Nghiên cứu thiết kế và biểu hiện nhóm gen doxAVC trên chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES LIVIDANS

DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.2 Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin 17 Hình 1.3 Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR 18 Hình 1.4 Các gen tham gia vào quá trình

TRÊN CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS”

HÀ NỘI - 2017

Giáo viên hướng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo công tác tại khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho chúng em được học tập trong một môi trường khoa học và hoàn thiện nhất

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy Người đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện bài khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và toàn thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong nhận được những góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em được đầy

đủ và hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn văn Tòng

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

1.1 Tổng quan về kháng sinh 3

1.1.1 Định nghĩa về kháng sinh 3

1.1.2 Lịch sử kháng sinh 4

1.1.3 Phân loại kháng sinh 5

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 7

1.2 Xạ khuẩn 10

1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên 10

1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 13

1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius 14

1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 15

1.3 Giới thiệu về kháng sinh Doxorubicin 16

1.3.1 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin 16

1.3.2 Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin 16

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 17

1.3.4 Lịch sử nghiên cứu về kháng sinh Doxorubicin 20

1.3.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh Doxorubicin 22

1.4 Giới thiệu về gen doxA, dnrV, drrC 24

1.4.1 Gen doxA và dnrV 24

1.4.2 Gen drrC 26

1.5 Vector tách dòng pGEM-T và vector biểu hiện pIBR25 27

1.5.1 Vector tách dòng pGEM-T 27

1.5.2 Vector biểu hiện pIBR25 28

1.6 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

1.6.1 Mục tiêu 29

1.6.2 Nội dung nghiên cứu 29

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Chủng vi sinh vật, hóa chất, môi trường và thiết bị 31

2.1.1 Chủng vi sinh vật 31

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 31

2.1.3 Thiết bị 33

2.1.4 Hóa chất 34

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn 37

2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi 38

2.2.3 Phương pháp PCR 39

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 40

2.2.5 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 40

2.2.6 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 41

2.2.7 Phương pháp chuyển gen vào E coli bằng sốc nhiệt 42

2.2.8 Phương pháp nối DNA 43

2.2.9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 43

2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng tế bào trần 44

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Tách dòng gen doxAV và drrC 46

3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius 46

3.1.2 Tách dòng gen doxAV bằng vector pGEM-T 47

3.1.3 Tách dòng gene drrC bằng vector pGEM-T 49

3.2 Thiết kế vector biểu hiện pIBR25-dAVC 52

3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC 52

3.2.2 Tạo vector biểu hiện pIBR25.dAVC 53

3.3 Chuyển vector pIBR25-dAVC bằng tế bào trần (Streptomyces lividans) 54

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào 55

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) 55

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ PEG bổ sung khi chuyển gene 56

3.4 Tách và thu nhận hỗn hợp enzyme thô doxAVC 57

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Đề xuất 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

kb PCR SDS IPTG SDS-PAGE DTT

Da

Ampicillin Base paire Carbon Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotides Ribonucleic Acid Hoạt tính kháng sinh Kilobase

Polymerase Chain Reaction Sodium dodecyl sulfate Isopropyl-thio-β-galactoside Sodium Dodecyl Sulfate Dithinotheitol

Dalton

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.2 Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin 17 Hình 1.3 Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh

DXR

18

Hình 1.4 Các gen tham gia vào quá trình mã hóa cho các enzyme

Polyketide synthase loại II và tổng hợp hợp chất trung

Hình 3.2 Qui trình tạo vector tách dòng pGEM-T-doxAV 47

Hình 3.4 Điện di plasmid pGEm-T-doxAV từ khuẩn lạc 48

Hình 3.5 Điện di plasmid pGEM-T-doxAV được cắt bằng 2

enzyme XbaI và EcoRI

49

Hình 3.8 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc 51

Hình 3.9 Điện di plasmid pGEm-T-drrC được cắt bằng 2 enzyme

XbaI và HindIII

51

Hình 3.10 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC 52

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC 53

Hình 3.12 Kết quả điện di pIBR25-dAVC và được cắt bởi 2

enzyme XbaI và EcoRI

54

Hình 3.13 Các khuẩn lạc S.lividans pIBR25.dAVC đã được tái tổ

hợp phát triển trên đĩa thạch sau khi chuyển gen 36 giờ

57

Page | 1

MỞ ĐẦU

Năm 1928, penicillin, loại kháng sinh đầu tiên được tìm ra bởi một nhà sinh học người Scotland, Alexander Fleming Ông được coi là người đã mở ra

kỷ nguyên vàng của kháng sinh trong y học Nó được gọi là thần dược của tây

y, khi đã cứu hàng triệu người bệnh mỗi năm khỏi cái chết gây ra bởi nhiễm khuẩn

Tuy nhiên, câu chuyện tuyệt vời ấy dường như đang đi đến hồi kết Sau hơn 70 năm kháng sinh được đưa vào y học, thời đại hoàng kim của nó đã không còn được duy trì Có hàng triệu người đã chết mỗi năm trong thời đại chưa có kháng sinh, và rồi sẽ là một con số tương tự trong những năm sắp tới Cơn ác mộng này mang tên "kháng kháng sinh", và xuất phát từ chính sự lạm dụng thuốc của con người Các hệ quả có thể thấy ngay đó là vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc hơn làm cho hiệu quả điều trị không cao Chính vì vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách hợp lí của người bệnh thì việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng sản xuất các loại kháng sinh mới đang là nghĩa vụ và trách nhiệm của các nhà khoa học trên toàn thế giới Doxorubicin là kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, được sử dụng trong điều trị các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ lympho như ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu Hiện nay, kháng sinh này được biết đến bởi các đặc điểm vượt trội của nó như có phổ tác dụng mạnh và tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp tế bào ung thư mới

Doxorubicin là một loại kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay ở Việt Nam chưa sản xuất được Doxorubicin có phổ tác dụng rất rộng so với DNR tuy nhiên trong con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng xạ khuẩn

hơn rất nhiều so với DXR Một trong những biện pháp tăng kháng sinh DXR

Page | 2

đó là thực hiện phản ứng chuyển hóa DNR thành DXN Một trong những biện

pháp làm tăng năng suất kháng sinh DXR đó là thực hiện phản ứng in vitro để

biến đổi Daunorubicin thành Doxorubicin Có 37 gen tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp kháng sinh Doxorubicin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces

vào quá trình chuyển hóa DNR thành Doxorubicin Gen doxA là gen điều khiển quá trình sản xuất DXR, gen dnrV là gen điều hòa của gen doxA, gen

drrC là gen kháng kháng sinh DXR giúp xạ khuẩn có thể tồn tại trong môi trường DXR Do vậy, nếu thiếu bất kì 1 gen nào cũng làm cho sản lượng DXR giảm đáng kể Vì vậy, em đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài

mang tên: “Nghiên cứu thiết kế và biểu hiện nhóm gen doxAVC trên chủng

kháng sinh DXR

từ khi sản xuất penicilin để dùng trong lâm sàng (1941) Kháng sinh được coi

là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm

sự phát triển của vi sinh vật khác Khi đó người ta đã định nghĩa : "Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối

với các vi sinh vật khác", theo Waksman 1942

Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin) Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung” [3]

Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời gian xác định [3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0µg (Hopwood, 2007)

Page | 4

1.1.2 Lịch sử kháng sinh

Kháng sinh được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin cách đây hơn 70 năm Nhưng thực tế, từ lâu con người đã biết dùng các chất có tác dụng chữa trị các bệnh mà sau này được gọi là các chất kháng sinh

Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách dùng rêu đắp lên vết thương

Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết thương Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên bánh mỳ thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn và lại càng không biết chất kháng sinh là gì

Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh

Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces

nhóm macrolide và glycopeptide (tức vancomycin) được phát hiện Các kháng sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone đã được tạo ra vào năm 1962

Đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, khi công nghệ sinh học và hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở thế

kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển

Page | 5

và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng báo động là ngày càng tăng các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra các thuốc mới Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng nhanh kháng thuốc và tốc độ kháng thuốc nhanh hơn cả tốc độ tạo được thuốc mới của con người [2]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Việc phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các kháng sinh do việc tìm ra các kháng sinh ngày càng nhiều Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh [2]

Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh [2]

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính[2]:

• Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate

• Nhóm 2: Các lactone macrolide

• Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất

• Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

• Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

• Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

• Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no

• Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

• Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng

Page | 6

Phân loại kháng sinh theo cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng, kháng sinh được chia thành 6 nhóm chính như sau:

• Nhóm 1: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của thành tế bào

• Nhóm 2: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào

• Nhóm 3: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của Protein của vi khuẩn

• Nhóm 4: Kháng sinh ức chế sự tổng hợp DNA của vi khuẩn

• Nhóm 5: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic

• Nhóm 6: Kháng sinh ức chế một số quá trình tổng hợp khác

Phân loại kháng sinh dựa vào mức độ tác dụng

Dựa vào mức độ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm sau:

• Nhóm 1: Kháng sinh diệt khuẩn bao gồm những kháng sinh tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp DNA và ARN

• Nhóm 2: Kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome 30S, 50S và 70S

Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng

Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh được phân thành 5 nhóm sau:

• Nhóm1: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó

• Nhóm 2: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng

• Nhóm 3: Nhóm kháng sinh dùng ngoài

• Nhóm 4: Nhóm kháng sinh chống lao

• Nhóm 5: Nhóm kháng sinh chống nấm

Page | 7

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất làm ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp

và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian [3]

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Sự ức chế tổng hợp thành tế bào

Các nhà khoa học đã làm thay đổi các β-lactam để tạo ra các dẫn xuất bán tổng hợp Các chất này bền hơn trong môi trường axit của dạ dày, dễ hấp thụ hơn trong đường ruột, ít mẫn cảm hơn so với sự bất hoạt các enzyme vi khuẩn hoặc hoạt động mạnh hơn chống lại nhiều vi khuẩn

Page | 8

Dưới sự tác động của các kháng sinh sẽ ngăn cản vi khuẩn tăng số lượng nguyên liệu thành tế bào, song không gây tác động lên thành tế bào peptidoglucan, nên chỉ có hiệu quả đối với các tế bào trưởng thành hoặc đang sinh sản, các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng Tất nhiên, chúng sẽ không gây hại đối với các tế bào động thực vật vì chúng không có thành tế bào peptidoglucan

Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin, Rostocetin, Vancomycin [3]

Sự tổn thương màng tế bào

Một số kháng sinh gây tổn thương cho thành thành tế bào bằng cách phá vỡ màng tế bào chất của tế bào đích bằng cách gắn vào màng và làm hư hỏng tính toàn vẹn của nó

Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Amphotericin B, Colistin, Imidazole, Nystatin, Polymycins [3]

Tác động vào giai đoạn khởi đầu:

- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới thành lập

Page | 9

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide

Tác động vào giai đoạn kéo dài:

- Tetracyclin ảnh hưởng tới sự gắn tARN mang amino acid vào ribosome

ở tiểu phần 30S của ribosome do đó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide đang tổng hợp

Sự ức chế tổng hợp acid nucleic

Các hợp chất có khả năng hoạt động như các tác nhân kháng vi sinh vật bằng cách can thiệp vào chức năng của các acid nucleic được gọi là các chất tương tự như acid nucleic Do có sự giống nhau về mặt cấu trúc của các hợp chất này với các acid nucleic thông thường cho phép chúng gắn được vào các phân tử DNA hoặc ARN của các tác nhân gây bệnh, sau đó, chúng sẽ làm biến dạng các phân tử axit nucleic và ngăn ngừa sự sao chép, phiên mã và dịch mã xảy ra sau đó Đặc biệt, các chất có cấu tạo tương tự như acid nucleic cũng có tác dụng lên các tế bào ung thư trong giai đoạn phân chia nhánh [3]

Sự ức chế tổng hợp acid folic

Acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine,

từ đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn Sulfamides và trimethoprim là những chất tương tự về mặt cấu trúc và hóa học với các acid p-aminobenzoic (PABA) và acid folic Sulfamides đối kháng cạnh tranh với PABA - một tiền chất để tổng hợp acid folic PABA kết hợp với acid pteroic hoặc axit glutamic để tạo PGA, chất này giống như một coenzym trong sự tổng hợp purin và timin Do đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của acid folic), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn [3]

Page | 10

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên

Đặc điểm về xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống như

vi khuẩn [9] Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc Các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, v.v Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng Đường kính sợi của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5 µm Có thể phân biệt được hai loại sợi khác nhau Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng [7]

Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ khuẩn), một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh

- Kiểu kết đoạn:

Hạt cromatin trong cuống sinh bào tử được phân chia thành nhiều hạt phân bố đồng đều dọc theo sợi cuống sinh bào tử Sau đó tế bào chất tập trung bao bọc quang mỗi hạt cromatin gọi là tiền bào tử Tiền bào tử hình thành màng tạo thành bào tử nằm trng cuống sinh bào tử Bào tử thường có hình cầu hoặc ôvan, được giải phóng khi màng cuống sinh bào tử bị phân giải hoặc bị tách ra

- Kiểu cắt khúc:

Hạt cromatin phân chia phân bố đồng đều dọc theo cuống sinh bào tử Sau đó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần đều có tế bào chất Bào tử hình thành theo kiểu này thường có hình viên trụ hoặc hình que

Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có thể sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty Thuộc nhóm Procaryotes ngoài xạ khuẩn và vi khuẩn còn có niêm

vi khuẩn, xoắn thể, ricketsia và Mycoplasma Các nhóm này đều có cấu tạo nhân đơn giản Cấu tạo tế bào và hoạt tính sinh lý có nhiều sai khác Ví dụ như Mycoplasma có kích thước rất nhỏ bé so với vi khuẩn, không có màng tế

Page | 12

bào, vì thế hình dạng luôn biến đổi Ricketsia cũng có kích thước nhỏ bé, sống ký sinh bắt buộc v.v [9]

Xạ khuẩn Streptomyces

thuộc nhánh streptomycetaceae Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã

được mô tả Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ G, C có phần trăm cao [14] Vi khuẩn

này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát Streptomyces

sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình

chuyển hóa các chất Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces) Streptomyces thường sống

ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế [9]

sản xuất ra các chế phẩm như:

• Thuốc kháng sinh (antibacterials): streptomycin, erythromycin, tetracyclin, neomycin, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin

• Thuốc kháng nấm: nystatin, amphotericin

• Thuốc chống ung thư: doxorubicin, bleomycin, mitomycin

• Ức chế miễn dịch: rapamycin

• Thuốc diệt cỏ: bialaphos

Quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất này khá khó khăn Quy định một cách cẩn thận với các quá trình của sự phân lập tế bào, bắt đầu trong việc chuyển đổi sang sợi nấm trên môi trường thạch hoặc trong giai đoạn cuối theo cấp số nhân (trong các môi trường nuôi cấy lỏng)

Page | 13

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi

khuẩn gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC, pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh

1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một trong những tính chất của các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh

là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là [5]:

- Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh

có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó

- Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

Page | 14

Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như lincomycin, novobiocin Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor

1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius

Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500

loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài

thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin,

erythromycin và tetracyclin [4]

tên năm 1943 Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh

sinh kháng sinh Doxorubicin Khi sinh trưởng trên môi trường NDYE ở nhiệt

độ 280C sau 4-5 ngày bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc

Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 tồn tại ở

dạng khuẩn ty Khi nuôi trên môi trường đĩa thạch hoặc dịch lỏng thì dịch nuôi có nâu đỏ, các tế bào tồn tại dưới dạng sợi mảnh, nhỏ nhưng liên kết với

Page | 15

nhau thành từng búi sợi Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt nhỏ là một tế bào xạ khuẩn [4]

Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các

nguồn cacbohydrat khác nhau Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có glucose, sacharose và maltose Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong môi trường có maltose

1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24

trúc dạng sợi Với hàm lượng G-C cao nên bộ gen của chúng rất bền

trong đất Do môi trường sống tự nhiên của chúng và chúng không gây bệnh nên chúng được sử dụng như máy chủ để trổng hợp và tiết ra protein tương đồng và dị hợp Các tế bào Streptomysces lividans TK24 đã được nghiên cứu

để sử dụng trong việc điều khiển hệ gene và điều hòa tăng hiệu xuất sinh tổng hợp kháng sinh, một số chất là tác nhân chống ung thư [8]

ở chuỗi Cosmid Các khu vực lõi trung tâm chứa các gen cần thiết, trong khi bên ngoài lõi mang gen có điều kiện thích nghi với DNA của loài ta chuyển

gen vào Không giống như hầu hết các loài Eubacteria, loài Streptomyces

thường chứa nhiễm sắc thể tuyến tính và plasmid Các plasmid tuyến tính là dài 12-1700 kb Với các trình tự lặp lại đảo ngược trong các telomere của họ, việc nhân rộng plasmid tuyến tính của strptomyces bắt đầu ở locus nằm ở trung tâm và tiếp tục hai chiều đối với các telomere Điều này để lại một dải đơn dài khoảng 280 nucleotide Tuy nhiên, khi các telomere bị xóa, các locus

nằm ở trung tâm plasmid tuyến tính của Strepmyces lividans TK24 cũng có

Page | 16

thể duy trì chế độ khép kín Do đó các chế độ sao chép và chức năng của

1.3 Giới thiệu về kháng sinh Doxorubicin

1.3.1 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin

Doxorubicin(DXR) hay còn được gọi là Hydroxydaunorubicin, là một trong những kháng sinh quan trọng thuộc nhóm Anthracycline được tạo ra bởi

con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai của chủng xạ khuẩn Streptomyces

ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu

Doxorubicin là kháng sinh có khả năng điều trị các loại bệnh về khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ Lympho như ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu

Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn

tạo ra bằng cách thêm vào cấu trúc của Daunorubicin (DNR) (sản phẩm trao đổi chất bậc một của chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952, tiền thân của Doxorubicin) vị trí C14 một nhóm OH Vì vậy mà DXR còn được gọi là C14 - Hydroxydaunorubicin

Cũng giống như các kháng sinh khác thuộc nhóm kháng sinh Anthracycline, DXR hoạt động bằng cách liên kết với phân tử DNA, ức chế quá trình sinh tổng hơp acid nucleic và sự phân chia của tế bào ung thư nhưng

nó lại có một tác dụng phụ lớn nhất là gây tổn thương cho tim và đe dọa tính mạng của người sử dụng nếu có tiền sử về bệnh tim

1.3.2 Cấu trúc của kháng sinh Doxorubicin

- Công thức phân tử: C27H29NO11.

- Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin

Page | 17

- Tên thương mại: Doxil, Adriamycin

- Tên khoa học: 2H-pyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1-

(8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro-methoxy-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione

- Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB)

- Khối lượng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon

- Nhiệt độ nóng chảy: 205oC

- Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan

Hình 1.2 Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin

1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin

Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn được

phân lập trong tự nhiên là Strepyomyces peucetius Chủng xạ khuẩn này tạo

ra sản phẩm đầu tiên là DNR Khi có một nhóm OH được gắn vào vị trí C-14 của DNR thì hình thành sản phẩm bậc hai, đó chính là Doxorubicin

Theo nhiều chứng minh cho thấy rằng, DXR có hoạt tính mạnh hơn và

ưu việt hơn so với DNR nhưng nếu tuân theo con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng xạ khuẩn trên thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR

Page | 18

Năm 1990, Hutchinson và các cộng sự là nhóm nghiên cứu đầu tiên về con đường sinh tổng hợp DXR bằng phương pháp sinh học phân tử tạo ra bộ thư viện gene thuộc hệ gene trong đó gồm nhóm gene sinh tổng hợp DXR Từ

đó các nhóm đã có các công bố về giải trình tự gene và dự đoán cấu trúc của nhóm gene này trên ngân hàng gene thế giới Tiếp theo sau đó là rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra vai trò, chức năng, cấu trúc, hoạt tính sinh học của từng gene trong nhóm gene để chứng minh và tìm ra con đường sinh tổng hợp kháng sinh này với hàm lượng cao hơn và ứng dụng trong quy trình sản xuất với quy mô công nghiệp

deoxysugar (dnm) regulatory resistance (drr)

glycosyltransferase oxidation

unspecified function

cyclase

dxr modifying reduction dps (PKS)

dnmL dnmM N O dnrF drrA drrB drrD X dpsY dnmZ dnmU dnmVdnmJ I

doxA V U G H dnmT dnrH dnrE F E dnrG A B C D C D dnrK dnrP Q S drrC

SN Gene Proposed function

1 dnmL glucose-1-phosphate thymidylyltransferase

2 dnmM TDP-glucose-4,6-dehydratase

3 dnrN pseudo response regulator gene

4 dnrO repressor gene

5 dnrF aklavinone C-11 hydroxylase

6 drrA resistance gene

7 drrB resistance gene

8 drrD resistance gene

9 dnrX putative doxorubicin modifying enzyme

10 dpsY polyketide cyclase (3rd cyclase)

