Nghiên cứu biểu hiện GEN BGC mã hóa BETA GLUCOSIDASE trong e COLI sử dụng VECTOR biểu hiện PET 22b(+)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN BGC MÃ HÓA BETA-GLUCOSIDASE TRONG E.COLI SỬ DỤNG VECTOR BIỂU HIỆN PET-22B(+) Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thơm Lớp : 11-02 Hà Nội - 2015 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu phòng Kỹ thuật Di truyền,Viện Công nghệ Sinh học nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên thầy cô, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam HảiViện trưởng viện Công nghệ Sinh học, TS Đỗ Thị Huyền trưởng phòng Kỹ thuật Di truyền tận tình hướng dẫn dìu dắt suốt thời gian qua Trong trình thực đề tài, nhận bảo chuyên môn nhiệt tình từ NCS Nguyễn Thị Thảo- người theo sát thí nghiệm để có lời khuyên bổ ích kịp thời Gần hai năm học tập nghiên cứu phòng Kỹ thuật Di truyền, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành tập thể cán phòng Các thực tập sinh thân thiện, nhiệt tình tạo nên môi trường nghiên cứu chủ động, hăng say Tôi xin chân thành cảm ơn sư giúp đỡ quý báu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội động viên dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Bằng tình cảm chân thành, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Thơm SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BETA-GLUCOSIDASE 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc phân loại 1.1.1.1 Sơ lược beta-glucosidase 1.1.1.2 Tính đặc hiệu chất chất ức chế beta-glucosidase 1.1.1.3 Phân loại beta-glucosidase 1.1.1.4 Cấu trúc chức 1.1.1.5 Các dạng hoạt tính beta-glucosidase .7 1.2 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BETA-GLUCOSIDASE 1.2.1 Ứng dụng sản xuất cồn sinh học 1.2.2 Ứng dụng công nghiệp giấy 1.2.3 Ứng dụng xử lý môi trường 1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN 10 1.3.1 Vector tách dòng pBluescript SK(+) 10 1.3.2 Chủng tách dòng E coli DH10B 11 1.3.3 Biểu gen E coli 11 1.3.3.1 Chủng biểu E coli BL21(DE3) 12 1.3.3.2 Vector biểu pET-22b(+) .13 CHƯƠNG 15 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 VẬT LIỆU 15 2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 15 2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy 15 2.1.3 Hóa chất dung dịch sử dụng 16 2.1.3.1 Hóa chất 16 2.1.3.2 Enzyme 16 2.1.3.3 Các dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E.coli 16 2.1.3.4 Các dung dịch dùng điện di DNA gel agarose 0,8% .17 2.1.3.5 Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide- SDS .17 2.1.4 Máy móc thiết bị 19 SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Khuếch đại gen phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 19 2.2.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt 20 2.2.3 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 22 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 23 2.2.5 Phương pháp xử lý DNA enzyme hạn chế 24 2.2.6 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào ADN plasmid 24 2.2.7 Biểu gen 25 2.2.8 Điện di protein gel polyacrylamide – SDS 26 2.2.9 Xác định lượng đường khử DNS 27 CHƯƠNG 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN BGC MÃ HÓA BETAGLUCOSIDASE 29 3.1.1 Nhân dòng gen bgc mã hóa enzyme beta-glucosidase PCR 30 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR pET-22b(+) XhoI+ NcoI 31 3.1.3 Nối ghép gen bgc vào vector biểu pET-22b(+) 32 3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-bgc từ tế bào E coli DH10B 34 3.1.5 Kiểm tra gen bgc vector biểu pET-22b(+) enzyme hạn chế 35 3.2 BIỂU HIỆN GEN BGC TRONG CHỦNG E COLI BL21(DE3) 37 3.2.1 Biến nạp vector biểu pET22-bgc vào tế bào khả biến E coli BL21 37 3.2.2 Biểu gen bgc chủng E coli BL21 37 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN BGC TRONG CHỦNG VI KHUẨN E COLI BL21 39 3.3.1 Môi trường nuôi cấy 39 3.3.2 Khảo sát nồng độ NaCl 41 3.3.3 Lựa chọn nhiệt độ biểu 42 3.3.4 Lựa chọn nồng độ IPTG 44 3.4 KIỂM TRA SƠ BỘ HOẠT TÍNH CỦA BETA -GLUCOSIDASE 46 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BGC Betaglucosidase DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria- Bertani medium Amp Ampicillin IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside RNA Ribonucleic acid DNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid APS Amonium persulfate Bp Base pairs Kb Kilobase kDa KiloDalton OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfate PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris-acetate-EDTA TEMED Tetramethylethelenediamine SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG  Bảng Thành phần gel polyacrylamide  . 