Meeting. Ed. by Ngo Dinh Binh, Hidetaka Hori, Keiichi Okazali, Nguyen Ngoc Chau. Science and Technics Publishing House. 2, 347- 353.
19.Ngo Dinh Binh, Nguyen Quynh Chau, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Xuan Canh, Julien Herrou, Pham Minh Huong, Nguyen Dinh Tuan, Shin Ichiro Asanno, and Toshihiko Iizuka, 2005. Distribution of Bacillus thuringiensis in soil of Vietnam. In Biotechnology of Bacillus thuringiensis.
Proceedings of the 5th Pacific Rim Conference. Ed. by Ngo Dinh Binh, Ray J. Akhurst, Donald H. Dean. Science and Technics Publishing House. 5, 45- 56.
20.Ngo Dinh Binh, 2005. Research, Production and Appication of Bacillus thuringiensis in Vietnam. In Biotechnology of Bacillus thuringiensis.
Proceedings of the 5th Pacific Rim Conference. Ed. by Ngo Dinh Binh, Ray J. Akhurst, Donald H. Dean. Science and Technics Publishing House. 5, 21- 29.
21.Ngo Dinh Binh, Shinichio, Hisanori Bando, and Toshihiko Lizuka, 2002.
Identification of cry1-type genes of Bacillus thuringiensis isolated from Vietnam. Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its environmental impact. Proceedings of the 4th Pacific Rim Conference. 142-145.
22.Ngo Dinh Binh, Nguyen Quynh Chau, Nguyen Van Thuong, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Xuan Canh, 2002. Technology Assessment of biopesticide production from Bacillus thuringiensis. Workshop on Technology Assessment for R&D Institutions, S&T Policy Makers, Hanoi
2002. 96-100.
23.Bietlot, H. P., J. P. Schernthaner, R. E. Milne, F. R. Clairmont, R. S. Bhella, and H. Kaplan. 1993. Evidence that the CryIA crystal protein from
Bacillus thuringiensis is associated with DNA. J. Biol. Chem. 268:8240-
8245.
24.Bravo, A. 1997. Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis δ- endotoxin family proteins anh their functional domains. J Bacteriol., 179,
2793-2801.
25.Burges H. D. 2001. Bacillus thuringiensis in Pest Control. Pesticide
Outlook. P. 90- 98.
26.Carlson, C. R., and A.-B. Kolstø. 1993. A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome. J. Bacteriol. 175:1053-1060.
27.Chicott, C. N., Wigley, P. J. 1993. Insecticidal activity of Bacillus
thuringiensis crytal protein. Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting. P. 43-52.
28.Crickmore N, Wheeler VC, Ellar DJ. 1994. Use of an operon fusion to induce expression and crystallization of a Bacillus thuringiensis δ- endotoxin encoded by a cryptic gene. Mol Gen Genet 242: 365-368
29.Crickmore, N., D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D. H. Dean. 1998. Revision of the nomenclature
for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol.
Biol. Rev. 62:807-813
30.Deacon, J. The microbial world: Bacillus thuringiensis.
www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31.Donovan WP, Dankocsik CC, Gilbert MP, Gawron- Burke MC, Groat
RG, Carlton BC. 1988. Amino acid sequence and entomocidal activity of the P2 crystal protein. J Biol Chem 263: 561-567
32.Dwu, XL. Cao, Y.Y Bai, AND AI. Aronson. 1991. Sequensing of an operon containing a novel δ- endotoxin gene from Bacillus thuringiensis.
FEMS microbial. Lett.81-31-36.
33.Duong Pham Thuy, Trịnh Thị Thu Hà, Hoang Thi Lan, Dang Van Tien,
Ngo Dinh Binh 2013. Genetic diversity and characterization of native Bacillus thuringiensis straing toxic to dipteran insects. Proceedings of the 2nd
VAST-KAST workshop on Biodiversity and Bio-active Compounds, Hanoi – Vietnam October 28th
- 29th, 2013, 297 – 304. ISBN: 978-604-913-143-1. 34.Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M. Diversity of bacillus thuringiensis
toxin and genes. In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice. Dited by P.F. Entwistle, J.S. Cory, M. J. bailey and S.
Higgs 1993, 37-60
35.Eugene W. Nester, linda S. Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002) 100 years of bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with wide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93, 5389-5394
36.Faiza Saleem and Abdul Rauf Shakoori. 2010. Characterization of cry2A-type Gene(s) from Pakistani Isolates of Bacillus thuringiensis Toxic
to Lepidopteran and Dipteran Insects. Pakistan J. Zool., vol. 42(3), pp. 181-193
37.Grochulski, P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, and M. Cygler. 1995. Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. J.
Mol. Biol. 254:447-464.
38.Trinh Thị Thu Ha, Le Thi Hong Nhung, Pham Kieu Thuy, Ngo Dinh Binh, 2011. Cloning and sequencing analyse of genes encoding crystal proteins toxic to Dipteran larvae from Bacillus thuringiensis. Proceeding of
the 4th International conference for the Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa (20-22 January 2011).75 – 80.
