2.
1.3.2.Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)
Vòng đời của ruồi nhà là chu kỳ biến thái hoàn toàn với 4 giai đọan: Trứng - Ấu trùng (còn gọi là d ) - Nhộng - Trƣởng thành (có cánh).
Hình 1.6. Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)
Con trƣởng thành dài 6 – 8 mm với chiều dài cánh 13 - 15 mm, ngực màu xám có 4 sọc sẫm
suốt bên hông, ở giữa đốt bụng có dãy đen hơi mở rộng để phủ đốt bụng cuối. Khi đậu nghỉ cánh trải ra, có 4 gân cánh rõ ràng uốn cong hƣớng về phía trên ở ngọn [58].
Ruồi nhà thông thƣờng sau 48 giờ thành con trƣởng thành, con cái bắt đầu đẻ trứng. Trong suốt cuộc đời con cái từ 1 - 3 tháng nó có khả năng sinh sản 4 - 5 lứa, mỗi lứa từ 100 - 150 trứng. Trứng hình trụ tròn trắng nhƣ ngọc trai, dài 1 mm, đƣợc đẻ ở những nơi có chất thối rữa nhƣng ẩm nhƣ rác nhà, lá cỏ ủ thành phân [58].
Hình 1.7. Trứng của ruồi nhà (Musca domestica)
Trứng nở trong khoảng từ 8 - 48 giờ sau khi đẻ, đây là giai đoạn ấu trùng hay còn gọi là . mềm, trắng, không chân, chúng tránh ánh sáng và tìm kiếm nhiệt độ tối ƣu là từ 45o
- 50oC. Sau 3 lần lột xác chúng sẽ là con ấu trùng thành thục dài 10 - 12 mm. Ở nhiệt độ cao hơn, sự phát triển của ấu trùng hoàn thành trong ít ngày, nhƣng trong mùa đông tiến trình này có thể mất hơn nhiều tháng.
Khi thành thục, ấu trùng rời khỏi nơi đẻ để tìm những nơi chung quanh mát hơn, thí dụ nhƣ đất. Ở đây chúng phát triển thành những chú nhộng màu vàng, màu nâu hoặc màu đen dài 6 mm. Tuỳ theo điều kiện, con trƣởng thành sẽ nở sau 3 ngày cho đến 4 tuần.
Với nhiệt độ cao của mùa hè, loài ruồi có vòng đời từ 12 - 14 ngày. Trong điều kiện ấm áp, trong vòng một tháng sẽ có khoảng hai đến ba thế hệ ruồi đƣợc sinh ra. Vì tốc độ sinh sản nhanh và với số lƣợng lớn ở mỗi lứa, lƣợng ruồi phát triển nhanh chóng. Thƣờng thì mật độ ruồi tăng và xuất hiện nhiều nhất là vào những tháng mùa thu.
1.3.3. Ảnh hƣởng của ruồi đối với sức khỏe cộng đồng.
hay lui tới hay ăn bất kỳ thực phẩm rắn dễ hoá lỏng. Chúng có thể làm ẩm những chất đang thối rữa hoặc thực phẩm đƣợc cất giữ cho sự tiêu dùng của con ngƣời. Ruồi làm thực phẩm hóa thành chất lỏng do chúng tiết ra dịch tiêu hoá và chất chứa trong dạ dày của chúng lên trên thực phẩm. Ruồi cái thƣờng đẻ trứng ở những nơi có chất hữu cơ thối rữa, lên men hoặc mục nát có nguồn gốc từ động vật hoặc thực vật, nhƣ phân ngƣời và các loại động vật, rác...
*/ Mức độ mang truyền dịch bệnh của ruồi nhà:
- Do ruồi sinh sản nhanh, dân số quá đông, nhà nào, nơi nào cũng có ruồi nên ngƣời ta quá quen và xem thƣờng chúng. Một cặp ruồi, nếu có đủ môi sinh (phân, rác…) cho nó phát triển thì trong vòng 6 tháng, có thể tạo ra một lƣợng ruồi bao phủ khắp trái đất một lớp dày 50 cm.
- Do cấu tạo cơ thể ruồi, nhất là các chùm lông ở ba cặp chân, khi ruồi di chuyển quét dính vi khuẩn ở các nơi bẩn rồi bám lên thức ăn, đồ dùng của ngƣời.