18  Bảng Thành phần phản ứng PCR   19  Bảng Thành phần phản ứng cắt   24  Bảng Thành phần phản ứng nối ghép gen   25  Bảng Thành phần phản ứng với DNS  . 28  SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế tác dụng cellulase .2 Hình Cấu trúc không gian beta-glucosidase có nguồn gốc từ nấm Hình Sơ đồ cấu tạo vector pET-22b(+) 14 Hình Sơ đồ thí nghiệm 30 Hình Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 31 Hình Điện di kiểm tra sản phẩm tinh chế gen bgc vector pET-22b(+) sau xử lý với cặp enzyme hạn chế NcoI/ XhoI 32 Hình Đĩa biến nạp sản phẩm lai gen bgc với vector pET-22b(+) tế bào E coli DH10B môi trường thạch đĩa LBA 33 Hình Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET22-bgc 34 Hình A) Sơ đồ thể trình cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-bgc cặp enzyme NcoI XhoI B) Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pET22-bgc enzyme hạn chế NcoI XhoI 35 Hình 10 Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pET22-bgc enzyme hạn chế XhoI NdeI 36 Hình 11 Đĩa biến nạp pET22-bgc vào tế bào E coli BL21 37 Hình 12 Phân tích protein biểu chủng E coli BL21 .38 Hình 13 Phân tích protein tổng hợp E coli BL21 mang gen bgc 40 Hình 14 Phân tích protein biểu E coli BL21 mang gen bgc 42 Hình 15 Phân tích protein biểu tế bào 43 Hình 16 Đồ thị thể giá trị OD600 thu mẫu 45 Hình 17 Phân tích protein biểu E coli BL21 mang gen bgc 45 Hình 18 Kết sơ kiểm tra hoạt tính enzyme 46 Hình 19 Đồ thị thể hàm lượng đường khử giải phóng 47 SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Hàng năm ngành nông lâm nghiệpViệt Nam tạo nguồn phế phẩm lớn chủ yếu rơm rạ với khối lượng ước tính đạt khoảng 46 triệu tấn/ năm Nguồn sinh khối coi dư thừa tận dụng làm nguyên liệu sinh học để tạo sản phẩm có giá trị nhiên liệu sinh học Trong trình chuyển hóa phế phẩm nông nghiệp cần hệ thống enzyme cellulase để thủy phân hiệu cellulose giải phóng sản phẩm cuối glucose Beta-glucosidase cellulase đóng vai trò quan trọng trình thủy phân sinh khối thực vật chúng có khả phân cắt cellobiose cello-oligosaccharide thành đường glucose giải ức chế cho endoglucanase Tuy nhiên, việc tìm enzyme có hoạt tính mạnh, phân cắt nhanh thách thức lớn với nhà khoa học để sản phẩm chuyển hóa từ nguồn sinh khối cạnh tranh thị trường Mối xem sinh vật có ích có khả phân giải cellulose thực vật, tăng độ mùn cho đất, mắt xích thức ăn quan trọng chu trình luân chuyển vật chất hệ sinh thái Hệ vi sinh vật ruột mối phong phú, đa dạng đóng vai trò quan trọng tồn loài mối Chúng tiết enzyme cellulase hemicellulase tham gia thủy phân hoàn toàn lignocellulose thành đường, qua mối tiêu hóa gỗ cách dễ dàng Vì vậy, nguồn gen quan trọng cho nghiên cứu khai thác gen mã hóa enzyme có hoạt tính tốt Trong năm 2012-2015 phòng Kỹ thuật Di truyền giải mã metagenome vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi Với liệu thu được, 200 gen mã hóa cho beta-glucosidase xác định, có 29 gen hoàn thiện Qua phần mềm tin sinh học Phòng lựa chọn phân lập gen bgc mã hóa betaglucosidase mã GL0128938 có kích thước 1437bp Để đánh giá tính chất enzyme, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu biểu gen bgc mã hóa beta-glucosidase E.coli sử dụng vector biểu pET-22b(+)” SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU   1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BETA-GLUCOSIDASE 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc phân loại 1.1.1.1 Sơ lược beta-glucosidase Enzyme cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc phân cắt liên kết beta-1,4-glucozit cellulose tạo sản phẩm đường