39.Kalman, S., K. L. Kiehne, N. Cooper, M. S. Reynoso, and T. Yamamoto. 1995. Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus
thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes. Appl. Environ. Microbiol. 61:3063-3068.
40.Koi Chi Yasutake, Ngo Dinh Binh, Kimuko Kagoshima, Akido Uemori,
Akira Ohguski, Minoru Meada, Eiizuki, Yong Man Yu, and Michio Ohba, 2006. Occurrence of parasporin-producing Bacillus thuringiensis in Vietnam. Can. J. Microbiol. 52, 365-372.
41.Koichi Yasutake, Akiko Uemori, Ngo Dinh Binh, Eiichi Mizuki, and Michio Ohba, 2007. Occurrence of Bacillus thuringiensis producing parasporin, Cancer Cell-killing cry Proteins, in Vietnam. Proceedings of the
6th Pacific Rim Conference. Science Publishing and Creative Service Agriculture and Agri-Food Canada. 63c, 124 – 125.
42.Kronstad, J. W., and H. R. Whiteley. 1986. Three classes of homologous
43.Lee, M. K., Walters, F. S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S. 2003. The
Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Ab δ-Endotoxin. Appl. Environ. Microbiol.
69: 4648-4657 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
44.Lee, M. K., Walters, F. S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S. Shotkoski, F. 2003. Vip3A: A novel Insceticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity
45.Lereclus, D., G. Menou, and M.-M. Lecadet. 1983. Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM 1. Mol. Gen.
Genet.191:307-313
46.Li, J., J. Carroll, and D. J. Ellar. 1991. Crystal structure of insecticidal δ-
endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution. Nature 353:815-
821
47.M-M. Lecadet, E. Frachon, V. Cosmao Dumanoir, H. Ripouteaus, S. Hamon, P. Laurent and I. Thiery. 1999. Updating the H- antigen classification of Bacillus thuringiensis. The society for Applied Microbiology. Journal of Applied Microbiology. 660:672.
48.Moar, W.J., Trumble,J.T., Hice, R.H. and Backman, P.A. 1994.
Insecticidal activity of the CryIIA protein from NRD- 12 isolate of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki expressed in Escherichia coli an Bacillus thuringiensis and in a leaf- colonizing strain of Bacillus cereus. Applied
and Environmental. Microbiology. 60, 896-902.
49.Ohba, M., and Aizawa, K. 1986. Distribution of Bacillus thuringiensis in
soil of Japan. J. invertebr. Pathol. Vol.47, 12-20.
50.Takashi Yamamoto and Gary K. Powell. 1993. Bacillus thuringiensis Crystal Proteins: Recent Advances in Understanding Its Insecticidal
Activity. Advanced Engineered Pesticides. Edited by Leo Kim. Marcel
Dekker, Inc., NY. 3-42
51.Le Thi Minh Thanh, Tran Quoc Trong, Tran Duy Quy, Ngo Dinh Binh,
2011. Construction of Ti-plasmid vector containing cry8Da gene against Cleopteran insecticide from Bacillus thuringiensis strain isolated in Vietnam to transfer into plant. Proceeding of the 4th International conference for the Development of Integrated Pest Management in Asia and Africa (20- 22 January 2011). 87 – 91.
52.Le Thi Minh Thanh, Tran Nguyen Thi Hue, Tran Duy Quy, Ngo Dinh Binh, 2012. Expression and purification of cry8Da recombinant protein against Coleopteran insects of Bacillus thuringiensis in E.coli. Tạp chí Khoa
học và công nghệ, 50, 3, 309 – 317.
53.Le Minh Thanh, Pham Kieu Thuy, Asano Shinichiro, Hori Hidetaka, Donald Dean, and Ngo Dinh Binh, 2009. Characterization of ry8da genes isolated from Bacillus thuringensi strais in Vietnam. Development of
Integrated Pest Management in Asia and Africa. Proceedings of the 3rd Internation Meeting. Ed. by Jamalam Lumbanraja, F.X. Susilo, Purnomo, Rosma Hasibuan, Ainin Niswati, Sri Yusnaini, Hidetaka Hori, Keiichi Okazali. Published by the University of Lampung Press. 3, 186-192.
54.Thiery and E. Frachon. 1997. Identification, isolation, culture and
preservation entomopathogenic bacteria. Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology. A academic press 55-57
55.Windner WR, Whiteley HR. 1989. Effect of a 20-kilodalton protein from
bacillus thuringiensis subsp. israelensis on production of the CytA protein by Escherichia coli. J Bacteriol 173: 1748-1756
mosquito larva, Aedes taeniorhynchus. Biochem Biophys Res Commun
103: 414-421;
57.Yamamoto T. 1983. Indentification of entomocidal toxin of Bacillus thuringiensis by high-performance liquid chromatography. ACS Symp Ser (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
432:46-60; 2595-2603.