- Do quá trình biến thái, vi trùng trong phân động vật nhiễm vào , khi biến thành ruồi mang theo các vi trùng ấy sẵn sàng truyền sang nơi
- Do chất ói của ruồi, đƣờng dẫn thức ăn qua vòi liếm hút của ruồi có đƣờng kính quá nhỏ, chỉ bằng 0,006 mm, nên ruồi chỉ nuốt đƣợc thức ăn li ti cỡ hạt phấn hoa mà thôi. Vì vậy, khi gặp thức ăn, ruồi phải tiết nƣớc bọt ra rồi hút vào ói ra cho đến khi thức ăn mềm nhũn biến thành dịch lỏng mới liếm hút đƣợc. Bằng cách đó, ruồi đã truyền vi khuẩn vào thức ăn của ta.
- Do phân ruồi, trong khi ăn ruồi còn luôn luôn thải phân ra ngoài môi trƣờng. Vi khuẩn ở nơi bẩn thỉu theo đƣờng tiêu hóa của ruồi, sinh sôi nảy nở rồi theo phân ruồi bám lên thức ăn, vật dụng, vết thƣơng hay khóe miệng ngƣời… Vì thế mà mầm bệnh, vi khuẩn ở xa hàng cây số vẫn đƣợc ruồi mang đến lây truyền.
1.3.4. Một số phƣơng pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay.
Hiện nay có nhiều phƣơng pháp diệt ruồi khác nhau, có thể diệt ruồi trực tiếp bằng hóa chất diệt côn trùng hoặc bằng các biện pháp vật lý nhƣ bẫy tấm dính, vỉ đập, vỉ điện. Dù bằng cách nào cũng cần phù hợp với điều kiện vệ sinh môi trƣờng.
-Vệ sinh môi trƣờng:
Làm mất hoặc làm giảm nơi đẻ trứng của ruồi:Chuồng trại gia sức, gia cầm cần có rãnh thóat nƣớc, phân; nền sàn nên làm bê tông và xối sạch hàng ngày. Thu dọn phân thành đống và đậy lại bằng tấm nhựa và có điều kiện nên làm khô phân trƣớc khi ruồi có thời gian đẻ và phát triển. Làm tấm đậy các hố xí hở, và nên xây dựng những hố xí kín. Rác rƣởi và các chất thải hữu cơ cần làm sạch triệt để bằng cách thu dọn vào vật chứa, chuyên chở và xử lý đúng cách.
Làm giảm những nguồn thu hút ruồi từ nơi khác đến: Ruồi thƣờng đƣợc thu hút bởi mùi phát ra từ các ổ đẻ của chúng, mùi sinh ra từ thức ăn cá, xƣơng, đƣờng mía, sữa, hoa quả lên men …Cần giảm và làm sạch những chất này.
Đề phòng sự tiếp xúc giữa ruồi và mầm bệnh: Nguồn mầm bệnh của ngƣời và động vật bao gồm phân của ngƣời và động vật, rác thải, cống rãnh, mắt đau, chỗ lở loét, vết thƣơng mổ …
Bảo vệ không cho ruồi tiếp xúc với thức ăn, đồ dùng nhà ăn và với ngƣời: Đậy kín chén bát, thức ăn. Làm lƣới cửa ra vào và cửa sổ, chụp màn để bảo vệ trẻ con khi ngủ để không cho ruồi và các côn trùng khác vào.
Tuy nhiên, trong điều kiện việt nam hiện nay để thực hiện đƣợc những yêu cầu trên là điều rất khó. Vì vậy cấn sử dụng các biện pháp diệt và phòng trừ hiệu quả.
-Phƣơng pháp vật lý: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng ta có thể sử dụng những lọai bẫy ruồi nhƣ: bẫy ruồi, bẫy dính, bẫy điện…Sử dụng các chất hấp dẫn ruồi đến ăn và ruồi sẽ bị nhốt trong bẫy ruồi, bị dính vào các chất dính hoặc bị điện giật chết.
-Phƣơng pháp hóa học:
Một số biện pháp hóa học nhƣ sử dụng hộp Dichlorvos bốc hơi, bả diệt ruồi, phun tồn lƣu, phun không gian, phun hóa chất diệt giòi vào ổ đẻ của ruồi …Những biện pháp này diệt ruồi rất nhanh, đƣợc áp dụng khi có dịch tả, kiết lỵ, đau mắt, nhƣng hạn chế sử dụng vì ruồi phát triển tính kháng hóa chất rất nhanh.