glucose Phức hợp cellulase bao gồm ba loại enzyme là: endo-1,4beta-glucanase (EC.3.2.1.4), cellobiohydrolase ( exo-1,4-beta-glucanase ) (EC.3.2.1.91), beta-glucosidase (EC.3.2.1.21) [3] Các enzyme có tính đặc hiệu khác hoạt động hỗ trợ cho Quá trình thủy phân cellulose thông qua hoạt động hiệp đồng enzyme để chuyển hóa thành đường glucose Trong đó, giai đoạn đầu, endo-glucanase tác động vào vùng vô định hình bề mặt cellulose, thủy phân ngẫu nhiên liên kết β-1,4 glucozit mạch cellulose nhanh chóng làm giảm mức độ trùng hợp tạo đầu mạch tự Cellobiohydrolase công cellulose từ đầu không khử tạo sản phẩm cellobiose cuối beta-glucosidase thủy phân cellobiose giải phóng hai phân tử đường beta-D-glucose [3, 4] Hình Cơ chế tác dụng cellulase SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học Beta-glucosidase có tên gọi khác beta-D-glucoside glucohydrolase, EC.3.2.1.21, xúc tác cho trình thủy phân liên kết β-glucoside gốc alkyl, aryl β-glucoside disaccharide oligosaccharide chuỗi ngắn tạo đường glucose [2] [3] Beta-glucosidase phổ biến thiên nhiên tìm thấy vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật Enyme làm tăng hiệu thủy phân hiệu cellulose điều kiện hoạt động định 1.1.1.2 Tính đặc hiệu chất chất ức chế beta-glucosidase Beta-glucosidase có tính đặc hiệu chất tương đối Vì vậy, nghiên cứu chế hoạt động động học beta-glucosidase, điều quan trọng phải xem xét chất sử dụng Nếu chất đặc hiệu enzyme bị thay đổi ảnh hưởng đến liệu động học thu [1] Các aryl-glucoside p- nitrophenylbeta-D-glucopyranoside chất chuẩn việc xác định hoạt tính enzyme beta-glucosidase Tất enzyme biết có khả thủy phân đặc hiệu chất với giá trị Km từ 0,31mM đến 1,87mM [3] Dữ liệu thu cách sử dụng sinh khối tổng hợp thành phần tinh khiết có giá trị khả áp dụng hạn chế vào việc dự đoán mô hình hóa trình thủy phân sinh khối [1] Hiệu chuyển hóa thành đường mạnh đặc tính cần thiết với enzyme Trong hầu hết trường hợp glucose - sản phẩm trình thủy phân có tác dụng ức chế mạnh mẽ lên beta-gluosidase làm giảm đáng kể tỷ lệ cellulose thủy phân thông qua chế cạnh tranh [1] [3] Vì vậy, hoạt tính mạnh ra, nhà khoa học tìm kiếm enzyme beta-glucosidase có khả chịu nồng độ glucose cao Chỉ vài beta-glucosidase báo cáo chịu glucose ví dụ từ Aspergillus oryzae với Ki 1,36 M [3] Sự giảm tốc độ hình thành glucose gây tượng glycosyl hóa phản ứng enzyme trình thuận nghịch Đây điểm khác biệt beta-glucosidase với enzyme khác thuộc nhóm cellulase Do tượng glycosyl hóa mà tốc độ chuyển hóa sinh khối thành đường giảm đáng kể Đây phản ứng không mong muốn trình thủy phân sinh khối, thường xuất số enzyme beta-glucosidase nồng độ glucose cao Để hạn chế trình này, số SV: Nguyễn Thị Thơm K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học vào tế bào biểu E coli BL21(DE3) để tạo chủng tái tổ hợp có khả biểu protein BGC 3.2 BIỂU HIỆN GEN BGC TRONG CHỦNG E COLI BL21(DE3) 3.2.1 Biến nạp vector biểu pET22-bgc vào tế bào khả biến E coli BL21 Sau tạo vector biểu pET-22b(+) mang gen bgc, tiến hành biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E coli BL21 phương pháp sốc nhiệt   Hình 11 Đĩa biến nạp pET22-bgc vào tế bào E coli BL21 Trên đĩa biến nạp ta thấy khuẩn lạc mọc đồng nhất, riêng rẽ Theo lý thuyết, dòng tế bào mang plasmid có gen kháng ampicillin mọc môi trường chứa loại kháng sinh Vì thể biến nạp mọc đĩa chọn lọc dòng tế bào E coli mang ADN plasmid tái tổ hợp pET22-bgc Như vậy, tạo thành công dòng tế bào biểu mang gen bgc Công việc tiến hành biểu gen mã hóa bgc chủng E coli BL21 3.2.2 Biểu gen bgc chủng E coli BL21 Trong biểu gen, bước quan trọng mà cần phải làm nuôi cấy thể biến nạp môi trường có chất cảm ứng promoter để protein tái tổ hợp SV: Nguyễn Thị Thơm 37 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học tổng hợp Trong vector biểu pET-22b(+), hoạt động gen bgc điều khiển operon lac với chế kiểm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG Để kiểm tra khả biểu tạo protein tái tổ hợp chủng vi khuẩn mang gen bgc, chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc E coli BL21 mang gen bgc đem nuôi lắc