11 dnmZ putative flavoprotein

12 dnmU 3,5-epimerase

13 dnmV 4-ketoreductase

14 dnmJ C-3 aminotransferase

15 dnrI regulatory gene

16 doxA daunorubicin C-14 hydroxylase

17 dnrV putative ketoreductase

18 dnrU daunorubicin C-13 ketoreductae

SN Gene Proposed function

19 dpsG ACP for minPKS

20 dpsH daunorubicin biosynthesis enzyme

21 dnmT putative 2,3-dehydratase

22 dnrH putative baumycin biosynthesis enzyme

23 dnrE aklaviketone reductase

24 dpsF polyketide cyclase (1st cyclase)

Hình 1.4 Các gen tham gia vào quá trình mã hóa cho các enzyme Polyketide synthase loại II và tổng hợp hợp chất trung gian ε-rhodomycinone

Page | 20

Nhóm 2: Là nhóm gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp gốc đường khử, đường amin (Daunosamine), enzyme vận chuyển gốc đường gắn daunosamine vào chất trung gian, kết hợp với các enzyme biến đổi cấu trúc Với hoạt tính của các enzyme này kết quả là tạo thành DNR và DXR, hai chất có hoạt tính sinh học trong tế

bào xạ khuẩn

Hình 1.5 Cơ chế và con đường tổng hợp DNR và DXR từ ε-rhodomycinone

Nhóm 3: Được gọi là nhóm gene điều hòa hay gene tự bảo vệ với chức năng làm giảm độc tố trong quá trình tạo kháng sinh DXR và DNR là các chất gây độc rất mạnh cho tế bào tạo kháng sinh, cho nên các gene này mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình vận chuyển DXR

và DNR ra khỏi tế bào ngay lập tức khi các kháng sinh này vừa mới được tổng hợp trong tế bào Đồng thời với quá trình này sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn đó

1.3.4 Lịch sử nghiên cứu về kháng sinh Doxorubicin

Trong những năm 1960, một công ty nghiên cứu ở Italia - Farmitalia Research Laboratories, tổ chức này đã thực hiện tìm kiếm các hợp chất chống ung thư từ vi khuẩn đất trên quy mô phòng thí nghiệm Họ đã tiến hành phân

Page | 21

lập từ các mẫu đất xung quanh lâu đài Castel Del Monte bằng sự lỗ lực cố gắng họ đã phát hiện ra một chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn này đã tạo ra một hợp chất có sắc tố đỏ và có hoạt tính chống lại các khối u ở chuột rất tốt

Chủng xạ khuẩn này chính là Streptomyces peucetius

Cùng thời gian đó, một nhóm nghiên cứu ở pháp đã phát hiện ra một hợp chất tương tự cũng có màu sắc đỏ và sau này khi kháng sinh được tách chiết thì đặt tên cho chất màu đỏ này là Daunorubicin "Daunorubicin" là tên hợp nhất của hai từ Dauni và Rubis (Rubi), Dauni là tên của bộ lạc trước thời

kỳ La Mã sinh sống và chiếm đóng vùng đất đã phân lập được chủng xạ khuẩn sản xuất được chất kháng sinh này, còn Rubis là tiếng Pháp mô tả màu sắc

Những năm 1960, bắt đầu thử nghiệm lâm sàng loại kháng sinh này và

đã thành công trong việc điều trị bệnh bạch cầu cấp tính và ung thư hạch

Tuy nhiên, năm 1967 Daunorubicin được công nhận có tác dụng phụ lớn nhất là gây ra độc tính trên tim và gây tử vong cho con người

Năm 1969, Arcamone F cùng với các cộng sự đã tiến hành biến đổi một

chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ chủng Streptomyces peucetius bằng cách sử

dụng N - nitroso - N- methyl urethane, kết quả là tạo ra một chủng đột biến

mới và đặt tên là Streptomyces peucetius phân loài Casius ATCC27952 có

khả năng sản xuất ra một kháng sinh cũng có màu đỏ như DNR và họ đặt tên chất này là Adrimycin, sau đó được thay đổi tên thành DXR để phù hợp với quy ước đặt tên của quốc tế

