Nghiên cứu thiết kế VECTOR biểu hiện và biểu hiện gen mã hóa PROTEASE SENP2 trong ESCHERICHIA COLI

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ̴***̴ KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆ ỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT TK KẾ VECTOR BIỂU HIỆN VÀ BIỂU HIỆN N GEN MÃ HÓA PROTEASE SENP2 TRONG ESCHERICHIA COLI Ngườ ời hướng dẫn: TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực th hiện: Trần Thị Thanh Tuy Tuyền Lớp: p: 1102 K18 Hà Nội 2015 Nghiên cứu thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa protease SENP2 Escherichia Coli LỜI CẢM ƠN Không có thành công cá nhân mà hỗ trợ, giúp đỡ đóng góp người khác Trong suốt thời gian thực tập tại:Phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, em nhận hướng dẫn giúp đỡ thầy cô phòng Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS.Đỗ Thị Huyền – Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, NCS Lê Ngọc Giang tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt thời gian em thực tập hoàn thành khóa luận Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện thời gian để em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn GS Trương Nam Hải toàn thể cán nghiên cứu, phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện, tận tình sát bảo, chia sẻ kinh nghiệm cho em lời khuyên quý báu công việc sống Và cuối cùng, tình cảm chân thành yêu mến em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình người thân, người ủng hộ, động viên tạo cho em điều kiện tốt tinh thần vật chất suốt thời gian học tập thực tập Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên thực Trần Thị Thanh Tuyền Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Nghiên cứu thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa protease SENP2 Escherichia Coli MỤC LỤC MỞ ĐẦU MỤC TIÊU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan SUMO protease SENP2 1.1.1 Giới thiệu chung SUMO-3 protein ứng dụng làm protein dung hợp4 1.1.2 Giới thiệu chung SUMO protease ứng dụng loại bỏ protein dung hợp khỏi protein đích 1.1.3 Cấu trúc, chức ứng dụng SENP2 công nghệ sinh học 1.2 Hệ biểu E coli 10 1.2.1 Đặc điểm vector biểu 10 1.2.2 Vector biểu pET22b(+) 11 1.2.3 Chủng biểu E coli BL21 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid 15 2.1.2 Hóa chất, enzyme 15 2.1.3 Máy móc 15 2.1.4 Các môi trường dung dịch sử dụng 15 2.1.4.1 Môi trường dùng biến nạp nuôi cấy 15 2.1.4.2 Dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid 16 2.2 Phương pháp 17 2.2.1 Phương pháp biến nạp DNA vào E coli phương pháp sốc nhiệt 17 2.2.2 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 18 2.2.3 Điên di DNA gel agarose 19 2.2.4 Phản ứng cắt plasmid DNA enzym hạn chế 21 2.2.5 Tinh DNA từ gel agarose cột Qiagen tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất 21 2.2.6 Phản ứng nối ghép gen 21 Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Nghiên cứu thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa protease SENP2 Escherichia Coli 2.2.7 Biểu gen 22 2.2.8 Điện di protein gel polyacrymide-SDS 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kiểm tra gen senp2 pUC57-senp2 enzyme hạn chế 26 3.2 Thiết kế vector biểu pET22b(+)-senp2 28 3.2.1 Tinh sản phẩm cắt senp2, pET22 kit QIAGEN 29 3.2.2 Nối ghép gen senp2 vào vector biểu pET22b(+) 30 3.2.3 Cắt kiểm tra pET22b(+)-senp2 enzyme hạn chế 31 3.2.3.1.Kiểm tra pET22b(+)-senp2 EcoRV 31 3.2.3.2 Kiểm tra vector pET22b(+)-senp2 enzyme PstI 32 3.2.3.3 Kiểm tra pET22b(+)-senp2 enzyme hạn chế NcoI XhoI 33 3.3 Biểu pET22b(+)-senp2 BL21 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Nghiên cứu thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa protease SENP2 Escherichia Coli DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair (cặp bazơ) Amp Ampicillin DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl-β-D-l-thiogalactopyranoside LB Luria-betani medium MCS Mutiple cloning site TAE Tris acetate EDTA SDS Sodium dodecyl sulphate dH2O Distilled water (nước khử trùng) v/p Vòng / phút M Mol/l v/v Thể tích/thể tích SUMO small ubiquitin-like modifier Ub Ubiquitin Ubl Ubiquitin-like Smt3 suppressor of mif two SENP2 SUMO-specific protease MBP maltose binding protein His6 maltose binding protein IL-11 Interleukin 11 Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Nghiên cứu thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa protease SENP2 Escherichia Coli DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình So sánh trình tự ubiquitin SUMO nấm men người Hình Cấu trúc không gian SUMO1 SUMO2/3 Hình Cấu trúc bậc Ubiquitin SUMO-1 Hình Phức hợp enzyme-cơ chất SENP SUMO-1 Hình Cấu trúc bậc SENP2 Hình Trình tự amino acid SENP2 Hình Bản đồ vector pUC57 Hình Bản đồ vector pET22b(+) Hình Sơ đồ chế kiểm soát biểu gen chất cảm ứng IPTG Hình 10 Sơ đồ thí nghiệm Hình11 Kết điện di dòng pUC57-senp2 gel agarose 0,8% Hình12 Sơ đồ vị trí enzyme giới hạn kết cắt kiểm tra pUC57-senp2 enzyme NcoI XhoI Hình 13 Điện di kiểm tra đoạn gen tinh chế cột Qiagen Hình 14 Kết điện di tách chiết dòng mang vector pET22b(+)-Senp2 Hình 15 Sơ đồ kết cắt kiểm tra pET22b(+)-Senp2 enzyme EcoR V Hình 16 Sơ đồ vị trí enzyme giới hạn kết cắt pET22-Senp2 enzyme Pst I Hình 17 Sơ đồ kết điện di sản phẩm cắt pET22-Senp2 enzyme NcoI XhoI Hình 18 Kết biến nạp pET22b(+)-Senp2 vào tế bào BL21 Hình 19 Phân tích chọn dòng BL21 pET22b(+)-Senp2 Hình 20 Phân tích kết biểu protein dòng E coli BL21 gel polyacrymide Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 MỞ ĐẦU Với đời công nghệ DNA tái tổ hợp từ năm 1970, protein bắt đầu biểu nhiều dạng tái tổ hợp tế bào vi sinh vật cách nhanh thuận tiện so với nguồn tự nhiên Trong năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống sinh học ngày ứng dụng rộng rãi Trong đó, “nhà máy” vi khuẩn lựa chọn sử dụng nhiều ưu điểm chi phí thấp, sinh khối lớn tốc độ sản xuất nhanh Chủng biểu Escherichia coli chủng sử dụng rộng rãi nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp Ưu điểm hệ biểu E coliđó làsinh trưởng nhanh môi trường rẻ tiền, dễ thao tác protein tái tổ hợp không bị biến đổi sau dịch mã.Tuy nhiên, điểm hạn chế hệ thống vật chủ protein ngoại lai có nguồn gốc xa với chủng biểu (ví dụ protein sinh vật bậc cao) thường biểu dạng thể vùi, dễ bị protease chủng chủ phân cắt Có tới 75% protein người biểu thành công E coli có 25% protein tái tổ hợp dạng tan Để khắc phục nhược điểm nhà khoa học thường biểu protein dạng dung hợp với protein khác có chức chaperon để bảo vệ protein tái tổ hợp làm tăng khả cuộn xoắn protein protein tổng hợp có chức sinh học Có nhiều loại protein dung hợp: maltose binding protein (His6), maltose binding protein (MBP), Small ubiquitin-like modifer (SUMO), Ubiquitin (Ub) Green fluorescent protein (GFP), Các protein dung hợp thiết kế sẵn vector biểu SUMO (là protein thuộc họ ubiquitin tìm thấy sinh vật nhân thật nấm men hay động vật có xương sống) sử dụng phổ biến để biểu protein đích dạng dung hợp, đặc biệt protein khó biểu Trong có SUMO-3 nguồn gốc từ người protein thường dung hợp với protein đích để làm tăng khả biểu protein đích trongE coli Trên thực tế nghiên cứu ứng dụng protein người để đánh giá tính chất protein đích, protein dung hợp bắt buộc phải cắt bỏ để giải phóng protein đích Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Để cắt bỏ protein SUMO-3 khỏi protein dung hợp, nhà nghiên cứu đưa trình tự nhận biết điểm cắt đặc hiệu protease dùng enzyme SENP2 có nguồn