qua đêm môi trường LBA lỏng 37oC Sau tế bào làm tươi cách cấy chuyển sang bình nuôi cấy khác chứa môi trường LBA cho OD600 ban đầu đạt 0,1 nuôi lắc điều kiện đến OD600 đạt từ 0,6-0,8 bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM cảm ứng trong điều kiện nuôi lắc 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/ phút để tổng hợp protein BGC Dòng đối chứng âm chọn vector pET-22b(+) không mang gen nuôi cấy song song điều kiện Sau nuôi cấy, tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào sau đưa mẫu OD600 = 10 thực phá vỡ tế bào siêu âm Tiếp theo mẫu protein biến tính đệm biến tính điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,6% Kết điện di quan sát sau nhuộm với thuốc nhuộm coomassie (Hình 12) (-) TS T BGC KT TS T KT M kDa  116  66.2 52,47 kDa  45.0  35.0  25.0  18.4  14.4   Hình 12 Phân tích protein biểu chủng E coli BL21 tái tổ hợp gel SDS-PAGE TS: protein tổng T: Pha protein dạng tan KT: Pha protein không tan M: protein chuẩn (Thermo) SV: Nguyễn Thị Thơm 38 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học Phân tích kết điện di cho thấy protein tổng số từ dòng mang gen bgc xuất băng protein có kích thước khoảng 52,47 kDa tương ứng với kích thước protein BGC theo tính toán lý thuyết, đường chạy đối chứng chủng không mang gen lại không xuất băng này, điều chứng tỏ protein BGC biểu chủng vi khuẩn E coli BL21 tái tổ hợp Đa số protein tái tổ hợp biểu pha tan hoạt tính tốt pha không tan dạng tan khả protein cuộn xoắn cấu trúc cao vùng định hoạt tính bộc lộ [16] [17] Để kiểm tra khả tan protein BGC tiến hành siêu âm phá vỡ tế bào ảnh điện di cho thấy protein BGC biểu chủ yếu dạng không tan dạng không mong muốn Để đạt mức độ biểu protein cao dạng tan, tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình biểu để tìm điều kiện tối ưu 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN BGC TRONG CHỦNG VI KHUẨN E COLI BL21 3.3.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy chất dinh dưỡng cần thiết nhằm đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển sản sinh sản phẩm trao đối chất vi khuẩn Khi nghiên cứu biểu gen bgc tế bào E coli BL21 môi trường LBA, môi trường biểu thường dùng phòng thí nghiệm thấy protein BGC biểu hiện, biểu lại dạng không tan Do nghiên cứu, tham khảo số báo quốc tế viết ảnh hưởng hóa chất kèm nâng cao độ tan protein tái tổ hợp E coli Chúng tiến hành bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy chất NaCl, sorbitol, tween NaCl bổ sung nhằm cung cấp thêm dinh dưỡng khoáng cho chủng vi khuẩn phát triển [19] Nhưng nồng độ NaCl cao gây tượng nước tế bào thẩm thấu môi trường nuôi cấy, có sorbitol làm giảm stress cho tế bào, bảo vệ màng tế bào, bổ sung nguồn dinh dưỡng Cacbon- thành phần cấu tạo tế bào [18] Tween chất hoạt động bề mặt, tween môi trường hạn chế kết tủa DNA, protein tạo điều kiện giúp protein tan tốt [19] Chính vậy, nghiên cứu SV: Nguyễn Thị Thơm 39 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học tiến hành biểu bgc tế bào E coli BL21(DE3) 28oC, cảm ứng 0,5 mM IPTG môi trường LBA bổ sung 0,5 M NaCl, 0,5 M sorbitol, 0,02% tween Sau cảm ứng tiến hành ly tâm 6000 vòng/ phút 10 phút để thu sinh khối tế bào, đưa mẫu OD600 = 10 sau tiến hành siêu âm phá tế bào để kiểm tra mức độ tan protein Kết biểu thể hình 13 LB + 0,5 M sorbitol 0,5M NaCl 0,02% Tween kDa M TS T KT LB + 0,5M NaCl 0,02% Tween LB + 0,5M NaCl TS T KT TS T KT LB + 0,5M NaCl 0,5M sorbitol TS T KT M 116,0 BGC 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4   Hình 13. Phân tích protein tổng hợp E coli BL21 mang gen bgc môi trường khác M: Protein chuẩn (Fermentas) TS: protein tổng số T: Protein pha tan KT: Protein pha không tan Kết điện di đồ cho thấy biểu protein môi trường LBA bổ sung 0,5M NaCl mức độ biểu nồng độ muối cao gây tượng nước tế bào, giảm khả sinh trưởng tế bào Còn môi trường LBA có 0,5 M NaCl bổ sung thêm 0,5 M sorbitol 0,02% tween protein BGC biểu phần lớn pha không tan Kết biểu protein BGC môi trường LBA có chứa 0,5 M NaCl, 0,5 M SV: Nguyễn Thị Thơm 40 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học