2.
3.4.Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết
thanh bằng phƣơng pháp PCR.
Nhóm gen mã hóa protein Cry2 là nhóm gen mới hiện đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Protein tinh thể độc tố của nhóm gen này có tác dụng với nhiều loài côn trùng thuộc bộ hai cánh. Theo nhiều tài liệu đã công bố trên thế giới, Gen
cry2A đƣợc phát hiện thuộc dƣới loài Bt. kurstaki, sotto, israelensis, kenyae... có
hoạt tính diệt bộ cry2A đƣợc sử
dụng cry2A
gen cry2A
1902 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% 3.4).
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%
1 - MSS 6.3; 2- LD 2.21; 3- MSS 4.2; 4- LNT 16.6; 5- MSS1.1; 6- MSS 8.4; 7- LNT 7.12; 8- Marker
Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phƣơng pháp PCR cho thấy từ 34 chủng thí nghiệm có 7 chủng cho sản phẩm PCR duy nhất có 1 băng có kích thƣớc khoảng ~ 1900 bp đúng nhƣ tính toán. Để xác định các đoạn gen trên có đúng là gen cry2A hay không chúng tôi lựa chọn 2 chủng có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà cao nhất để tách dòng và đọc trình tự gen.
3,0 2,0 Kb
3.5. Tách đọc trình tự gen cry2A.
3.5.1. cry2A.
*/ Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1:
Hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao đƣợc sử dụng để tách dòng là MSS8.4
và LNT7.12. cry2A của chúng vector
pCR2.1 enzyme T4 - ligase 4o vector . Sản phẩm là vector tái
tổ hợp pCR2.1 - cry2A - LNT7.12; pCR2.1 - cry2A - MSS8.4. */ Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α:
Tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp trên vào tế bào E. coli 5α
- 37oC. Sau 14 - và xen kẽ
nhau. Những cry2A
3.5).
Hình 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp pCR2.1- cry2A vào vi khuẩn E.coli DH5α
. Tiến hành tách DNA plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng điện di trên gel agarose 1%.
cry2A
Do trên vector tách dòng pCR2.1 có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI tiếp
giáp với vùng đa cắt nối (vùng này cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng đã thực hiện thành công với vector tái tổ hợp pCR2.1 - cry2A - LNT7.12 và pCR2.1 - cry2A- MSS8.4. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide từ các dòng khuẩn lạc pCR2.1 - cry2A - LNT7.12 và pCR2.1 - cry2A - MSS8.4 trên agarose 1%.
1: Sản phẩm cắt từ dòng khuẩn lạc của pCR2.1 - cry2A – MSS8.4. 2: Sản phẩm cắt từ dòng khuẩn lạc của pCR2.1 - cry2A - LNT7.12 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3: Thang DNA chuẩn
enzyme
Eco 2 băng, băng vector CR2.1 hơn
3,9 kb ~ 1,9 k a gen cry2A.
Điều đó chứng tỏ đoạn gen đã gắn vào vector tách dòng pCR2.1 thành công.
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen
cry2A hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái
tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen cry2A.
*/ Kiểm tra sự có mặt của gen cry2A trong vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR: 1 2 3 2,0 3,0 Kb 1,902 3,9 Kb 1 2 3
Phản ứng PCR kiểm tra đƣợc thực hiện sử dụng DNA plasmid tái tổ hợp làm khuôn và cặp mồi đặc hiệu (2AF, 2AR). Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.7.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cry2A
1: Sản phẩm PCR với khuôn DNA plasmid pCR2.1 – cry2A – MSS8.4 2: Sản phẩm PCR với khuôn DNA plasmid pCR2.1 – cry2A – LNT7.12 3: ĐC (sản phẩm PCR với DNA của chủng Bt MSS8.4)
4: Thang DNA chuẩn
Kết quả thu đƣợc chỉ có 1 băng duy nhất với kích thƣớc khoảng ~ 1,9 kb giống với sản phẩm PCR với DNA đƣợc tách từ chủng Bt MSS8.4.
Từ những kết quả thu đƣợc ở trên, bƣớc đầu chúng tôi có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen cry2A của 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4 trong vector
pCR2.1. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng là gen cry2A hay không,
chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
3.5.2. cry2A.
Sau khi thu nhận đƣợc plasmid có chứa đoạn gen cry2A chúng tôi tiến hành đọc trình tự gen này bằng máy đọc trình tự DNA tự động. Hai trình tự DNA của các plasmid trên này đƣợc so sánh với trình tự mã số AJ488143.1 trên Ngân hàng Gen Quốc tế. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry2A từ chủng MSS8.4 có chiều
1 2 3 4 kb 1,9 1,5 2,0 kb
ngân hàng gen (Hình 3.8) với các vị trí sai khác nhƣ sau: chủng MSS8.4 vị trí nuleotide 60: C - T, vị trí nucleotide 1854: T - C. Trong khi đó, chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng công bố.
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 ATGAATAATG TATTGAATAG TGGAAGAACA ACTATTTGTG ATGCGTATAA TGTAGTAGCT LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... .........C AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... .........C 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 CATGATCCAT TTAGTTTTGA ACATAAATCA TTAGATACCA TCCAAAAAGA ATGGATGGAG
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... ...... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... ...... .......... 130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 TGGAAAAGAA CAGATCATAG TTTATATGTA GCTCCTGTAG TCGGAACTGT GTCTAGTTTT LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 TTGCTAAAGA AAGTGGGGAG TCTTATTGGA AAAAGGATAT TGAGTGAATT ATGGGGGATA LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ........ AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ........ 250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 ATATTTCCTA GTGGTAGTAC AAATCTAATG CAAGATATTT TAAGGGAGAC AGAACAATTC
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ........