Trong bài báo cáo khoa học lần thứ 53 của Di Manrco A, Gactani M, Scarpinato B năm 1969 đã chỉ ra rằng DXR có tác dụng chống lại các khối u chuột đặc biệt là u cứng tốt hơn hẳn so với DNR và có chỉ số điều trị cao hơn nhưng tác động phụ tới tim vẫn còn tồn tại

Năm 1996, nhóm Strohl đã phát hiện ra gene doxA - gen mã hóa các

enzyme chuyển đổi DNR thành DXR

Page | 22

Năm 1999, nhóm Strohl sản xuất tái tổ hợp được gen doxA là một

oxydaza Cytochrome P- 450, gen này tham gia xúc tác nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp DXR bao gồm cả các bước sản xuất DNR Bằng đột biến

ba gen với sự có mặt của doxA đã làm tăng từ 36%-86% năng suất sinh tổng

hợp Doxorubicin

1.3.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của kháng sinh Doxorubicin

Doxorubicin tác động vào tế bào ung thư bằng cách tương tác với DNA, ức chế sự tổng hợp axit nucleic (ARN - quá trình phiên mã) và sự phân chia của tế bào ung thư [6] [13]

Các enzyme DNA Topoisomerase chính là các mục tiêu tác động của DXR trong sự tiêu diệt tế bào ung thư DXR thực hiện quá trình ức chế trực tiếp lên sự hoạt động của các enzyme này, làm gián đoạn chức năng đồng thời thay đổi chức năng tự nhiên của nó tạo ra sự đứt đoạn trong phân tử DNA cuối cùng dẫn đến các tế bào ung thư bị chết [15]

Enzyme DNA Topoisomarse

Lịch sử: Enzyme DNA Topoisomerase do James C Wang là nhà sinh học người Mĩ gốc Trung Quốc phát hiện ra và đề xuất cơ chế hoạt động của

 Enzyme DNA Topoisomerase loại I:

Enzyme DNA Topoisomerase loại I có cấu trúc như là một monomer gồm bốn tiểu phần riêng biệt Các thành phần chính gắn với nhau bằng đầu Cacbon và đầu Nito Hai đầu này gắn với các rãnh lớn và nhỏ tương ứng

Page | 23

Là enzyme nuclease đặc biệt có vai trò trong quá trình bẻ gãy liên kết photphodiester giữa các bazơ trên một mạch đơn tạo ra vết đứt giải phóng hai đầu và dạng sợi tự do Các đầu tự do này sẽ quay để giúp cho quá trình mở xoắn sợi DNA giúp cho quá trình sao chép, tái bản Do phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép nên trong quá trình nhân đôi tại chạc sao chép được mở ra và chạc này chuyển động theo sợi khuôn sẽ khiến sợi này xoắn lại rất chắc Enzyme DNA Topoisomerase I đóng vai trò mở xoắn để khắc phục sự xoắn cho quá trình sao chép, sau đó liên kết photphodiester lại được phục hồi và enzyme tách khỏi DNA

 Enzyme DNA Topoisomerase loại II:

Enzyme DNA Topoisomerase loại II có khả năng cắt đứt cả hai mạch trên sợi DNA và sau đó xúc tác cho quá trình phục hồi gắn lại hai sợi DNA

Vì vậy mà enzyme này vừa có chức năng tháo gỡ siêu xoắn trong quá trình tái bản DNA vừa có chức năng tạo ra trạng thái siêu xoắn trở lại của sợi DNA bằng cách đảo mạch hai sợi xoắn kép hoặc gắn hai đầu xoắn của sợi xoắn kép sau đó lồng vào với nhau để tạo siêu xoắn và co ngắn sợi DNA [11]

Cơ chế hoạt động của kháng sinh Doxorubicin

Trong tế bào ung thư, enzyme DNA Topoisomarase được sinh tổng hợp

và biểu hiện với tốc độ rất cao Sau đó, enzyme này xúc tác cho quá trình sao chép DNA hay quá trình phân chia tế bào ung thư diễn ra rất nhanh chóng Kết quả là số lượng tế bào ung thư sẽ được nhân lên với một số lượng lớn Do

đó, enyme DNA Topoisomarase là mục tiêu của rất nhiều loại thuốc kháng sinh chống và điều trị ung thư trong đó có cả kháng sinh DXR

Khi xảy ra sự tương tác với tế bào ung thư, DXR sẽ gây ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA hay quá trình phân chia tế bào ung thư bằng cách phân tử DXR hình thành mối tương tác xen kẽ giữa các cặp bazơ trong chuỗi DNA ở trạng thái xoắn kép từ đó ức chế hoạt tính của enzyme DNA Topoisomarse II dẫn đến ức chế quá trình tháo xoắn và mở xoắn của DNA

1.4 Giới thiệu về gen doxA, dnrV, drrC

Hình 1.6 Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh Doxorubicin

1.4.1 Gen doxA và dnrV

Gen doxA

Gen doxA thuộc nhóm gồm 37 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Trong đó, gen doxA được xác định có kích thước là 1275bp

tương ứng với 420 axitamin được đăng ký bản quyền trên Genbank với mã số

AF 403708 Chức năng của gen doxA là mã hóa, tổng hợp Cytochrome P450

Hydroxylase, xúc tác cho phản ứng oxyl hóa và hydroxylation tại vị trí C14

trong cấu trúc kháng sinh DNR để chuyển đổi thành DXR [2]

DOX: doxorubicin DauK:anthracycline4- O –methyltransferase

Một số nghiên cứu về gen doxA trên thế giới như:

• Theo Dicken và các cộng sự năm 1997 đã cho thấy trong in vitro và in

vivo, Cytochrome P450 xúc tác cho quá trình oxyl hóa của 13-deoxyl carminomycin và 13-deoxyl Daunorubicin thành 13-dihydro daunorubin và 13-dihydro carminomycin

• Guilfoile, P G và C R Hutchinson năm 1991 cho thấy khi gen doxA

và dnrV cùng hoạt động tạo ra một vector tái tổ hợp có khả năng

chuyển đổi 80% DNR thành DXR

Page | 26

• Natalie Lomovskaya và các cộng sự năm 1999 đã chỉ ra rằng nếu chỉ

biểu hiện doxA trong một đột biến doxA: aphII dẫn đến sự tích tụ của DNR thay vì một sự gia tăng DXR Ngược lại, biểu hiện của doxA trong đột biến đôi dnrX dnrU hoặc đột biến ba dnrX dnrU dnrH tăng

gấp hiệu quả tổng hợp DXR 36-86%

Theo các nghiên cứu trước đấy đã chỉ ra rằng, gen doxA tham gia vào 3

quá trình oxyl hóa để sinh tổng hợp DXR Ba quá trình đó là:

• Quá trình oxyl hóa của 13-deoxylcarminomycin và 13-deoxyl daunorubicin tới 13-hydro carminomycin và 13-dihydro daunorubicin

• Quá trình oxyl hóa của 13-dihydro carminomycin và 13-dihydro DNR đến carminomycin và DNR

• Quá trình hydroxylation tại vị trị C14 của DNR cho tới DXR

Gen dnrV

Có tác dụng như một đoạn gen điều hòa cho quá trình sản xuất

doxorubicin của gen doxA Các gen doxA mã hóa cytochrome (CY) P-450 hydroxylase mà có thể hoạt động cùng với các sản phẩm của gen dnrV để

chuyển đổi 13-deoxycarminomycin hoặc 13-deoxy-DNR thành DNR và DNR hydroxylate thành DXR giúp tăng sản lượng DXR được sản xuất [10]

Vai trò liên kết hỗ trợ của doxA và dnrV

Gen doxA là gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR

từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Gen dnrV là gen

điều hòa luôn đi cùng với gen doxA để hỗ trợ cho quá trình sinh tổng hợp chuyển hóa DNR thành DXR đạt hiệu suất cao hơn Do đó ta có thể gọi 2 đoạn gen doxA và dnrV là gen doxAV

1.4.2 Gen drrC

Gen drrC là đoạn gen dịch mã ra loại protein kháng kháng sinh

daunorubicin, mã hóa một protein 764-amino-acid, nó giống với một chuỗi