sorbitol, 0,02% tween tốt băng protein thu đậm so với môi trường LBA chứa NaCl, sorbitol tween chứng tỏ mức độ biểu cao Đồng thời protein biểu tan phần Do định lựa chọn bổ sung thêm vào môi trường LBA chất 0,5M sorbitol, 0,5M NaCl, 0,02% Tween Bên cạnh đó, nồng độ NaCl ảnh hưởng tới biểu protein tái tổ hợp tế bào, trạng thái tế bào, gây khó khăn trình siêu âm phá vỡ tế bào Do tiến hành tối ưu nồng độ NaCl bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy để thu mức độ biểu cao 3.3.2 Khảo sát nồng độ NaCl Các muối vô nguồn chất dinh dưỡng thiếu sinh trưởng vi sinh vật Chúng có chức sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần trung tâm hoạt tính enzyme vi sinh vật, trì tính ổn định kết cấu đại phân tử tế bào, điều tiết trì cân áp suất thẩm thấu tế bào NaCl muối khoáng cần thiết cho sinh trưởng, phát triển vi sinh vật Ngoài NaCl làm cho tế bào sinh trưởng chậm, tốc độ tổng hợp protein chậm làm chúng có khả cuộn xoắn cấu trúc nên dạng tan có khả thể hoạt tính cao Do khảo sát để tối ưu nồng độ NaCl bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy Bằng cách tiến hành nuôi cấy biểu chủng E Coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET22-bgc nồng độ muối khác nhau: 0,25 M; 0,35 M; 0,45 M; 0,55 M; 0,5 M Cảm ứng 0,5 mM IPTG dòng đối chứng âm không cảm ứng nuôi 28oC Sau nuôi cấy, tế bào sau thu lại cách ly tâm 6000 vòng/ phút 10 phút đưa OD600 = 10 xử lý cách siêu âm phá vỡ tế bào tách pha tan không tan Dịch protein sau xử lý điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6% Kết trình bày hình 14 SV: Nguyễn Thị Thơm 41 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Tan Tổng số 0.25 0.35 0.45 0.55 0.5 M (-) kDa Khoa Công nghệ sinh học Không tan M (-) 0.25 0.35 0.45 0.55 0.5 0.25 0.35 0.45 0.55 0.5 170 130 100 70 BGC 55 40 35 25 15 Hình 14 Phân tích protein biểu E coli BL21 mang gen bgc nồng độ muối khác M: Protein chuẩn (Fermentas) 0,25-0,55: nồng độ NaCl có môi trường biểu (-): Dòng đối chứng âm (không cảm ứng IPTG) Kết ảnh điện di cho thấy đường chạy dòng đối chứng âm không xuất băng protein quan tâm Hàm lượng protein tổng số biểu dải nồng độ chọn tương đương Kết kiểm tra pha tan không tan thấy nồng độ 0,25M protein tan it, protein BGC pha tan tổng hợp tốt nồng độ muối 0,35 M Vậy lựa chọn bổ sung thêm 0,35M NaCl vào môi trường biểu protein 3.3.3 Lựa chọn nhiệt độ biểu Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng vi sinh vật Trong giới hạn chịu nhiệt vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy thay đổi làm cho chuyển động phân tử tế bào thay đổi theo, làm thay đổi tốc độ phản ứng hóa sinh trình trao đổi chất tế bào phản ứng tổng hợp protein Đa số vi khuẩn E coli sinh trưởng tốt nhiệt độ 37oC nhiệt độ này, protease ảnh hưởng lớn đến khả sinh SV: Nguyễn Thị Thơm 42 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học tổng hợp protein Đối với chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp khả biểu gen dạng tan quan tâm hàng đầu Vì vậy, tiến hành nuôi cấy biểu chủng E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET22-bgc nhiệt độ khác nhau: 20oC; 25oC; 28oC; 30oC; 37oC môi trường LBA có bổ sung 0,35 M NaCl; 0,5 M sorbitol; 0,02% tween, cảm ứng 0,5 mM IPTG xác định nhiệt độ tối ưu để thu protein tái tổ hợp nhiều Sau nuôi cấy, tiến hành thu sinh khối tế bào cách ly tâm 6000 vòng/ phút 10 phút Sau tế bào đưa OD600= 10 xử lý cách siêu âm tần số cao Kết kiểm tra cách điện di gel polyacrylamide 12,6% (Hình 15) 20oC ĐC (-) kDa TS T M TS T KT 25oC TS T KT TS 28oC T KT 30oC 37oC TS T KT TS T KT 116.0 66.2 45.0 52,47 35.0 25.0 18.4   Hình 15 Phân tích protein biểu tế bào E coli BL21 nhiệt độ khác M: Protein chuẩn (Fermentas) TS: protein tổng số T: Protein pha tan KT: Protein pha không tan (-): Dòng đối chứng âm (không cảm ứng IPTG) Quan sát ảnh điện di, thấy đường chạy dòng tế bào E coli BL21 mang gen bgc không cảm ứng IPTG (đối chứng âm) băng protein quan tâm không thấy xuất Trong đó, nhiệt độ khác nhau, lượng protein SV: Nguyễn Thị Thơm 43 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học biểu khác Ở