gốc từ người có khả nhận biết SUMO-3 qua cấu trúc bậc bốn phân tử cắt vị trí đặc hiệu nên có ưu điểm không cắt vào protein đích Enzyme SENP2 có hoạt tính khoảng pH nhiệt độ rộng nên thuận lợi cho việc ứng dụng Hiện nay, giá thành nhập SUMO protease SENP2 (gọi tắt SENP2) đắt.Vì vậy, để có SENP2 sản xuất nước, phòng kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học tiến hành sản xuất SENP2 tái tổ hợp E coli Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành nghiên cứu: Thiết kế vector biểu biểu gen mã hóa SENP2 Escherichia Coli Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 MỤC TIÊU Mục tiêu thực đề tài: - Thiết kế thành công vector pET22b(+) mang gene senp2 - Biểu thành công SENP2 E coli BL21 Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan SUMO protease SENP2 1.1.1 Giới thiệu chung SUMO-3 protein ứng dụng làm protein dung hợp SUMO (small ubiquitin-like modifier) nằm nhóm Ubiquitin-like modifier, thuộc họ Ubiquitin (Ub) Ubiquitin-like (Ubl).Chúng tìm thấy tế bào nhân thật từ nấm men người có khối lượng phân tử khoảng 8-11 kDa SUMO protein dung hợp thường dùng để biểu protein khó biểu Có khả gắn với protein đích liên kết isopeptide ubiquitin lysine protein đích [1] SUMO tham gia vào nhiều trình tế bào như: chết theo chu trình (apoptosis), vận chuyển nhân bào, điều hòa trình phiên mã, truyền tín hiệu, phản ứng điều kiện stress kích thích chu trình tế bào, ổn định protein [1] Ở nấm men Saccharomyces cerevisiae chứa gen SUMO có tên Smt3 (suppressor of mif two 3)[2]đóng vai trò trình hình thành vòng septin, phân chia nhiễm sắc thể thúc đẩy chu trình tế bào qua G2-M[1] Hình 1: So sánh trình tự ubiquitin SUMO nấm men người: Các gốc amino acid tương đồng (tô đậm) gốc có đặc điểm tương tự (tô nhạt) Hình kéo nơi SUMO bị cắt để trở thành dạng có hoạt tính sinh học [1] Ở động vật có vú mang gen SUMO là: SUMO-1, SUMO-2 SUMO-3 Trong đó, SUMO-2 SUMO-3 có 43% 42% gốc amino acid tương đồng với SUMO-1, lại có độ tương đồng cao với lên tới 96%, chúng khác acid aminN-terminal có chức phân biệt Trần Thị Thanh Tuyền Lớp 1102 K18 Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm Trần Thị Thanh Tuyền 25 Lớp 1102 K18 3.1 Kiểm tra gen senp2 pUC57-senp2 enzyme hạn chế Sau đưa gen vào pUC57, pUC57-senp2 biến nạp vào tế bào E coli DH10B pUC57 vector tách dòng có trình tự nucleotide xác định đầy đủ, có khả tự chép tế bào chủ Vector phát triển từ plasmid pUC19, có kích thước nhỏ so với vector tách dòng hệ trước với nhiều cải tiến phù hợp cho việc tách dòng Đây loại vector tách dòng dùng phổ biến cho việc tách dòng gen Để tạo dòng gen mong muốn, tiến hành biến nạp pUC57- senp2 vào tế bào E coli DH10B phương pháp sốc nhiệt, sử dụng máy di truyền tế bào chủ để chép dòng gen hành số lượng lớn, sau tách chiết dòng gen để kiểm tra Để trình biến nạp hiệu cao, tiến hành tạo tế bào khả biến E coli DH10B Nguyên lý để tạo tế bào khả biến tác dụng CaCl2 thành tế bào vi khuẩn thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA chui qua lỗ màng tế bào vào tế bào chất thay đổi nhiệt độ cách đột ngột Chi tiết bước cụ thể phương pháp tạo tế bào khả biến trình biến nạp sốc nhiệt trình bày phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Tế bào sau biến nạp cấy trải môi trường chọn lọc LB đặc có bổ sung ampicillin ủ qua đêm 37oC Theo chế chọn lọc kháng sinh, dòng tế bào E coli nguyên thủy bị tiêu diệt môi trường chứa kháng sinh Chỉ dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn có khả sinh trưởng môi trường chọn lọc Để chọn lọc dòng mang gen mong muốn, tiến hành tách plasmid từ số dòng E coli tái tổ hợp cắt kiểm tra enzyme hạn chế Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa nguyên lý sử dụng hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn biến tính phân tử protein Khi thay đổi giá trị pH dịch chiết tế bào dung dịch có chứa kali acetat, phân tử protein DNA hệ gen bị kết tủa lại ethanol Lượng RNA tồn dung dịch chứa DNA plasmid loại bỏ cách bổ sung RNase Trần Thị Thanh Tuyền 26 Lớp 1102 K18 Các dòng mang gen senp2 chọn lọc cấy chuyểnn vào môi trường tr LB lỏng có bổ sung Amp ti tiến hành tách chiết DNA plasmid Sau tách chi chiết tiến hành kiểm m tra b phương pháp điệnn di gel agarose Quy trình chi tiết phương ng pháp tách chiết DNA plasmid phương ng pháp đđiện di gal agarose đượcc trình bày phần ph vật liệu phương pháp nghiên ứu Chúng tiếnn hành cấy chuyển tách chiếtt dòng Sau điện di gel agarose kết hình11 hình Hình 11: Kếết điện di dòngpUC57-senp2trên gel agarose 0,8% Phân tích kết đường điện di đồ cho thấy, đường ng chạy ch 1,2,3 xuất băng ăng hai dạng cấu trúc cuả plasmid Trong rong plasmid đường chạy số sáng rõ hhơn Riêng đường chạy thứ xuất băng không rõ rệt Như vậy, y, t chọn dòng để tiến hành cắtt ki kiểm tra Plasmid tái tổ hợp p pUC57-senp2 pUC57 cắt kiểm tra cặpp enzyme hhạn chế NcoI XhoI Đây cặp p enzyme thiết kế nằm hai đầu senp2 để đưa gen vào vector biểu Theo tính toán lý thuy thuyết, xử lý ng hai enzyme NcoI XhoI plasmid đượcc cắt c đoạn DNA nhìn thấyy bbản gel điện di: đoạn thứ nhấtt có kích thước thư gen senp2 (0,7 kb) đoạnn th thứ hai có kích thước ng kích thước thư vector (2,7kb) Trần Thị Thanh Tuyền 27 Lớp 1102 K18 Thí nghiệm cắtt kiểm ki tra thực theo quy trình đãã trình bày phần vật liệu phương ương pháp nghiên cứu c Sản phẩm cắt chạyy đđiện di gel agarose 0,8% (hình12) Hình 12: Sơ đồ vị trí enzyme giới gi hạn kết cắt kiểm tra pUC57-senp2 pUC57 enzyme NcoI XhoI Phân tích kết điện di đồ cho thấy, đường chạyy xu xuất băng kích thướ ớc tính toán Như vậy, khẳng định nh dòng tế bào mang pUC57-senp2 3.2 Thiết kế vector biểu u hi pET22b(+)-senp2 Vector pUC57 chỉỉ thiết kế cho mục đích tách dòng, òng, kh khả biểu protein ngoạii lai Do đó, tiến hành chuyển gen senp2 từ vector sang vector biểu n pET22b(+) m vector có nhiều ưu điểm m cho vi việc biểu gen ngoại lai gen lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiệnn gen ngo ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu u với v RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm cắt multicloning site, điểm m khởi kh đầu tái f1, gen chọn lọcc (gen kháng kháng sinh Amp) Ngoài ra, vector vect pET22b(+) có trình tự tiết Pel elB giúp protein ngoại lai tiếtt khoang chu chất ch Sau vào khoang chu chấtt đoạn peptide Trần Thị Thanh Tuyền 28 Lớp 1102 K18 tín hiệu bị cắt protease xác định Để thực phản ứng nối ghép gen senp2 vào vector pET22b(+), tiến hành cắt gen vector cạp enzyme hạn chế NcoI XhoI, tinh chế sản phẩm cắt kit QIAGEN Sau tiến hành phản ứng nối ghép nhờ enzyme T4-DNA ligase Sản phẩm nối ghép gen tiến hành cắt kiểm tra enzmye giới hạn 3.2.1 Tinh sản phẩm cắt senp2, pET22 kit QIAGEN Như phần tách dòng gen đề cập, gen senp2 giớ hạn cặp enzyme hạn chế NcoI XhoI hai đầu đoạn gen Vì vậy, việc thu đoạn gen trở nên đơn giản sử dụng hai enzyme Đồng thời, để tiến hành nối ghép gen senp2 vào vector biểu pET22b(+) vector cắt cặp enzme NcoI XhoI để tạo đầu dính bổ sung Theo đồ enzyme hạn chế vector pET22khi cắt vector cặp enzyme thu vector có kích thước 5431bp Do vậy,chúng tiến hành cắt song song vector pUC57senp2 vector pET22b(+) cặp enzyme hạn chế NcoI XhoI Sau enzyme cắt hoàn toàn, tiến hành thu tinh gen vector pET22b(+) cách cho qua cột Qiagen hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm sau tinh điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (hình 13) sử dụng cho phản ứng nối ghép gen Trần Thị Thanh Tuyền 29 Lớp 1102 K18 Hình 13: Điệnn di kiểm ki tra đoạn gen