Thiết kế và biểu hiện gen doxAV trong chủng xạ khuẩn streptomyces lividans

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN GEN doxAV TRONG CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS Giáo viên hướng dẫn: TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên: Đỗ Thị Phương Thảo Lớp : KSCNSH - 1302 Khoa: Công Nghệ Sinh Học HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo công tác khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện cho chúng em học tập môi trường khoa học hồn thiện Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy Người dành nhiều thời gian tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư cơng nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực tập hồn thành đề tài nghiên cứu Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, tồn thể bạn phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng, khơng thể tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên em mong nhận góp ý quý thầy – để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Đỗ Thị Phương Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Lịch sử kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 10 1.3 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 11 1.3.1 Giới thiệu chung kháng sinh Doxorubicin 11 1.3.2 Cấu trúc Doxorubin 12 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 13 1.3.4 Cơ chế hoạt động hoạt tính sinh học Doxorubicin 14 1.4 Các nghiên cứu ứng dụng kháng sinh Doxorubicin toàn giới 16 1.4.1 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 16 1.4.2 Ứng dụng cuả Doxorubicin 17 1.4.3 Thành tựu nghiên cứu 18 1.5 Giới thiệu chung gen doxA, dnrV 20 1.5.1 Gen doxA 20 1.5.2 Gen dnrV 22 1.5.3 Vai trò liên kết hỗ trợ doxA dnrV 23 1.6 Vector tách dòng pGEM-T vector biểu pIBR25 23 1.6.1 Vector tách dòng pGEM-T Easy 23 1.6.2 Vector biểu pIBR25 24 1.7 Mục tiêu nội dung đề tài 25 1.7.1 Mục tiêu đề tài 25 1.7.2 Nội dung đề tài 26 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường thiết bị 28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Môi trường 28 2.1.3 Hóa chất 30 2.1.4 Thiết bị 33 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 34 2.2.2 Phương pháp PCR 35 2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn 35 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 37 2.2.5 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 37 2.2.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn 38 2.2.7 Phương pháp nối DNA 38 2.2.8 Phương pháp cắt DNA enzyme giới hạn 39 2.2.9 Phương pháp chuyển gen sốc nhiệt 39 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào Streptomyces lividans TK24 41 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Tách dòng gen doxAV 43 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ xạ khuẩn S.peucetius ATCC27952 43 3.2.2 Nhân gen doxAV phản ứng PCR 44 3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-doxAV 46 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 48 3.3 Chuyển vector pIBR25-dAV tế bào trần (Streptomyces lividans) 52 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào 53 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) 54 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG bổ sung chuyển gene 55 3.4 Tách thu nhận hỗn hợp enzyme thô doxAV 55 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề xuất 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng 30 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng 33 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa nuôi 53 tế bào (overlay) Bảng 3.2 Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyển gene 54 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene 55 DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian hóa học Doxorubicin 13 Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian Daunorubicin Doxorubicin 13 Hình 1.4 Các gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng 14 sinh DXR Hình 1.5 Tóm tắt phản ứng xúc tác gen doxA 22 Hình 1.6 Cấu trúc pGEM – T vector dùng tách dòng gen 24 Hình 1.7 Cấu trúc pIBR25 dùng biểu gen 25 Hình 1.8 Sơ đồ thí nghiệm 27 Hình 3.1 Điện di kết tách chiết ADN tổng số chủng xạ 43 khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Hình 3.2 Điện di kết PCR nhân gen doxAV; 1,2: Sản phẩm PCR ADN tổng số từ xạ khuẩn 45 S.peucetius ATCC27952 Hình 3.3 Tinh sản phẩm PCR gen doxAV 45 Hình 3.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp doxAV-pGEM T 46 Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEM T-doxAV vào vi 47 khuẩnE Coli JM109 Hình 3.6 Tách plasmid từ khuẩn lạc E coli JM109 trắng 47 Hình 3.7 Cắt kiểm tra plasmid dòng E coli JM1109 mang 48 pGEM-T-doxAV Hình 3.8 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 49 Hình 3.9 Cắt vector pGEM-T.doxA vector pIBR25 50 enzyme XbaI EcoRI Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T- 51 doxAV vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI Hình 3.11 Kiểm tra khuẩn lạc chuyển vector pIBR25 52 cắt hai enzyme EcoRI/XbaI Hình 3.12 Điện di enzyme tổng số gen doxAV 56 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỞ ĐẦU Bệnh ung thư coi bệnh nan y nguy hiểm phát với số ca mắc bệnh ngày gia tăng giới Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO) năm 2014 cho thấy tới năm 2035 số lượng bệnh nhân mắc bệnh ung thư đạt 24 triệu người tăng 70% so với năm 2012 14,1 triệu người Nhưng số nước phát triển Hoa kỳ, theo thống kê tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong bệnh ung thư hai thập kỷ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người năm 1991 xuống 175/100.000 người năm 2010 Điều chứng tỏ vai trò vơ quan trọng chất kháng sinh tham gia vào trình điều trị ung thư.Tuy nhiên, kho tàng thuốc kháng sinh ngày trở nên hạn hẹp khan Tốc độ phát triển loại kháng sinh kháng lồi vi sinh vật gây bệnh khơng thể bắt kịp sức tăng trưởng biến đổi mầm bệnh kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính tồn cầu đặc biệt trội nước phát triển Với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí có liên quan việc chữa trị trở thành gánh nặng lớn với bệnh nhân Chính vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lí người bệnh việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng sản xuất loại kháng sinh nghĩa vụ trách nhiệm nhà khoa học toàn giới Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điểm vượt trội có phổ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình sinh tổng hợp tế bào ung thư ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Doxorubicin loại kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Trong đường sinh tổng hợp tự nhiên chủng xạ khuẩn Strepyomyces peucetius hàm lượng DNR tạo với hàm lượng lớn nhiều so với DXR Một biện pháp tăng sản lượng kháng sinh DXR thực phản ứng chuyển hóa invitro nhằm DNR thành DXN Trong số 37 gen tham gia q trình chuyển hóa DNR thành DXR gen doxAV mã hóa, tổng hợp Cytochrome P450 Hydroxylase, xúc tác cho phản ứng oxyl hóa hydroxylation vị trí C14 cấu trúc kháng sinh DNR để chuyển đổi thành DXR Với tầm quan trọng em thực nghiên cứu đề tài: “Thiết kế biểu gen doxAV chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans” đểchứng minh chức gen nhằm tang hiệu suất chuyển hóa DNR thành DXR ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ N NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC màu trắng ng khuẩn khu lạc mang vector pGEM-T tự đóng óng vvòng có màu xanh Kết ni cấy y đư thể hình 3.5 Hình 3.5 Biến nạp p vector tái tổ t hợp pGEM T-doxAV vào vi khuẩnE E Coli JM109 Để kiểm tra kếtt qu gắn gen doxAV vào vector pGEM-T T Easy đồng thời sàng lọc chủng ng mang vector tái tổ t hợp Tiến hành nhặtt ng ngẫu nhiên bốn khuẩn lạc trắng rồii nuôi 3ml môi trường tr LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp(100 µg/ml) lắcc 200 vòng/phút, để qua đêm 37°C Sau đđó, tiến hành tách plasmid chạyy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kếtt qu thu hình 3.6 Hình 3.6 Tách plasmid từ khuẩn lạc E coli JM109 trắắng Giếng 1÷ 4: Plasmid khuẩnn lạc l trắng; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO O - LỚP 13-02 Page 47 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Từ hình 3.6, thấy xuất băng vạch tương ứng với kích thước khoảng 5kb, phù hợp với kích thước plasmid pGEM-T.doxAV 5115bp Vậy kết luận chuyển gen thành công pGEM-T-doxAV vào E.coli JM109 Để khẳng định nhận xét hoàn tồn xác, tiến hành cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM109 mang pGEM-T-doxAV hai enzym cắt giới hạn XbaI EcoR Sản phẩm chạy điện di, thể hình 3.7: Hình 3.7 Cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM1109 mang pGEM-T-doxAV 1,2: plasmid vector Pgem-T-doxAV; M: GeneRuler 1kb ADN Ladder Từ kết điện di hình cho thấy hai giếng số xuất hai băng vạch, băng vạch phía có độ dài tương ứng với vạch 2kp thang maker chuẩn, phù hợp với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước tương ứng với vạch 3kb thang marker phù hợp với kích thước vector pGEM-T Easy 3015bp Do khẳng định tách dòng thành công gen doxAV pGEMT 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Trong đề tài sử dụng vector pIBR25làm vector biểu gen doxA Chủng vi khuẩn E coli JM109 lựa chọn chủng vi khuẩn kiểm tra ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 48 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC tạo thành vector tái tổ hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 tế bào vật chủ biểu gen doxAV Hình 3.8: Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Cắt plasmid pGEM T-doxAV plasmid vector pIBR25 enzyme XbaIvà EcoRI Tiến hành cắt plasmid pGEM T-doxAV enzyme giới hạn XbaIvà EcoRI để thu nhận đoạn gen doxAV Đồng thời, cắt vector pIBR25 hai loại enzyme để tạo hai đầu dính tương ứng với gen doxAV Phản ứng cắt plasmid vector pGEM T-doxAV plasmid pIBR25 thực 300C ủ giờ.Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 49 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.9 Cắt vector pGEM-T.doxA vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI 1,2: Sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-doxAV; 3,4: Sản phẩm cắt plasmid vector pIBR25; M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Từ kết điện di hình cho thấy hai giếng số xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương đương với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước tương đương với vạch 3kb thang marker phù hợp với kích thước vector pGEM-T Easy vector 3015bp Trên giếng số thấy xuất băng vạch gần vạch 8kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước 7500bp vector pIBR25 Như cắt thành cơng vector pGEM T-doxAV tạo vị trí tương thích để gắn gen doxAV vào vector pIBR25 Tiến hành cắt lấy băng vạch có gen doxAV băng vạch vector pIBR25 đem tinh Kết sau tinh điện di gel agarose 1% thể hình 3.10 ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 50 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T-doxAV vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI; Giếng 1: Plasmid vector pGEM T-doxAV; Giếng 2: Plasmid vector pIBR25; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Biến nạp vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV vào vi khuẩn E.coli JM109 Thực phản ứng nối gen doxA vào vector pIBR25 enzyme T4 DNA ligase 40C, để ủ qua đêm (14-16h) Để kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV, tiến hành biến nạp sản phẩm vào vi khuẩn E coli JM109 Sàng lọc chủng mang vector tái tổ hợp mơi LB có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml) Sau nuôi cấy 16h 370C, đĩa thạch xuất khuẩn lạc Tiến hành nuôi cấy ngẫu nhiên năm khuẩn lạc 3ml mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml), ni lắc với tốc độ 150 rpm nhiệt độ 370C 16h Sau tiến hành tách plasmid, thực phản ứng cắt emzym XbaI EcoRI Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% hình 3.11: ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 51 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hình 3.11 Kiểm tra khuẩn lạc chuyển vector pIBR25 cắt hai enzyme EcoRI/XbaI ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder; Giếng 1-5 : Plasmid dòng đánh số từ đến Qua ảnh điện di kết rõ khuẩn lạc số 2, khuẩn lạc xác chuyển thành công vector pIBR25.doxAV bởitrên ba giếng số 2, xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước gen doxAV 2100bp , băng vạch phía có kích thước vạch 7kb thang marker phù hợp với kích thước vector pIBR25 7500bp Do đó, khẳng định tạo thành cơng vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV E coli JM109 3.3Chuyển vector pIBR25-doxAV tế bào trần (Streptomyces lividans) Nghiên cứu điều kiện chuyển vector pIBR25-doxAV vào tế bào trần: Thực tế thí nghiệm cho thấy có số lượng tế bào chuyển thành công thông thường hiệu xuất đạt 0,2 – 0,5% thí nghiệm để khảo sát điều kiện thích hợp hầu hết phải quan sát trực tiếp chủng xạ khuẩn có điều kiện thích hợp cho chuyển gen hoàn toàn khác Đặc biệt tế bào trần protoplast dễ vỡ, yếu dễ bị chết tế bào (Hopwood cs, 2000) ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 52 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Vì cần tác động khơng thích hợp cho dù nhỏ gây chêt tế bào chuyển gen không thành cơng Để tìm điều kiện phù hợp cho thành cơng tạo tế bào tái tổ hợp thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu xuất chuyển gen là: Thời gian ủ lysozyme để loại bỏ lớp thành tế bào (petidoglycan) từ 20 đến 70 phút; nồng độ PEG xúc tác cho trình chuyển gen từ 10 đến 60% nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen từ 50 đến 100 µg.ml-1 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh Thiostrepton phủ tế bào Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa nuôi tế bào (overlay) N độ Khả phát triển vật chủ Thiostreptonµg.ml-1 S.lividans 50 ++ 60 + 70 - 80 - 90 - 100 - STT Sau chuyển gen quan sát thấy đĩa khuẩn lạc phát triển chậm nhiều so với chủng tự nhiên, tỷ lệ chuyển gen đạt thấp khuẩn lạc tiềm có khả sinh tổng hợp kháng sinh Khi phủ kháng sinh Thiostrepton với dải nồng độ khác nhau, nồng độ chủng tự nhiên bị ức chế không phát triển ta lấy nồng độ ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 53 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC chuẩn để phủ kháng sinh với mẫu chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc thành công Kết nghiên cứu cho thấy với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen 70 µg.ml-1 tỷ lệ tế bào nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp đạt cao nhất) 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng enzyme (lysozyme) Bảng 3.2 Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyển gene STT Thời gian (phút) Tế bào trần thích hợp (giờ) 30 - TB sống cao; - Không chuyển gen 40 - TB sống cao; - Không chuyển gen 50 - Tỷ lệ TB sống cao - Chuyển gen thành công 60 - Tỷ lệ sống thấp - Chuyển gen thành công 70 Tế bào chết Kết khảo sát tìm điều kiện thích hợp để chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn tổng kết theo bảng 3.2 Với thời gian xử lý lysozyme 50 phút thích hợp số tế bào trần có tỷ lệ sống cao tế bào khả biến thích hợp Trong thực tế thí nghiệm ủ lysozyme thời gian ngắn có lượng tế bào loại bỏ lơp vỏ peptidoglycan, thời gian dài toàn tế bào trần chết ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 54 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG bổ sung chuyển gene Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyển gene STT Nồng độ (%) Khả chuyển gen 10 - 20 - 30 + 40 ++ 50 ++ 60 + Ghi chú: (+) phát triển; (-) không phát triển; Tương tự nồng độ PEG bổ sung vào dịch tế bào trần (protoplas) có ảnh hưởng lớn đến khả chuyển DNA vào tế bào xạ khuẩn Trong nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ PEG bổ sung vào dịch chuyển gene thực hiên Kết rõ ràng với nồng độ PEG thích hợp 40% tạo hiệu chuyển gene cao 3.4 Tách thu nhận hỗn hợp enzyme thơ doxAV Dòng tế bào tái tổ hợp pIBR25-doxAV lựa chọn nuôi môi trường kháng sinh Thiostrepton – NDYE Đồng thời chủng S.lividans làm đối chứng nuôi môi trường Thời gian nuôi sau 84h điều kiện 37 0C, 320C 28 0C và, chủng đối chứng chủng tái tổ hơp tách enzyme tổng số có tế bào, đánh giá phân tích gene A,V có biểu hay khơng Áp dụng phương pháp điện di protein SDS-PAGE enzyme thô đối chứng chủng tái tổ hợp (hình 3.12) Kết cho thấy nhiệt độ thích hợp biểu gene 28 0C so sánh với chủng đối chứng thu ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 55 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC nhận dự kiến tổ hợp enzyme dnrV doxA tế bào tương ứng với khối lượng phân tử enzyme tương ứng sau: doxA có trọng lượng phân tử 45,5 kDa, dnrV có khối lượng phân tử tương đương với 30,04 kDa Khối lượng theo tính tốn từ độ dài gene để tính khối lượng phân tử protein tương ứng Tuy nhiên lượng enzyme biểu không nhiều đăc tính xạ khuẩn S.lividans làm vật chủ biểu hiện, chủng có tác dụng biểu enzyme giữ ngun hoạt tính enzyme không biểu vượt ngưỡng tế bào chấp nhận Như nhóm nghiên cứu khẳng định biểu gene doxAV tế bào S.lividans M Hình 3.12 Điện di enzyme tổng số gen doxAV 1: chủng tái tổ hợp nhiệt độ 280C; 2: chủng tái tổ hợp nhiệt đọ 320C; 3:M: thang protein chuẩn ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 56 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Đề tài thực kết sau: - Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25-doxAV để biểu vật chủ Streptomyceslividans TK24 - Đã tìm điều kiện để chuyển gene vào tế bào trần vật chủ S.lividans, tạo chủng tái tổ hợp S.lividans –pIBR25-dAV - Biểu nhóm gene doxAV tế bào vật chủ thu nhận hỗn hợp enzyme thô từ tế bào 4.2 Đề xuất - Thực nghiên cứu để xác định hoạt tính hỗn hợp enzyme thô - Phối hợp enzyme kỹ thuậtdoxAV với enzyme kỹ thuậtdoxC để chuyển hóa tổng hợp doxorubicin môi trường ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 57 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Văn Thu, (2000), giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghệ Dược - trường Đại Học Dược Hà Nội Lê Xuân Phương (2000), vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất xây dựng Hà Nội, tr 47-49 PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học tập Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường đại học sư phạm Thái Nguyên Nguyễn Bảo Hưng(2010), Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm trichoderma, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường đại học khoa học, Đại học Huế Tiếng Anh 15 Weiss RB (December 1992): "The anthacylines will we ever find a better Doxorubicin " Seminars in Oncology 19 (6): 670- 86 16 Tan C, Tasaka H, Yukp, Murphy ML, Karnofsky DA (March 1967): " Daunorubicin an antitumor antibiotic in the treatment of neoplastic disease ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 58 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC clinical evaluation with special reference to childhood leukemia ", Cancer 20 (3): 333-53 17 Arcamone F, CassineHG, Fantini G et al (1996): " Adriamycin 14Hydroxydaunomycin, a new antitunmor antibiotic from Streptomyces Peucetius Varaesius " , Biotechnol Bioeng 11 (6): 1101-10 18 Lomovskaya N, Otten SL, Doikatayama Y et al (1999) : " Daunorubicin over production in Streptomyces Peucetius: Cloning and characterization of the dnrU keto recductase and dnrV gene and the Dox a Cytochrome P-450 hydroxylase gene", J Bacteriol 181 (1): 305-18 19 Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B (February 1969) : "Adriamycin (NSC-123,127): a new antibiotic with antitumor activity" Cancer Chemother Rep 53 (1): 33–7 20 Walcazak RJ, Dickens ML, Priestley ND, Strohl WR (1999): "Purification, Properties, and Characterization of Recombinan Streptomyces sp Strain C5 DoxA, a Cytochrome P-450 Catalyzing Multiple Steps in Doxorubicin Biosynthesis 21 Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994): "Interference by doxorubicin with ADN unwinding in MCF-7 breast tumor cells" Mol Pharmacol 45 (4): 649–56 22 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (August 1976) : "Effect of adriamycin on ADN, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 (8): 2891–5 23 "National Academy of Sciences: NAS Award in Molecular Biology" National Academy of Science Retrieved 2009-01-07or Unwinding the ADN Topoisomerase Story: the Work of James C Wang ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 59 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 24 Yves (May 28, 2010) "ADN topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs" Chemistry & Biology Retrieved May 28, 2010 25 Champoux JJ (2001) "ADN topoisomerases: structure, function, and mechanism".Annu Rev Biochem 70 : 369–413 Doi : 10.1146/annurev biochem 70.1.369 26 Caroline A.A , Katherline L.M ,(1998) Eukaryotic ADN Topoisomease II beta Review BioEssays 20:215-226 27 Lown J.W.,(1993) Anthracyline and anthraquinone anticancer agents:current status and recent developments Phamacol Ther 60(2): 185214 28 Ronal M Atlas, Microoganism in our world, Publish by Mosby-year book, Inc, 1995 29 Waksman, S.A The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, 1961, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 30 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007/4, 17 (3): 162 - 170 31 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams Wilkins Co, Baltimore, USA 32 Jiang H, Hutchinson C R., (2006) "Feedback regulation of doxorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius" Res Microbiol 157 (7): 666–74 ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 60 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 33 Doxorubicin Overproduction in Streptomyces peucetius: Cloning and Characterization of the dnrU Ketoreductase and dnrV Genes and the doxA Cytochrome P-450 Hydroxylase Gene 34 Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3 ĐỖ THỊ PHƯƠNG THẢO - LỚP 13-02 Page 61 ... thành DXR Với tầm quan trọng em thực nghiên cứu đề tài: Thiết kế biểu gen doxAV chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans đểchứng minh chức gen nhằm tang hiệu suất chuyển hóa DNR thành DXR ĐỖ THỊ... liên kết hỗ trợ doxA dnrV Lý mồi ngược gen dnrV lại giống mồi ngược gen doxA gen doxA gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Gen. .. Castel Del Monte lỗ lực cố gắng họ phát chủng xạ khuẩn .Chủng xạ khuẩn tạo hợp chất có sắc tố đỏ có hoạt tính chống lại khối u chuột tốt Chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius [15] Cùng thời gian