nhiệt độ 20oC 25oC protein biểu Với nhiệt độ 30oC 37oC hàm lượng protein tổng số thu cao chủ yếu lại pha không tan protein tổng hơp nhanh nên không hoàn chỉnh mặt cấu trúc Chúng nhận thấy nhiệt độ 28oC mức độ biểu protein BGC tốt nhất, băng protein thu đậm BGC tổng hợp pha tan nhiều Do đó, chọn nhiệt độ tối ưu để cảm ứng biểu 28oC 3.3.4 Lựa chọn nồng độ IPTG IPTG chất cảm ứng cho hoạt động gen bgc điều khiển promoter T7 vector pET-22b(+) Đây chất cảm ứng nồng độ cao gây độc cho tế bào nên tiến hành khảo sát để tìm nồng độ IPTG tối ưu cho thí nghiệm biểu gen bgc tế bào E coli BL21(DE3) Chúng tiến hành khảo sát dải nồng độ IPTG từ 0,0 mM đến 2,0mM Chủng E coli BL21 tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LBA có bổ sung thêm 0,5M NaCl, 0,5M sorbitol, 0,02% tween điều kiện 28oC, lắc 200 vòng/ phút Sau nuôi cấy, tiến hành đo OD600 thu mẫu kết hình 16 Kết (Hình 16) cho thấy mẫu có IPTG nồng độ thấp 0,05 mM làm sinh khối tế bào giảm đáng kể (khoảng gần lần) Điều chứng tỏ sản phẩm biểu gen làm xáo trộn đến khả trao đổi chất cho sinh trưởng tế bào dẫn đến tế bào sinh trưởng Trên thực tế, nhiều protein độc biểu tế bào đến mức độ gây chết tế bào Các gen mã hóa protein độc cho tế bào muốn tổng hợp tốt chủng E coli chúng thường biểu dạng lai hay dạng dung hợp (fusion) với phân tử protein mang để làm giảm độc tính SV: Nguyễn Thị Thơm 44 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học   Hình 16. Đồ thị thể giá trị OD600 thu mẫu Tế bào thu lại cách ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút 10 phút Sau đó, đưa OD600= 10 xử lý sóng siêu âm Kết điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6% ( Hình 17) Tổng số kDa Tan (-) M 0,0 0,02 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,8 1,0 1,5 1,2 (-) 0,0 M 0,02 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,8 1,0 1,5 1,2 116.0 66.2 BGC 45.0 35.0 25.0 18.4   Hình 17. Phân tích protein biểu E coli BL21 mang gen bgc nồng độ IPTG khau 0,0-2,0 mM: Nồng độ IPTG cảm ứng M: Protein chuẩn (Fermentas) SV: Nguyễn Thị Thơm 45 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học Quan sát ảnh điện di, thấy đường chạy không cảm ứng (ĐC âm) không thấy xuất băng protein quan tâm Khi cảm ứng IPTG nồng độ 0,02 mM, nồng độ IPTG thấp nên không thấy băng protein BGC Từ nồng độ 0,05 mM trở lên thấy xuất băng protein 52,47 kDa tương ứng với kích thước protein BGC theo tính toán lý thuyết Hàm lượng protein biểu tương đương cảm ứng nồng độ 0,2 mM đến mM IPTG Kết kiểm tra pha tan cho thấy cảm ứng nồng độ 0,02 mM đến 0,1 mM lượng protein tan ít, khó quan sát Băng protein quan tâm xuất cảm ứng nồng độ 0,2 mM trở lên nhiên hàm lượng protein thấp Chúng chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM băng protein BGC tan thu đậm Với kết thu từ khảo sát trên, lựa chọn điều kiện tối ưu để biểu gen bgc mã hóa cho enzyme beta-glucosidase tế bào E coli BL21(DE3): biểu môi trường LBA có bổ sung 0,5 M NaCl, 0,5M sorbitol, 0,02% tween; nhiệt độ 28oC; nồng độ IPTG cảm ứng 0,5 mM 3.4 KIỂM TRA SƠ BỘ HOẠT TÍNH CỦA ΒETA -GLUCOSIDASE Sau tối ưu điều kiện biểu biểu thành công protein BGC, tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme β-glucosidase Do βglucosidase thủy phân tốt chuỗi ngắn đường để thành đường đơn, vậy, sử dụng CMC chất dùng endoglucanase để cắt nhỏ chuỗi cellulose để làm chất cho β-glucosidase Trong mẫu đối chứng âm, dịch protein chứa EGC thay dịch protein dòng đối chứng âm không mang gen   Hình 18. Kết sơ kiểm tra hoạt tính enzyme SV: Nguyễn Thị Thơm 46 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học   Hình 19. Đồ thị thể hàm lượng đường khử giải phóng  Hình 18 cho thấy rằng: màu sắc hai ống nghiệm chứa enzyme endoglucanase beta-glucosidase chuyển sang màu đỏ nâu chứng tỏ enzyme có hoạt tính thủy phân chất CMC thành đường đường bị khử DNS tạo thành 3amino 5-nitrosalicylic có màu đỏ nâu Tuy nhiên, ống nghiệm chứa đồng thời enzyme có màu đậm chứng tỏ lượng đường khử tạo nhiều hơn, hoạt tính enzyme mạnh so với ống nghiệm chứa endoglucanase Điều thể beta-glucosidase có hoạt tính làm tăng hoạt tính thủy phân chung Trong ống nghiệm chứa đối chứng âm (không bổ sung enzyme) màu vàng hỗn hợp phản ứng không thay đổi Đồng thời hàm lượng đường khử thu (Hình 19) thể rõ điều Lượng đường khử giải phóng từ hỗn hợp phản ứng chứa enzyme cao nhiều so với mẫu chứa enzyme Như vậy, gen bgc biểu pha tan tế bào E coli tái tổ hợp BGC có hoạt tính sinh học SV: Nguyễn Thị Thơm 47 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học KẾT LUẬN   Với kết thu trình thực đề tài, rút số kết luận sau: Thiết kế thành công vector biểu pET-22b(+) mang gen bgc Gen bgc biểu thành công tế bào E coli BL21, phần protein biểu pha tan Điều kiện tối ưu để BGC tổng hợp pha tan là: Biểu protein BGC môi trường LBA có bổ sung chất 0,5M sorbitol, 0,35M NaCl, 0,02% tween, 0,5mM IPTG 28oC Beta-glucosidase tái tổ hợp có hoạt tính sinh học SV: Nguyễn Thị Thơm 48 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học KIẾN NGHỊ   Nghiên cứu tinh protein tái tổ hợp thu Xác định đặc điểm tính chất enzyme BGC.  SV: Nguyễn Thị Thơm 49 K18.CNSH.11-02  Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Lübeck P.S Ahring B.K (2013) Fungal Beta-Glucosidases: A Bottleneck in industrial use of lignocellulosic materials Biomolecules, 3(3), 612–631 Tiwari P., Misra B.N., Sangwan N.S (2013) ߚ-Glucosidases from the Fungus Trichoderma: An Efficient Cellulase Machinery in Biotechnological Applications BioMed Res Int, 2013, e203735 Judit Krisch, Miklós Takó, Tamás Papp et al (2013) Characteristics and potential use of β-glucosidases from Zygomycetes 288(25), 18325–18334 Jeng W.-Y., Wang N.-C., Lin M.-H.et al (2010) Structural and functional analysis of three beta-glucosidases from bacterium Clostridium cellulovorans, fungus Trichoderma reesei and termite Neotermes koshunensis JStructBiol, 173, 46–56 Uchiyama T., Miyazaki K., Yaoi K (2013) Characterization of a novel βglucosidase from a compost microbial metagenome with strong transglycosylation activity J Biol Chem, 288(25), 18325–18334 Taku Uchiyama, Kentaro Miyazaki, Katsuro Yaoi (2013) Characterization of a Novel β-Glucosidase from a Compost Microbial Metagenome with Strong Transglycosylation Activity Dan S., Marton I., Dekel M.et al (2000) Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase J Biol Chem, 275(7), 4973–4980 Bhatia Y., Mishra S., Bisaria V.S (2002) Microbial beta-glucosidases: cloning, properties, and applications Crit Rev Biotechnol, 22(4), 375–407 Takó M., Tóth A., G Nagy L.et al (2010) A new beta-glucosidase gene from the zygomycete fungus Rhizomucor miehei Antonie Van Leeuwenhoek, 97(1), 1–10 10 Yamada R., Nakatani Y., Ogino C et al (2013) Efficient direct ethanol production from cellulose by cellulase- and cellodextrin transporter-co-expressing Saccharomyces cerevisiae AMB Express, 3, 34 11 Kuhad R.C., Gupta R., Singh A (2011) Microbial cellulases and their industrial applications Enzyme Res, 2011, 280696 12 Bishnu Joshi M.R.B (2011) Lignocellulosic ethanol production: current practices and recent developments Biotechnol Mol Biol Rev, 6, 172–182 13 Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A et al (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277(5331), 1453–1462 SV: Nguyễn Thị Thơm 50 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học 14 Dashtban M., Maki M., Leung K.T et al (2010) Cellulase activities in biomass conversion: measurement methods and comparison Crit Rev Biotechnol, 30(4), 302–309 15 Dashtban M., Maki M., Leung K.T et al (2010) Cellulase activities in biomass conversion: measurement methods and comparison Crit Rev Biotechnol, 30(4), 302–309 16 Lu S.-C Lin S.-C (2012) Recovery of active N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase from inclusion bodies by solubilization with non-denaturing buffers Enzyme Microb Technol, 50(1), 65–70 17 Georgiou G Valax P (1996) Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol, 7(2), 190–197 18 Prasad S., Khadatare P.B., Roy I (2011) Effect of chemical chaperones in improving the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli Appl Environ Microbiol, 77(13), 4603–4609 19 Lee S.-H., Carpenter J.F., Chang B.S et al (2006) Effects of solutes on solubilization and refolding of proteins from inclusion bodies with high hydrostatic pressure Protein Sci Publ Protein Soc, 15(2), 304–313 SV: Nguyễn Thị Thơm 51 K18.CNSH.11-02 [...]... Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở hệ điều khiển promoter mạnh có nguồn gốc từ bacteriophage T7 Gen ngoại lai dưới sự phiên mã của T7 ARN polymerase Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET- 22b(+) làm vector biểu hiện Vector pET- 22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E coli Về cấu tạo, vector. .. tính của enzyme beta- glucosidase 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN BGC MÃ HÓA BETAGLUCOSIDASE Gen bgc kích thước 1437 bp mã số GL0128938 trong dữ liệu giải trình tự metagenome của vi sinh vật ruột mối do phòng Kỹ thuật di truyền thực hiện đã được phân lập và tách dòng vào vector pBluescirpt SK(+) Trong công trình nghiên cứu này, gen bgc được khuếch đại từ vector pBlue -bgc bằng PCR, sử dụng cặp... 28 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN   Để biểu hiện được protein tái tổ hợp BGC trong E coli với lượng lớn và có hoạt tính tốt chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu qua các bước sau: - Thiết kế vector biểu hiện pET- 22b(+) mang gen bgc mã hóa betaglucosidase - Biểu hiện gen bgc trong E coli BL21 - Lựa chọn điều kiện biểu hiện BGC - Kiểm tra sơ... này mà E coli BL21 đã trở SV: Nguyễn Thị Thơm 12 K18.CNSH.11-02 Khóa luận tốt nghiệp  Khoa Công nghệ sinh học thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase) 1.3.3.2 Vector biểu hiện pET- 22b(+) Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép thực hiện sự phiên mã của... Chủng E coli DH10B ( Invitrogen) kiểu gen: F– mcrA Δ (mrr-hsdRMSmcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL nupG λ– sử dụng trong thí nghiệm để tách dòng gen - Chủng E coli BL21(DE3) ( Invitrogen) kiểu gen: F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) -sử dụng trong thí nghiệm để biểu hiện gen - Plasmid pBlue -bgc là plasmid pBluescript... chuyển hóa sắc tố [2] Beta- glucosidase còn được nghiên cứu để ứng dụng trong quá trình chuyển hóa cellulose Beta- glucosidase phân cắt cellooligosaccharide đặc biệt là sự thủy phân cellobiose để tạo thành đường glucose Ngoài ra, beta- glucosidase cũng làm giảm sự ức chế của sản phẩm trên cellobiohydrolase và endoglucanase, đó là hai enzyme chính chịu trách nhiệm cho sự phân cắt, chuyển hóa cellulose SV:... UDP-galactose, cắt cụt màng LPS và cho phép đoạn DNA dễ xâm nhập hơn 1.3.3 Biểu hiện gen trong E coli Hiện nay có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện gen như: E coli, B subtilis, nấm men (S cerevisiae), tế bào động vật và tế bào thực vật Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc chọn lựa hệ biểu hiện và vector biểu hiện phù hợp là quan trọng và cần thiết Trong đó E coli. .. dịch mã các mARN của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai Vector có thể là ADN plasmid, phage hay cosmid Đây là những phân tử ADN có khả năng nhân đôi, phiên mã, dịch mã độc lập với vật chủ Ngoài ra, vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc Gen thường được sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh Gen này... cắt của enzyme hạn chế NcoI và XhoI Vì vậy sản phẩm PCR sẽ chứa các trình tự enzyme hạn chế này ở hai đầu tận cùng 5’ và 3’ Sau đó vector pET- 22b(+) và sản phẩm PCR gen bgc được cắt bằng cặp enzyme hạn chế NcoI +XhoI Sản phẩm cắt được tinh chế bằng cột Qiagen Vector và gen được nối lại bằng enzyme T4-DNA ligase (Hình 4) Gen trong vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng enzyme hạn chế Sau đó vector tái... protease nội bào) và ompT protease (một protease ngoại bào) nên khả năng protein bị phân hủy giảm đáng kể Như vậy cả protease nội bào và ngoại bào ở E coli BL21 đều bị bất hoạt Ngoài những đặc điểm trên thì trong DNA hệ gen của E coli BL21 có chứa đoạn gen mã hóa cho T7 ARN polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E coli BL21 đặt dưới sự điều khiển của promoter