310 320 330 340 350 360 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MSS8.4 CTAAATCAAA GACTTAATAC AGATACCCTT GCTCGTGTAA ATGCAGAATT GATAGGGCTC
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 CAAGCGAATA TAAGGGAGTT TAATCAACAA GTAGATAATT TTTTAAACCC TACTCAAAAC
LNT7.12 .......... .......... ....... .......... ....... .......
AJ488143.1 .......... .......... ....... .......... ....... .......
430 440 450 460 470 480 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 CCTGTTCCTT TATCAATAAC TTCTTCGGTT AATACAATGC AGCAATTATT TCTAAATAGA
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
490 500 510 520 530 540 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 TTACCCCAGT TCCAGATACA AGGATACCAG TTGTTATTAT TACCTTTATT TGCACAGGCA
LNT7.12 ....... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 ....... .......... .......... .......... .......... .......... 550 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 GCCAATATGC ATCTTTCTTT TATTAGAGAT GTTATTCTTA ATGCAGATGA ATGGGGTATT LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 610 620 630 640 650 660 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
670 680 690 700 710 720 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 AATTATTGTA TAAATACGTA TCAAACTGCG TTTAGAGGGT TAAACACCCG TTTACACGAT
LNT7.12 .......... .......... ........ .......... ..... .......... AJ488143.1 .......... .......... ........ .......... ..... .......... 730 740 750 760 770 780 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 ATGTTAGAAT TTAGAACATA TATGTTTTTA AATGTATTTG AATATGTATC CATTTGGTCA LNT7.12 .......... .......... ........ .......... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... ........ .......... .......... .......... 790 800 810 820 830 840 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 TTTTTTAAAT ATCAGAGTCT TATGGTATCT TCTGGCGCTA ATTTATATGC TAGCGGTAGT LNT7.12 ....... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 ....... .......... .......... .......... .......... .......... 850 860 870 880 890 900 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 GGACCACAGC AGACACAATC ATTTACAGCA CAAAACTGGC CATTTTTATA TTCTCTTTTC
LNT7.12 ....... ....... .......... ....... ........ .......... AJ488143.1 ....... ....... .......... ....... ........ .......... 910 920 930 940 950 960 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 CAAGTTAATT CGAATTATAT ATTATCTGGT ATTAGTGGTA CTAGGCTTTC TATTACCTTC LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 CCTAATATTG GTGGTTTACC GGGTAGTACT ACAACTCATT CATTGAATAG TGCCAGGGTT
LNT7.12 .......... .......... .......... ........ .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... ........ .......... .......... 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 AATTATAGCG GAGGAGTTTC ATCTGGTCTC ATAGGGGCGA CTAATCTCAA TCACAACTTT LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ....... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ....... 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 AATTGCAGCA CGGTCCTCCC TCCTTTATCA ACACCATTTG TTAGAAGTTG GCTGGATTCA LNT7.12 .......... .......... .......... ....... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... ....... .......... .......... 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 GGTACAGATC GAGAGGGCGT TGCTACCTCT ACGAATTGGC AGACAGAATC CTTTCAAACA
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ....... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ....... 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 ACTTTAAGTT TAAGGTGTGG TGCTTTTTCA GCCCGTGGAA ATTCAAACTA TTTCCCAGAT LNT7.12 .......... .......... ........ .......... ........ .......... AJ488143.1 .......... .......... ........ .......... ........ .......... 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 TATTTTATCC GTAATATTTC TGGGGTTCCT TTAGTTATTA GAAACGAAGA TCTAACAAGA LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ........ AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ........ 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
LNT7.12 .......... ...... .......... .......... ....... ..........
AJ488143.1 .......... ...... .......... .......... ....... ..........
1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MSS8.4 CGGGCCTATT TGGTATCTGT GCATAACAGA AAAAATAATA TCTATGCCGC TAATGAAAAT
LNT7.12 .......... .......... .......... ........ .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... ........ .......... ..........
1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 GGTACTATGA TCCATTTGGC GCCAGAAGAT TATACAGGAT TTACTATATC GCCAATACAT
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
1510 1520 1530 1540 1550 1560 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 GCCACTCAAG TGAATAATCA AACTCGAACA TTTATTTCTG AAAAATTTGG AAATCAAGGT
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... ........ ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... ........ ..........
1570 1580 1590 1600 1610 1620 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 GATTCCTTAA GATTTGAACA AAGCAACACG ACAGCTCGTT ATACGCTTAG AGGGAATGGA
LNT7.12 .......... .......... ....... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... ....... .......... .......... ..........
1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 AATAGTTACA ATCTTTATTT AAGAGTATCT TCAATAGGAA ATTCAACTAT TCGAGTTACT
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........
1690 1700 1710 1720 1730 1740 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 ATAAACGGTA GAGTTTATAC TGTTTCAAAT GTTAATACCA CTACAAATAA CGATGGAGTT
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... ........ .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... ........ .......... 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MSS8.4 AATGATAATG GAGCTCGTTT TTCAGATATT AATATCGGTA ATATAGTAGC AAGTGATAAT LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
MSS8.4 ACTAATGTAA CGCTAGATAT AAATGTGACA TTAAACTCCG GTACTCCATT TGACCTCATG
LNT7.12 .......... .......... .......... .......... .......... ...T......
AJ488143.1 .......... .......... .......... .......... .......... ...T...... 1870 1880 1890 1900
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ..
MSS8.4 AATATTATGT TTGTGCCAAC TAATCTTCCA CCACTTTATT AA
LNT7.12 .......... ........ .......... .......... ..
AJ488143.1 .......... ........ .......... .......... ..
Hình 3.8. So sánh trình tự gen của 2 chủng MSS8.4 và LNT7.12 với AJ488143.1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});