tinh chế ng ccột Qiagen M: DNA chuẩn Kết điệnn di đồ cho thấy, đường chạy củaa pET22b(+) xu xuất băng sáng rõ õ có kích thước th khoảng 5431bp vớii tính toán, ch chứng tỏ vector cắt thu hồii thành công Mặt M khác, gen senp2 đượcc thu hồi h thành công sau tinh ch qua ccột Qiagen nên đường chạy củaa senp2 DNAtập trung thành băng ng có kích thước th 0,7kb tính toán lýý thuy thuyết 3.2.2 Nối ghép gen senp2 vào vector biểu pET22b(+) Sau cắt đồng ng th thời vector biểu pET22b(+) gen senp2 cặp enzyme hạn chế NcoII XhoI, thu tinh cộtt Qiagen, ti tiến hành phản ứng nối ghép hép nhờ nh tác dụng enzyme T4-AND AND ligase Vector tái ttổ hợp thu sau phản ứng ứ có tên pET22b(+)-senp2 Phản ứng nốii ghép gen trình bày cụ thể phầần vật liệu phương pháp nghiên cứu Sản phẩm củaa phản ph ứng nối ghép gen biến nạpp vào ttế bào E coli DH10B phương ng pháp sốc s nhiệt Để có dòng đối chứng, ng, biến nạp vector pET22b(+) nguyên vẹn v ban đầu vào chủng E coli DH10B Các sản phẩm biến nạp chọn lọcc dựa d chế kháng sinh Chỉ có ng khu khuẩn lạc có Trần Thị Thanh Tuyền 30 Lớp 1102 K18 chứa vector pET22b(+)-ssenp2 pET22b(+) nguyên vẹn mớii có th thể sống môi trường ng có Amp nh nhờ hoạt động củaa gen kháng kháng sinh vector Sau biến nạp, ti tiến hành tách chiết DNA dòng tế bào ch chạy điện di gel agarose 0,8% (hình (hình14) Hình 14: Kết điện đ di tách chiếtt dòng mang vector pET22b(+)-senp2 pET22b(+) (-) đường chạyy c plasmid pET22b(+) 1-5 đường chạyy c plasmid pET22b(+)-senp2 tách từ khuẩn lạcc ccủa dòng khác Kết cho thấyy ccả dòng plasmid tái tổ hợp tách chiếtt có kích th thước lớn vector đối chứng ng pET22b(+) Như Nh vậy, plasmid mang gen senp2.Để chắn, n, tiến ti hành cắt kiểm tra gen senp2 plasmid enzyme hạn chếế 3.2.3 Cắt kiểm m tra pET22b(+)-senp2 pET22b(+) enzyme hạn chế 3.2.3.1 Kiểm m tra pET22b(+)-senp2 pET22b(+) EcoRV Để kiểm tra gen senp2 vector pET22b(+), đầuu tiên ti tiến hành phản ứng cắt ng enzyme EcoRV Phân tích sơ đồ vị trí enzyme gi giới hạn vector pET22b(+)-senp2,, nh nhận thấy có hai điểm nhận biết enzyme enzymenàyđó vị trí 732 gen 2185 vector pET Theo tính toán lý thuyết, t, xxử lý enzyme này, kết điệện di gel agarose xuất hai vạch ch bbăng có kích thướcc 1462bp 4652 bp Trần Thị Thanh Tuyền 31 Lớp 1102 K18 Hình 15: Sơ đồ kếtt qu cắt kiểm tra pET22b(+)-senp2 ng enzyme EcoRV Kết cho thấy y hai đường chạy xuất hiệnn hai vvạch băng Vạch cao nhấtt có kích thước~4,7kb thư vạch băng thấp nhấtt có kích th thước~1,5kb, phù hợp với kích thước nh tính toán ban đầu 3.2.3.2 Kiểm m tra vector pET22b(+)-senp2 pET22b(+) enzyme PstI Phân tích sơ đồ đ enzyme giới hạn, nhận thấyy gen vector có điểm nhận biết củaa enzyme Do đó, cắt cho kết điện di đồ hai vạch băng ng có kích thước thư 1537 bp 4577 bp Kết điện di kiểểm tra sản phẩm cắt mà thu đượ ợc giống tính toán (hình 16) Trần Thị Thanh Tuyền 32 Lớp 1102 K18 Hình 16: Sơ đồ vị trí enzyme gi giới hạn kết cắt pET22-Senp2 Senp2 bbằng enzyme Pst I Như vậy, phản ứng ứ cắt thứ hai kết thu mong muốn, mu khẳng ng định gen senp2 đượcc lai ghép thành công vào vectorpET22b(+) 3.2.3.3 Kiểm m tra pET22b(+)-senp2 pET22b(+) enzyme hạn chế NcoII XhoI Để kiểm m tra m cách xác nữa, tiếnn hành ki kiểm tra cặp ezyme hạn chế NcoI XhoI.Như đề cập trước, ccặp enzyme có trình tự nhận biết hai đầu đ đoạn gen đích.Do vậy, cắt cặpp enzyme kết thu điệện di đồ hai băng, băng có kích thướcc đ kích thước gen (0,7kb)) m băng vector pET có kích thước 5,4kb 5,4kb Sau thực hiệnn phản ph ứng cắt 37oC thời gian 30-45 45 phút phút, tiến hành điện di sản pẩm m ccắt gel agarose 0,8% Phân tích kếtt quả, qu nhận thấy có hai vạch băng ng có kích thước thư dự tính ban đầu (hình 17) Hình 17: Sơ đồ kếtt qu điện di sản phẩm cắt pET22-Senp2 ng enzyme NcoI XhoI Từ kết