Một số hóa chất sử dụng làm bả diệt ruồi nhƣ các hợp chất phospho hữu cơ (dichlovos, diazinon, malathion …); hợp chất carbamat (propoxur, formaldehyd ..).Các hóa chất sử dụng để phun tồn lƣu hoặc phun không gian nhƣ các hóa chất nhóm pyrethroid: Alphacypermethrin, cyfluthrin,deltamethrin, permethrin, lambdacyhalothrin …
-Phƣơng pháp dân gian:
Ruồi thích ánh sáng nên thƣờng xuất hiện ban ngày. Do ruồi có mắt kép phản xạ nhanh với ánh sáng phản chiếu bởi loại gƣơng cầu. Vì vậy ngƣời ta cho nƣớc sạch vào túi nylon, treo trong nhà, ruồi bay qua bay lại gặp phải ánh sáng phản quang từ các túi nylon đựng nƣớc, ruồi sợ và bay xa. Đây là biện pháp các quán hàng ăn uống thƣờng sử dụng rất có hiệu quả.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu.
2.1.1. Sinh phẩm.
- 45 ), Nha Trang và
Lâm Đồng chƣa đƣợc nghiên cứu trong bộ sƣu tập thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
- Ấu trùng ruồi nhà tuổi 1,2,3.
- Bã bia thu nhận tại Công ty Bia rƣợu Hà Nội để phục vụ nhân nuôi ấu trùng và thử hoạt tính.
- Cặp mồi đƣợc sử dụng để khuếch đại gen cry2A
Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Cặp mồi Trình tự Kích thƣớc (bp) Cry2AaF 5’….ATGGATCCATGAATAATGTATTGAATAG….3’ 1902 Cry2AaR 5’....TACTCGAGTTAATAAAGTGGTGGAAGAT….3’
- Vector tách dòng pCR2.1 do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp
- Enzyme: enzyme giới hạn EcoRI, enzyme nối T4 - ligase, Taq- polymerase…
2.1.2. Hóa chất và thiết bị. 2.1.2.1. Hóa chất. 2.1.2.1. Hóa chất.
- Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy: Cao thịt, Pepton, Trypton, cao men, agar…
- Hóa chất dùng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin axit, fushin bazơ. - Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris- base, TAE…
2.1.2.2. Thiết bị.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng Di truyền Vi sinh vật và phòng máy chung về công nghệ gen Viện Công nghệ Sinh học, gồm có:
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy chạy PCR Bộ điện di DNA Máy soi gel Máy chụp ảnh gen Máy li tâm Kính hiển vi quang học Máy Vortex Cân phân tích Cân điện tử Pipet man các loại Lò vi sóng Tủ lạnh -20o C Tủ ấm 28o C PTC- 100, Mỹ Thụy Điển Vilber Lourmat, Đức Gen Doc pharmacia Eppendof, Đức Olympus, Nhật Rotolab, OSI, Pháp Mettelex Toledo Ohaus
Sanyo, Nhật hoặc Gilson, Pháp Electrolux, Nhật
Frigor, Đan Mạch Friocell, Đức
2.1.2.3. Môi trƣờng và dung dịch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
*/ Môi trường: Trong quá trình thí nghiệm có sử dụng các loại môi trƣờng:
- Môi trƣờng phân lập và giữ chủng MPA
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g
H2O : 1 lít Agar : 16 g pH : 7 - 7,2 - Môi trƣờng lỏng MPB
Cao thịt : 4 g NaCl : 5 g Peptone : 10 g
H2O : 1 lít pH : 7 - 7,2
- Môi trƣờng Craige dùng phân lập chủng có khả năng chuyển động:
- Môi trƣờng LB:
Yeast extract : 5 g H2O : 1 lít NaCl : 5 g pH : 7 - 7,2 Trypton : 10 g
*/ Dung dịch tách chiết DNA plasmid:
- Dung dịch Sol I:
Tris - HCl 1M; pH=8 2,0 ml EDTA 0,5M; pH8 1,6 ml Glucose 0,72 g H2O khử ion tới 80 ml - Dung dịch Sol II:
NaOH 3M 100 µl SDS 10% 150 µl H2O khử ion 1250 µl
- Dung dịch Sol III:
CH3COOK 3M 23,52 g CH3COOH 9,2 ml - RNAse 10 mg/ ml :
Tris (0,1M; pH 7,5) 0,15 ml NaOH 1M 0,022 ml H2O khử ion 1,328 ml
*/ Dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di agarose
- Dung dịch TAE 50X:
Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 µl CH3COOH 28,6 µl H2O khử ion tới 50 ml - Dung dịch TAE 1X:
Dung dịch TAE 50X 10 ml Nƣớc cất 490 ml - Loading Dye
Bromophenol Blue 1% 1 ml Glycerol 87% 3,45 ml H2O khử ion 5,55 ml
- EDTA (0,5 M; pH 8) H2O khử ion 100 ml EDTA 14,61 g Chỉnh pH bằng NaOH
- Thuốc nhuộm bào tử (fushin axit) Fushin axit 1 g
H2O cất 100ml
- Thuốc nhuộm tinh thể (fushin bazơ)
Fushin bazơ 0,1 g Etanol 95 % 10 ml
Phenol 3 % 90 ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phƣơng pháp huyết thanh miễn dịch.
Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn đƣợc thu nhận từ các chủng Bt chuẩn theo
phƣơng pháp của Barjac và Bonnefoi, 1962 [15].
Các chủng Bt đƣợc cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, đƣợc cắm thẳng đứng vào môi trƣờng Craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280
C trong 24 - 48 giờ. Những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trƣờng giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ đƣợc cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trƣờng LB, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong 12 giờ.
Phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh tƣơng ứng đƣợc quan sát trên kính hiển vi: lấy 2 µl dịch nuôi cấy nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dƣới kính hiển vi [6]. Thử lần lƣợt với các typ huyết thanh khác, cho đến khi vi khuẩn mất khả năng chuyển động tức là phản ứng ngƣng kết xảy ra.
2.2.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học.
2.2.2.1. (Musca domestica)
Đặt các khay bã bia ở nơi có xuất hiện nhiều ruồi nhà khoảng 1- 2 ngày. Lớp bã bia trong khay dày 5 – 8cm, độ ẩm bã bia đƣợc duy trì ở 65- 70%
Chuyể
24- 30o -
.
Sau 8– , trứng ruồi nở, đ
. Dòi tránh ánh sáng và tìm kiếm nhiệt độ tối ƣu
. .
Khi thành thục, ấu trùng rời khỏi nơi đẻ để tìm nhữ ển thành những con nhộng.
Musca domestica
chuyể . Tuỳ theo điều kiện môi
trƣờng, con trƣởng thành sẽ nở sau 3 ngày cho đến 4 tuần.
ớ . Ruồi nhà thông thƣờng
sau 48 giờ thành con trƣởng thành,
. T
.
2.2.2.2. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể.
Chủng Bt phân lập đƣợc đƣợc đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trƣờng
MPA và nuôi trong tủ ấm 28o
C trong 3-4 ngày sau đó thu lại toàn bộ sinh khối. Sinh khối đƣợc xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút. Dịch đã xử lý nhiệt đƣợc pha loãng ở các nồng độ 10-6
đến 10-9, lấy 100µl mỗi nồng độ pha loãng đƣợc cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trƣờng MPA. Nuôi ở 28 0C sau 24h đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. Số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức [49]:
CFU= n.a.10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(CFU - Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc là số lƣợng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy).
n : Số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng. a : nồng độ pha loãng.
2.2.2.3. Thử hoạt tính trên ấu trùng ruồi nhà.
Ấu trùng ruồi nhà thử nghiệm: Sử dụng ấu trùng Musca domestica tuổi 1, 2, 3. Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tƣợng ấu trùng ruồi nhà Musca domestica
theo phƣơng pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107
và 109 bào tử/ml [55]. Mỗi nồng độ đƣợc thử nghiệm với 3 cốc nhựa (mỗi cốc 10 ấu trùng).
Chuẩn bị:
Các chủng Bacillus thuringiensis đƣợc cấy trang trên môi trƣờng MPA, nuôi lắc ở 28 0C trong 72 giờ. Sau đó, thu sinh khối tế bào vào ống eppendoft có chứa 1ml nƣớc cất vô trùng. Tiếp theo, tiến hành pha loãng đến mật độ 107 và 109 bào tử/ml để thử hoạt tính. Cơ chất để thử hoạt tính đƣợc sử dụng giống với cơ chất trong quá trình nhân nuôi ấu trùng ruồi nhà (bã bia). Nuôi ở nhiệt độ phòng, ở nơi thoáng mát, độ ẩm của thức ăn cần đƣợc duy trì ổn định. Theo dõi tỉ lệ
chết trong 3 - 5 ngày.
Tỉ lệ ấu trùng chết đƣợc tính theo công thức Abbott [13]: A=(C-T).100/C Trong đó: A: % ấu trùng ruồi nhà chết.
C: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu đối chứng. T: Số ấu trùng ruồi nhà sống ở mẫu thí nghiệm.
2.2.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trƣờng LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37oC.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút). - Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa. - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâ , ủ -20o
C ).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200
C.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạchplasmid của E. coli.
- Đẩy nƣớc trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl. - Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm.