Nghiên cứu thiết kế và biểu hiện nhóm gen doxAVC trên chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES LIVIDANS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********⁂⁂⁂******** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN NHÓM GEN doxAVC TRÊN CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS” Giáo viên hướng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên : Nguyễn Văn Tòng Lớp : CNSH-1301 HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo công tác khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện cho chúng em học tập mơi trường khoa học hồn thiện Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy Người dành nhiều thời gian tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực tập hồn thành đề tài nghiên cứu Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, tồn thể bạn phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng, khơng thể tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên em mong nhận góp ý q thầy – để khóa luận em đầy đủ hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn văn Tòng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Lịch sử kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2 Xạ khuẩn 10 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên 10 1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 13 1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius 14 1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 15 1.3 Giới thiệu kháng sinh Doxorubicin 16 1.3.1 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 16 1.3.2 Cấu trúc kháng sinh Doxorubicin 16 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 17 1.3.4 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Doxorubicin 20 1.3.5 Cơ chế hoạt động hoạt tính sinh học kháng sinh Doxorubicin 22 1.4 Giới thiệu gen doxA, dnrV, drrC 24 1.4.1 Gen doxA dnrV 24 1.4.2 Gen drrC 26 1.5 Vector tách dòng pGEM-T vector biểu pIBR25 27 1.5.1 Vector tách dòng pGEM-T 27 1.5.2 Vector biểu pIBR25 28 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 29 1.6.1 Mục tiêu 29 1.6.2 Nội dung nghiên cứu 29 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Chủng vi sinh vật, hóa chất, mơi trường thiết bị 31 2.1.1 Chủng vi sinh vật 31 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 31 2.1.3 Thiết bị 33 2.1.4 Hóa chất 34 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn 37 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi 38 2.2.3 Phương pháp PCR 39 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 40 2.2.5 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose 40 2.2.6 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 41 2.2.7 Phương pháp chuyển gen vào E coli sốc nhiệt 42 2.2.8 Phương pháp nối DNA 43 2.2.9 Phương pháp cắt DNA enzyme giới hạn 43 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans tế bào trần 44 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Tách dòng gen doxAV drrC 46 3.1.1 Tách DNA tổng số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius 46 3.1.2 Tách dòng gen doxAV vector pGEM-T 47 3.1.3 Tách dòng gene drrC vector pGEM-T 49 3.2 Thiết kế vector biểu pIBR25-dAVC 52 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC 52 3.2.2 Tạo vector biểu pIBR25.dAVC 53 3.3 Chuyển vector pIBR25-dAVC tế bào trần (Streptomyces lividans) 54 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào 55 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) 55 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG bổ sung chuyển gene 56 3.4 Tách thu nhận hỗn hợp enzyme thô doxAVC 57 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Đề xuất 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin bp Base paire C Carbon DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotides ARN Ribonucleic Acid HTKS Hoạt tính kháng sinh kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate DTT Dithinotheitol Da Dalton DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng 33 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng 34 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa nuôi 55 tế bào (overlay) Bảng 3.2 Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyển gene 56 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene 56 DANH MỤC HÌNH VẼ Tên hình Trang Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian hóa học Doxorubicin 17 Hình 1.3 Các gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh 18 DXR Hình 1.4 Các gen tham gia vào q trình mã hóa cho enzyme 19 Polyketide synthase loại II tổng hợp hợp chất trung gian ε-rhodomycinone Hình 1.5 Cơ chế đường tổng hợp DNR DXR từ ε- 20 rhodomycinone Hình 1.6 Các gen tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh 24 Doxorubicin Hình 1.7 Tóm tắt phản ứng xúc tác gen doxA 25 Hình 1.8 Cấu trúc pGEM – T vector dùng tách dòng gen 27 Hình 1.9 Cấu trúc vetcor biểu pIBR25 28 Hình 1.5 Tiến trình thực 30 Hình 3.1 Điện di DNA tổng số 46 Hình 3.2 Qui trình tạo vector tách dòng pGEM-T-doxAV 47 Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR gen doxAV 47 Hình 3.4 Điện di plasmid pGEm-T-doxAV từ khuẩn lạc 48 Hình 3.5 Điện di plasmid pGEM-T-doxAV cắt 49 enzyme XbaI EcoRI Hình 3.6 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC 49 Hình 3.7 Điện di chạy PCR gen drrC 50 Hình 3.8 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc 51 Hình 3.9 Điện di plasmid pGEm-T-drrC cắt enzyme 51 XbaI HindIII Hình 3.10 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC 52 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC 53 Hình 3.12 Kết điện di pIBR25-dAVC cắt 54 enzyme XbaI EcoRI Hình 3.13 Các khuẩn lạc S.lividans pIBR25.dAVC tái tổ 57 hợp phát triển đĩa thạch sau chuyển gen 36 Hình 3.14 Điện di enzyme tổng số protein 58 MỞ ĐẦU Năm 1928, penicillin, loại kháng sinh tìm nhà sinh học người Scotland, Alexander Fleming Ông coi người mở kỷ nguyên vàng kháng sinh y học Nó gọi thần dược tây y, cứu hàng triệu người bệnh năm khỏi chết gây nhiễm khuẩn Tuy nhiên, câu chuyện tuyệt vời dường đến hồi kết Sau 70 năm kháng sinh đưa vào y học, thời đại hồng kim khơng trì Có hàng triệu người chết năm thời đại chưa có kháng sinh, số tương tự năm tới Cơn ác mộng mang tên "kháng kháng sinh", xuất phát từ lạm dụng thuốc người Các hệ thấy vi khuẩn trở nên kháng thuốc làm cho hiệu điều trị không cao Chính vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lí người bệnh việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng sản xuất loại kháng sinh nghĩa vụ trách nhiệm nhà khoa học toàn giới Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điểm vượt trội có phổ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình sinh tổng hợp tế bào ung thư Doxorubicin loại kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Doxorubicin có phổ tác dụng rộng so với DNR nhiên đường sinh tổng hợp tự nhiên chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius hàm lượng DNR tạo với hàm lượng lớn nhiều so với DXR Một biện pháp tăng kháng sinh DXR Page | thực phản ứng chuyển hóa DNR thành DXN Một biện pháp làm tăng suất kháng sinh DXR thực phản ứng in vitro để biến đổi Daunorubicin thành Doxorubicin Có 37 gen tham gia vào q trình sinh tổng hợp kháng sinh Doxorubicin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius, có gen quan trọng doxA, dnrV drrC gen tham gia vào trình chuyển hóa DNR thành Doxorubicin Gen doxA gen điều khiển trình sản xuất DXR, gen dnrV gen điều hòa gen doxA, gen drrC gen kháng kháng sinh DXR giúp xạ khuẩn tồn mơi trường DXR Do vậy, thiếu gen làm cho sản lượng DXR giảm đáng kể Vì vậy, em tiến hành thực nghiên cứu đề tài mang tên: “Nghiên cứu thiết kế biểu nhóm gen doxAVC chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans” nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh DXR Page | 3.1.2 Tách dòng gen doxAV vector pGEM-T Hình 3.2 Qui trình tạo vector tách dòng pGEM-T-doxAV DNA tổng số xạ khuẩn sau tách chiết sử dụng làm khuôn phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen doxAV với cặp mồi đặc hiệu doxAVL1 doxAL2 Sản phẩm PCR gen doxAV chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thu băng vạch tương ứng với vị trí vạch 2,0 kb DNA marker 1kb ladder, vị trí phù hợp với kích thước đoạn gen doxAV 2076 bp Như vậy, thực phản ứng PCR gen doxAV thành cơng ( hình 3.3 ) M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1: Sản phẩm PCR gen doxAV Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR gen doxAV Page | 47 Sau thực phản ứng PCR sản phẩm tinh thu đoạn gen doxAV, thực phản ứng ligase gen doxAV vào vector pGEM-T Easy Sản phẩm ligase chuyển gen vào E coli JM109 Sau ni cấy mơi trường LB có bổ sung kháng sinh amp(100mg/ml), X-gal IPTG theo tỉ lệ thích hợp Ni cấy qua đêm từ 16h-20h tiến hành nhặt khuẩn lạc trắng, khuẩn lạc xanh nuôi cấy tiến hành tách plasmid từ vi khuẩn theo mục 2.2.6 Plamid thu tiến hành chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thể hình 3.4 Ta thấy băng vạch khuẩn lạc trắng cao băng vạch khuẩn lạc xanh Ở khuẩn lạc trắng xuất băng vạch băng vạch thứ tương ứng với vạch 5kb DNA marker plasmid pGEM-T-doxAV bao gồm vector pGEM-T (3 kb) gen doxAV (2,1 kb) Như tạm thời kết luận chuyển gen doxAV vào vector pGEM-T thành công M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1, 2: Khuẩn lạc trắng; Mẫu 3: Khuẩn lạc xanh Hình 3.4 Điện di plasmid pGEm-T-doxAV từ khuẩn lạc Em tiến hành cắt kiểm tra plasmid pGEM-T-doxAV enzyme giới hạn XbaI EcoRI, kết chạy điện di gel agarose 1% Kết thể hình 3.5 Page | 48 M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-doxAV Hình 3.5 Điện di plasmid pGEM-T-doxAV cắt enzyme XbaI EcoRI Kết điện di thu băng vạch, băng vạch đầu tương ứng với vạch 3kb DNA marker với kích thước plasmid pGEM-T (3kb) vạch sáng thứ tương ứng với vạch 2kb DNA marker với kích thước đoạn gen doxAV cắt với enzyme giới hạn XbaI EcoRI Như kết luận chuyển gen doxAV vào vector pGEM-T thành cơng 3.1.3 Tách dòng gene drrC vector pGEM-T Hình 3.6 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC DNA tổng số xạ khuẩn sau tách chiết sử dụng làm khuôn phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen drrC với cặp mồi đặc hiệu Page | 49 drrC1 drrC2 Và sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thể hình 3.7 Hình 3.7 Điện di chạy PCR gen drrC M: kb DNA Ladder; 1,2: Mẫu sản phẩm PCR Kết điện di thu băng vạch tương ứng phía vạch kb DNA marker 1kb ladder với kích thước gen drrC 2,3 kb Điều cho thấy việc PCR gen drrC thành công Sau thực phản ứng PCR sản phẩm tinh thu đoạn gen drrC, thực phản ứng ligase đoạn gen drrC vào vector pGEM-T Easy Sản phẩm ligase chuyển gen vào E.coli JM109 Sau ni cấy mơi trường LB có bổ sung kháng sinh amp(100mg/ml), X-gal IPTG theo tỉ lệ thích hợp Ni cấy qua đêm từ 16h-20h tiến hành nhặt khuẩn lạc trắng, khuẩn lạc xanh nuôi cấy tiến hành tách plasmid từ vi khuẩn theo mục 2.2.6 Plamid thu tiến hành chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% kết thể hình 3.8 Kết cho thấy khuẩn lạc trắng xuất băng vạch băng vạch thứ tương ứng với vạch 5kb DNA marker plasmid pGEM-T-drrC bao gồm vector pGEM-T (3 kb) gen drrC (2,3 kb) Như vậy tạm thời kết luận chuyển gen drrC vào vector biểu pGEM-T thành công Page | 50 M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1: Khuẩn lạc xanh; Mẫu 2,3: Khuẩn lạc trắng Hình 3.8 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc Em tiến hành cắt kiểm tra plasmid pGEM-T-drrC cắt với enzyme giới hạn EcoRI HindIII, kết chạy điện di gel agarose 1% Kết thể hình 3.9 M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1, 2: plasmid pGEM-T-drrC cắt Hình 3.9 Điện di plasmid pGEm-T-drrC cắt enzyme XbaI HindIII Kết điện di thu băng vạch, băng vạch đầu tương ứng với vạch 3kb DNA marker với kích thước plasmid pGEM-T (3kb) vạch sáng thứ tương ứng nằm vạch 2kb 2.5kb DNA marker với kích thước đoạn gen drrC Như kết luận chuyển gen drrC vào vector pGEM-T thành công Page | 51 3.2 Thiết kế vector biểu pIBR25-dAVC 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC Em tiến hành cắt plasmid pGEM-T-drrC, vector biểu pIBR25 enzyme giới hạn EcoRI HindIII Tiến hành tinh sản phẩm cắt từ gel agarose theo mục 2.2.5 Sau tinh ta thu sản phẩm gen drrC pIBR25 cắt Tiếp theo em tiến hành thực phản ứng ligase gen drrC với vector biểu pIBR25 để tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC Biến nạp pIBR25-drrC vào E coli JM109, nuôi cấy môi trường thạch LB-Amp(100mg/ml) thời gian từ 16h-20h ta thu đĩa thạch xuất khuẩn lạc Sau nhặt khuẩn lạc ni lỏng qua đêm để tách DNA plasmid Tiến hành chạy điện di kiểm tra với mẫu plasmid pIBR25 gel agaroge 1% kết thể hình 3.10 Qua hình ảnh điện di (hình 3.10) quan sát thấy vạch sáng plasmid tách chiết có kích thước lớn kích thước pIBR25 Hình 3.10 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1,2,3,5: Vector tái tổ hợp pIBR25-drrC; Mẫu 4: pIBR25 Page | 52 Thực phản ứng PCR để kiểm tra plasmid pIBR25-drrC Sản phẩm chạy điện di gel agarose 1% Kết thể hình 3.11 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC M:1 kb DNA Ladder, Mẫu 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR pIBR25-drrC, Kết điện di thu băng vạch tương ứng nằm vạch 2kb 2.5kb DNA marker với kích thước đoạn gen drrC Như kết luận tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC thành công 3.2.2 Tạo vector biểu pIBR25.dAVC Em tiến hành cắt pIBR25-drrC, gen pGEM-T-doxAV ezyme XbaI EcoRI Sau tiến hành phản ứng nối pIBR25.drrC với đoạn gen doxAV Biến nạp vector pIBR25-dAVC vào E coli JM109, nuôi cấy môi trường thạch LB-Amp(100mg/ml) thời gian từ 16h-20h ta thu đĩa thạch xuất khuẩn lạc Khuẩn lạc mọc môi trường LB-ampicilin tăng sinh tách plasmid Plasmid cắt enzyme giới hạn tương ứng (EcoRI XbaI) sau sản phẩm cắt chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thể hình 3.12 Page | 53 M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1: Sản phẩm cắt plasmid pIBR25-dAVC Hình 3.12 Kết điện di pIBR25-dAVC cắt enzyme XbaI EcoRI Kết điện di thu băng vạch, băng vạch đầu tương ứng nằm băng vạch 10kb 8kb DNA marker với kích thước plasmid pIBR25-drrC (9.8kb) băng vạch thứ tương ứng với vạch 2kb DNA marker với kích thước đoạn gen doxAV Như kết luận thiết kế vector biểu pIBR25.dAVC thành công 3.3 Chuyển vector pIBR25-dAVC tế bào trần (Streptomyces lividans) Nghiên cứu điều kiện chuyển vector pIBR25-dAVC vào tế bào trần Thực tế thí nghiệm cho thấy có số lượng tế bào chuyển thành công thông thường hiệu xuất đạt 0,2 – 0,5% thí nghiệm để khảo sát điều kiện thích hợp hầu hết phải quan sát trực tiếp chủng xạ khuẩn có điều kiện thích hợp cho chuyển gen hoàn toàn khác Đặc biệt tế bào trần protoplast dễ vỡ, yếu dễ bị chết tế bào (Hopwood cs, 2000) Vì cần tác động khơng thích hợp cho dù nhỏ gây chêt tế bào chuyển gen khơng thành cơng Để tìm điều kiện phù hợp cho thành công tạo tế bào tái tổ hợp thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu Page | 54 xuất chuyển gen là: Thời gian ủ lysozyme để loại bỏ lớp thành tế bào (petidoglycan) từ 20 đến 70 phút; nồng độ PEG xúc tác cho trình chuyển gen từ 10 đến 60% nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen từ 50 đến 100 µg.ml-1 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa nuôi tế bào (overlay) STT N độ Thiostrepton µg.ml -1 Khả phát triển vật chủ S.lividans 50 ++ 60 + 70 - 80 - 90 - 100 - Sau chuyển gen quan sát thấy đĩa khuẩn lạc phát triển chậm nhiều so với chủng tự nhiên, tỷ lệ chuyển gen đạt thấp khuẩn lạc tiềm có khả sinh tổng hợp kháng sinh Khi phủ kháng sinh Thiostrepton với dải nồng độ khác nhau, nồng độ chủng tự nhiên bị ức chế khơng phát triển ta lấy nồng độ chuẩn để phủ kháng sinh với mẫu chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc thành công Kết nghiên cứu cho thấy với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen 70 µg.ml-1 tỷ lệ tế bào nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp đạt cao nhất) 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) Kết khảo sát tìm điều kiện thích hợp để chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn tổng kết theo bảng 2.2 Với thời gian xử lý lysozyme Page | 55 50 phút thích hợp số tế bào trần có tỷ lệ sống cao tế bào khả biến thích hợp Trong thực tế thí nghiệm ủ lysozyme thời gian ngắn có lượng tế bào loại bỏ lơp vỏ peptidoglycan, thời gian dài toàn tế bào trần chết Bảng 3.2 Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyển gene STT Thời gian (phút) Tế bào trần thích hợp (giờ) 30 - TB sống cao; - Không chuyển gen - TB sống cao; 40 - Không chuyển gen 50 - Tỷ lệ TB sống cao - Chuyển gen thành công - Tỷ lệ sống thấp 60 - Chuyển gen thành công 70 Tế bào chết 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG bổ sung chuyển gene Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene STT Nồng độ (%) Khả chuyển gen 10 - 20 - 30 + 40 ++ 50 ++ 60 + Ghi chú: (+) phát triển; (-) không phát triển Page | 56 Tương tự nồng độ PEG bổ sung vào dịch tế bào trần (protoplas) có ảnh hưởng lớn đến khả chuyển DNA vào tế bào xạ khuẩn Trong nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ PEG bổ sung vào dịch chuyển gene thực hiên Kết rõ ràng với nồng độ PEG thích hợp 40% tạo hiệu chuyển gene cao (Bảng 3.3) Hình 3.13: Các khuẩn lạc S.lividans pIBR25.dAVC tái tổ hợp phát triển đĩa thạch sau chuyển gen 36 3.4 Tách thu nhận hỗn hợp enzyme thô doxAVC Dòng tế bào tái tổ hợp pIBR25-doxAVC lựa chọn nuôi môi trường kháng sinh Thiostrepton – NDYE Đồng thời chủng S.lividans làm đối chứng nuôi môi trường Thời gian nuôi sau 84h điều kiện 37 0C, 320C 28 0C và, chủng đối chứng chủng tái tổ hơp tách enzyme tổng số có tế bào, đánh giá phân tích gene A, V, C có biểu hay không Áp dụng phương pháp điện di protein SDS-PAGE enzyme thô đối chứng chủng tái tổ hợp (hình 3.14) Kết cho thấy nhiệt độ thích hợp biểu gene 28 0C so sánh với chủng đối chứng thu nhận dự kiến tổ hợp enzyme dnrV, drrC doxA tế bào tương ứng với khối lượng phân tử enzyme tương ứng sau: doxA có trọng lượng phân tử 45,5 kDa, dnrV có khối Page | 57 lượng phân tử tương đương với 30,04 kDa, drrC có khối lượng phân tử 84,04 kDa Khối lượng theo tính tốn từ độ dài gene để tính khối lượng phân tử protein tương ứng Hình 3.14 Điện di enzyme tổng số của: (1) chủng tái tổ hợp nhiệt độ 280C; (băng 2) enzyme tổng số biểu nhiệt độ 370C; (băng 4) nhiệt độ 320C; (Băng 3) enzyme tổng số chủng đối chứng; M: thang protein chuẩn Tuy nhiên lượng enzyme biểu không nhiều đăc tính xạ khuẩn S.lividans làm vật chủ biểu hiện, chủng có tác dụng biểu enzyme giữ ngun hoạt tính enzyme khơng biểu vượt ngưỡng tế bào chấp nhận Như em khẳng định biểu cụm gene doxA, dnrV drrC tế bào S.lividans Page | 58 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Em thực kết sau: - Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25-doxAVC để biểu vật chủ Streptomyces lividans TK24 - Đã tìm điều kiện để chuyển gene vào tế bào trần vật chủ S.lividans, tạo chủng tái tổ hợp S.lividans –pIBR25-dAVC - Biểu nhóm gene doxAVC tế bào vật chủ thu nhận hỗn hợp enzyme thô từ tế bào 4.2 Đề xuất - Thực nghiên cứu để xác định hoạt tính hỗn hợp enzyme kỹ thuật - Ứng dụng enzyme kỹ thuật vào chuyển hố Daunorucinon thành Doxorubicin mơi trường ống nghiệm Page | 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Xuân Phương (2000), vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất xây dựng Hà Nội, tr 47-49 Cao Văn Thu, (2000), giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghệ Dược - trường Đại Học Dược Hà Nội PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học tập Brawner, Mary; Poste, George; Rosenberg, Martin; Westpheling, Janet (1991) "Streptomyces: A host for heterologous gene expression" Current Opinion in Biotechnology2 Howard T Dulmage (March 1953) "The Production of Neomycin by Streptomyces fradiae in Synthetic Media" Applied Microbiology Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994): "Interference by doxorubicin with ADN unwinding in MCF-7 breast tumor cells" Mol Pharmacol 45 (4): 649–56 Euzéby JP (2008) "Genus Streptomyces" List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature.I Aklanonic acid-producing mutants of Streptomyces galilaeus and Streptomyces peucetius var caesius Dr B Schlegel, C Stengel, G Schumann, H Prauser and K Eckardt, Journal of Basic Microbiology, 1987, Volume 27, Issue 2, pases 107–111 Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3 Kämpfer, Peter (2006) "The Family Streptomycetaceae, Part I: Taxonomy" In Dworkin, Martin; Falkow, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heinz; Stackebrandt, Erko.The Prokaryotes Page | 60 10 Doxorubicin Overproduction in Streptomyces peucetius: Cloning and Characterization of the dnrU Ketoreductase and dnrV Genes and the doxACytochrome P-450 Hydroxylase Gene 11 Caroline A.A Katherline L.M (1998) Eukaryotic ADN Topoisomease II beta Review BioEssays 20:215-226 12 The Streptomyces peucetius drrC gene encodes a UvrA-like protein involved in daunorubicin resistance and production 13 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (August 1976): "Effect of adriamycin on ADN, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 (8): 2891–5 14 Madigan M, Martinko J, ed (2005) Brock Biology of Microorganisms (11th ed.) 15 Champoux JJ (2001) "ADN topoisomerases: structure, function, and mechanism" Annu Rev Biochem 70: 369–413 doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.369 Page | 61 ... lượng DXR giảm đáng kể Vì vậy, em tiến hành thực nghiên cứu đề tài mang tên: Nghiên cứu thiết kế biểu nhóm gen doxAVC chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp... [3] Page | 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên Đặc điểm xạ khuẩn Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống vi khuẩn [9] Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu... thành nhóm sau: • Nhóm1 : Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, tác dụng lên loại hay nhóm vi khuẩn • Nhóm 2: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng • Nhóm 3: Nhóm kháng sinh dùng ngồi • Nhóm 4: Nhóm