củaa ba thí nghiệm nghi trên, khẳng định nh gen senp2 nốii gép thành công vào vector pET22b(+) Như Nh vậy, tiếnn hành bbước biểu n SENP2 chủng ch E coli BL21 Trần Thị Thanh Tuyền 33 Lớp 1102 K18 3.3 Biểu pET22b(+)-senp2 BL21 Trong biểu gen, bước quan trọng mà ta cần phải làm nuôi cấy thể biến nạp môi trường có chất cảm ứng promoter để protein tái tổ hợp tổng hợp Tiếp theo kiểm tra protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu, thường dùng phương pháp điện di protein tổng số để phát sơ băng protein tái tổ hợp Trong nghiên cứu mình, sử dụng chủng E coliBL21 để biểu gen senp2 Chủng đột biến gen tổng hợp protein nội bào ngoại bào nên sản phẩm protein tái tổ hợp tránh tình trạng bị protease tế bào chủ nhận biết cắt bỏ Để biểu gen senp2 BL21, tiến hành biến nạp pET22b(+)-senp2 vào BL21 phương pháp sốc nhiệt nhưđã trình bày cụ thể phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Sản phẩm biến nạp trải môi trường chọn lọc LBA nuôi cấy qua đêm 37oC (hình 18) Hình 18: Kết biến nạp pET22b(+)-Senp2 vào tế bào BL21 Gen senp2 vector tái tổ hợp pET22b(+)-Senp2 hoạt động điều khiển T7 promoter Promoter kiểm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG Trong nghiên cứu nuôi cấy dòng môi trường chọn lọc LBA, có chất cảm ứng IPTG để kiểm tra việc biểu gen ngoại lai.Các tế bào nuôi cấy qua đêm 2ml môi trường LBA (Amp 100µg/ml) Sau đó, tế bào hòa loãng vào môi trường LB lỏng có chứa Amp với tỉ lệ 1/100 thể tích so Trần Thị Thanh Tuyền 34 Lớp 1102 K18 với môi trường nuôi lắc điều kiện khoảng thờii gian 11-2 để OD600 đạt khoảng 0,6-0,8 0,8 Tiếp Ti theo, bổ sung IPTG đến nồng ng độ cuối 0,5mM chuyểnn sang cấy c lắc 30oC để cảm ứng tế bào tổng hợ ợp protein ngoại lai Nhiệt độ tạoo điều đ kiện thuận lợi cho phân tử protein ngo ngoại lai hình thành cấu trúc vớii tự t nhiên Sau khoảng giờ, tiếnn hành thu m mẫu, đo ODcác dòng điện n di protein ttổng số dòng này, kết thu đượcc nh hình(19) Hình19:: Phân tích chọn ch dòng BL21 pET22b(+)-senp2 enp2 Phân tích kết cho thấy, bốn đường chạy bốnn dòng E coli BL21 pET22b(+)-senp2 u xuất xu vạch băng đậm m rõ có kích th thước 27kDa tương ứng với kích thướ ớc protein gen senp2 mã hóa (SENP2) mẫu đối chứng vạch ch băng b Trong đó, đường chạy củaa m mẫu đối chứng không cảm ứng ng IPTG vvạch băng Trong dòng biểu điều u kiện ki giống OD thu đượcc khác T Từ số liệu đo OD thu ũng nh kết chạy điện di protein ein gel nhận thấy, dòng số có OD thu cao vạch băng xuất hiệnn ccũng đậm rõ Trần Thị Thanh Tuyền 35 Lớp 1102 K18 ba dòng lại i Vì vvậy, chọn dòng số để kiểm m tra ảnh hưởng nhiệt độ biểu n proetin E coli BL21 Chúng lựa chọn ch hai mức nhiệt độ để biểu hiệnn pET22b(+) pET22b(+)-senp2 BL21 20oC 37oC Sau phân tích kết chọnn dòng, tiến ti hành biểu nhiệt độ này.Các bước b biểu cụ thể đãã trình bày ph phần phương pháp vật liệuu nghiên cứu c Sau nuôi OD600 đạt khoảảng 0,6 đến 0,8 khoảng OD thích hợp để cảm ứng IPTG, cảm ứng ng vvới nồng độ 0,5 mM IPTG nuôi lắc 37oC sau tiến hành thu mẫu đoo OD, điện di protein pha tổng số,, tan không tan.Trong tan thí nghiệm chọn ch mẫu không cảm ứng IPTG làm mẫuu đối đ chứng.Kết điện di thể hình 20 Hình 20: Phân tích kếtt qu biểu protein dòng E coli BL21 gel polyacrymide M: protein chuẩn n T: protein thu tổng ng ssố S: protein thu dạng d tan I: protein thu dạng d không tan (-): Mẫu đốii chúng không cảm c ứng IPTG Phân tích kết thu nhận thấy rằng, hai nhiệt độộ thu vạch băng ng protein có kích th thước 27kDa Trong đó, protein tổng số 37oC cho vạch băng đậm nhiều ơn phù hợp h với kết OD thu được, 37oC OD600 6,35 20oC 2,59 Tuy nhiên, 37oC protein không tan, không xu xuất vạch Trần Thị Thanh Tuyền 36 Lớp 1102 K18 băng protein ngoại lai, ngược lại băng protein pha không tan đậm rõ Ở 20oC proetin có tan lượng SENP2 không rõ ràng Như vậy, thí nghiệm chưa biểu protein dạng tan mong muốn điều kiện biểu chưa phù hợp Vì cần có thí nghiệm thay đổi điều kiện biểu để lựa chọn điều kiện biểuhiện thích hợp để thu SENP2 dạng tan KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Thiết kế thành công vector biểu pET22 b(+)-senp2 SENP2 có kích thước 27 kDa biểu Bước đầu khảo sát điều kiện cho biểu senp2 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu đạt được, xin đưa số kiến nghị sau: Nghiên cứu biểu SENP2 điều kiện khác như: thay đổi số nhiệt độ, môi trường biểu biểu nồng độ IPTG khác để protein ngoại lai có khả biểu dạng tan cho hoạt tính sinh học cao Xác định hoạt tính sinh học SENP2 Thiết kế vector biểu khác có khả biểu protein cao vector pET32a(+) Trần Thị Thanh Tuyền 37 Lớp 1102 K18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Reverter D and Lima C.D (2004) A basis for SUMO protease specificity provided by analysis of human Senp2 and a Senp2-SUMO complex Struct Lond Engl 1993, 12(8), 1519–1531 Willson V (2009), SUMO Regulation of Cellular Processes, Springer Science & Business Media Malakhov M.P., Mattern M.R., Malakhova O.A., et al (2004) SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins J Struct Funct Genomics, 5(1-2), 75–86 Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., et al (2005) SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins Protein Expr Purif, 43(1), 1–9 Costa S., Almeida A., Castro A., et al (2014) Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system Front Microbiol, Coombs G.H (1991), Biochemical Protozoology As A Basis For Drug Design, CRC Press Huang Q., Li Q., Chen A.S., et al (2013) West Nile virus protease activity in detergent solutions and application for affinity tag removal Anal Biochem, 435(1), 44–46 Mótyán J.A., Tóth F., and Tőzsér J (2013) Research applications of proteolytic enzymes in molecular biology Biomolecules, 3(4), 923–942 Nallamsetty S., Kapust R.B., Tözsér J., et al (2004) Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro Protein Expr Purif, 38(1), 108–115 10 Waugh D.S (2011) An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags Protein Expr Purif, 80(2), 283–293 Trần Thị Thanh Tuyền 38 Lớp 1102 K18 11 Huang D.T and Schulman B.A (2006) Breaking up with a kinky SUMO Nat Struct Mol Biol, 13 12 Zhao Y., Gutshall L., Jiang H., et al (2009) Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells Protein Expr Purif, 67(2), 182–189 13 Ho-Sik Seok M.S (2013) A clustering method for next-generation sequences of bacterial genomes through multiomics data mapping Genes Amp Genomics, 36(2), 191–196 14 Grodberg J and Dunn J.J (1988) ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification J Bacteriol, 170(3), 1245–1253 15 MacWilliams M.P and Bickle T.A (1996) Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene EMBO J, 15(17), 4775–4783 16 Schnaitman C.A and Austin E.A (1990) Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations J Bacteriol, 172(9), 5511–5513 17 Bhagwat A.S., Sohail A., and Roberts R.J (1986) Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12 J Bacteriol, 166(3), 751–755 18 Moffatt BA, Dunn JJ, and Studier FW (1983) Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase Trần Thị Thanh Tuyền 39 Lớp 1102 K18 [...]... động của SENP2 đã được phòng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ sinh học thiết kế Để biểu hiện được gen senp2 trong E coli, chúng tôi đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: - Kiểm tra kích thước gen senp2 trong pUC57 bằng enzyme hạn chế - Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gene senp2 - Biểu hiện SENP2 trong E coli BL 21 ở một số điều kiện nhiệt độ khác nhau Toàn bộ quá trình thực hiện đề tài... tự amino acid của SENP2 1.2 Hệ biểu hiện E coli 1.2.1 Đặc điểm của vector biểu hiện Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã các gen được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong Escherichia coli Vector biểu hiện cần có đầy đủ các cấu trúc cần thiết sau: - Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật... phân tử và cắt tại vị trí đặc hiệu nên có ưu điểm là không cắt vào trong protein đích Enzyme SENP2 có hoạt tính trong khoảng pH và nhiệt độ rộng nên thuận lợi cho việc ứng dụng SENP2 của hãng có giá thành cao, vì vậy mục đích của nghiên cứu này là biểu hiệncông senp2 trong E coli BL21 để có thể đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước Vector pUC57 -senp2 mang gen senp2 kích thước 681 nucleotide mã hóa vùng... CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid - Vector tách dòng pUC57 mang gen senp2 kích thước 681 nucleotide mã hóa vùng trung tâm hoạt động của SENP2 có 227 amino acid Vector này do phòng kỹ thuật di truyền thiết kế - Chủng tách dòng E coli DH10B - Vector biểu hiện pET22b(+) - Chủng biểu hiện: E coli BL21 2.1.2 Hóa chất, enzyme - Hóa chất: DNA chuẩn,protein... lai vào tế bào vật chủ theo m một hướng chính xác với promoter 1.2.2 Vector biểu hiện n pET22b( pET22b(+) Để biểu hiện n gene trong E coli vector biểu hiện có thể dùng là các plassmid, phage, cosmid Vector bi biểu hiện là một plasmid được thiết kế nhằm mm mục đích sản xuất protein với lượng ng llớn khi được kích thích bằng chất cảm ứng ng (lactose ho hoặc IPTG) Cấu trúc củaa vector pET22b(+) được biểu. .. 3: Cấu trúc bậc 4 của Ubiquitin và SUMO-1: Ubiquitin màu xanh, SUMO-1 màu vàng, so sánh 2 protein với nhau SUMO là một loại protein dung hợp được dùng nhiều trong sinh học phân tử để biểu hiện những protein khó biểu hiện Gen mã hóa peptide dung hợp được gắn vào đầu 5’ của gen mã hóa protein đích và đưa vào vật chủ như E coli, nấm men và các tế bào khác như côn trùng và động vật SUMO-3 có nguồn gốc... NcoI và XhoI Phân tích kết quả trên điện di đồ cho thấy, ở đường chạyy 1 và 2 xu xuất hiện 2 băng đúng như kích thướ ớc tính toán Như vậy, chúng tôi khẳng định nh 2 dòng tế bào này mang pUC57 -senp2 3.2 Thiết kế vector biểu u hiện hi pET22b(+) -senp2 Vector pUC57 chỉỉ được thiết kế cho mục đích tách dòng, òng, không có kh khả năng biểu hiện protein ngoạii lai Do đó, chúng tôi tiến hành chuyển gen senp2. .. chuyển gen senp2 từ vector này sang vector biểu hiện n pET22b(+) là m một vector có nhiều ưu điểm m cho vi việc biểu hiện gen ngoại lai như ư gen lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiệnn gen ngo ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu u với v RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm cắt multicloning site, điểm m khởi kh đầu tái bản f1, gen chọn lọcc (gen kháng kháng sinh Amp) Ngoài ra, trong vector vect pET22b(+)... Tinh sạch sản phẩm cắt senp2, pET22 bằng kit QIAGEN Như trong phần tách dòng gen đã đề cập, gen senp2 được giớ hạn bởi cặp enzyme hạn chế NcoI và XhoI ở hai đầu đoạn gen Vì vậy, việc thu đoạn gen này trở nên đơn giản hơn khi sử dụng chính hai enzyme này Đồng thời, để tiến hành nối ghép gen senp2 vào trong vector biểu hiện pET22b(+) thì vector này cũng được cắt bằng cặp enzme NcoI và XhoI để tạo đầu dính... thành công sau khi tinh sạch ch qua ccột Qiagen nên trên đường chạy củaa senp2 DNAtập trung thành một băng ng có kích thước th 0,7kb đúng như tính toán lýý thuy thuyết 3.2.2 Nối ghép gen senp2 vào vector biểu hiện pET22b(+) Sau khi cắt đồng ng th thời vector biểu hiện pET22b(+) và gen senp2 bằng cặp enzyme hạn chế NcoII và XhoI, thu và tinh sạch bằng cộtt Qiagen, chúng tôi ti tiến hành phản ứng nối ghép