BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN" pdf

TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B HBcAg PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh, Đồng Văn

TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh, Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ sinh học

I MỞ ĐẦU

Viêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xem

là một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng kháng

nguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận định

HBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới Bệnh này

thường để lại hậu quả nghiêm trọng là xơ gan và ung thư gan với tỷ lệ tử vong cao Do vậy viêm gan B hiện là một vấn đề đang được chú trọng trong chương trình bảo vệ sức

khoẻ cộng đồng toàn cầu [1]

Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay

có khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV trên toàn cầu, như vậy HBV có thể được xem như một trong những mầm bệnh phổ biến nhất đối với con người Số người chết liên quan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới khoảng 2 triệu người Ở Việt Nam, theo báo cáo của bộ Y tế từ năm

1978 đến năm 1990, số mắc viêm gan B khoảng 20.000 người/năm và tỷ lệ tử vong là 0,7% - 0,8% Hiện tại, Việt nam vẫn đang được xếp vào một trong những quốc gia có

tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [3] Điều

quan trọng là cho đến nay chưa có một hoá trị liệu nào đặc hiệu để điều trị viêm gan B Phương pháp duy nhất để tránh viêm gan B là dự phòng bằng vắc xin Vì vậy có thể coi dự phòng viêm gan B cũng là một biện pháp hữu hiệu để dự phòng ung thư gan nguyên phát Trước tình hình lây nhiễm của HBV như hiện nay, thì việc đẩy mạnh sản xuất vắc xin trong nước bằng việc nhập khẩu một dây chuyền công nghệ hiện đại kết hợp với việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen từ đối tượng gây bệnh phân lập trong nước là cần thiết Chúng tôi đã nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu

hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan

B với mục đích sản xuất được loại kháng nguyên này để tạo

ra bộ sinh phẩm chẩn đoán viêm gan B cũng như phát triển vắc xin tái tổ hợp [4, 5, 7] Tuy nhiên, để có thể đánh giá một cách chính xác về mặt dịch tễ học của virus viêm gan

B thì việc phối hợp giữa phát hiện HBsAg, kháng thể

kháng HBsAg và kháng thể kháng HBcAg là cần thiết

Kháng thể kháng HBcAg hình thành sớm và tồn tại gần như suốt cả cuộc đời người đã bị nhiễm HBV, vì vậy khó

có thể bỏ sót các trường hợp hợp nhiễm HBV nếu phát hiện kháng thể loại này

Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành tách

dòng và thiết kế vectơ để biểu hiện gen mã hóa kháng

nguyên lõi của virus viêm gan B (gen hbc) từ khối u của bệnh nhân ung thư gan nhằm thu nhận kháng nguyên lõi tái

tổ hợp để phục vụ công tác chẩn đoán

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR: Cặp mồi dùng cho

phản ứng PCR được thiết kế nhờ chương trình phần mềm PC/Gene dựa trên trình tự của đoạn ADN thuộc genôm của virus viêm gan B chứa gen hbc đã được công bố trong

Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [2] Vị trí bám của mồi vào vùng chứa gen hbc được nêu ở hình 1

Hình 1: Vị trí của cặp mồi HBCP1, HBCM1 trong một vùng ADN genôm của virus viêm gan B, chứa toàn bộ gen kháng nguyên lõi của virus viêm gan B với chiều dài 552 cặp bazơ (phần in đậm) Theo lý thuyết, cặp mồi HBCP1, HBCM1 tạo ra sản phẩm PCR với chiều dài là 619 cặp

bazơ

Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR được tiến hành với 100 ng ADN tách từ khối u làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệu HBCP1 và HBCM1, có trình tự như sau:

HBCP: 5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3'

HBCM1:5'-TCCCACCTTATGAGTCCAAGGG-3'

Sử dụng 1 đơn vị Taq Polymeraza của công ty Perkin

Elmer cho mỗi ống phản ứng PCR được tiến hành nhờ máy chu kỳ nhiệt MJ PTC-100 (Mỹ) với chương trình như sau: Biến tính ADN trong 3 phút rồi chạy 30 chu kỳ (95 0C

50 giây, 550C 50 giây, 72 0C 1 phút 25 giây) Sau khi kết thúc chu kỳ, giữ ở nhiệt độ 720C 8 phút sau đó giữ ở 40C Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%

Tách dòng gen được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM với bộ Kit của hãng Invitrogen Gen hbc tái tổ hợp với vectơ tách dòng

trước hết được kiểm tra bằng cắt với enzym giới hạn EcoR

I, sau đó được giải trình tự với máy xác định trình tự ADN

tự động (ALFExpress) với bộ Kit của hãng

Amersham-Pharmacia Biotech

Sau khi giải trình tự, gen được dịch mã sang protein và so sánh với trình tự axit amin kháng nguyên HBcAg của các tác giả khác bằng chương trình phần mềm PC/gene

Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để thiết kế vectơ biểu hiện gen hbc ở E coli Cặp mồi treo hai vị trí giới hạn EcoR I và Hind III có trình tự:

HBcR1: GGAATTCATGGACATTGACCC

EcoR I

HBcH3: AAGCTTCTAACATTGAGATTCC

Hind III

Tiến hành PCR với cặp mồi HBCR1 và HBCH3, sau đó gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 để tạo dòng phụ Gen hbc được cắt ra khỏi vector tách dòng pCR

2.1 bằng EcoR I và Hind III, sau đó gắn vào vectơ

pMAL-c2 để thu nhận vectơ tái tổ hợp Vectơ mang gen hbc được biến nạp vào E coli chủng BL21 và cho biểu hiện để thu protein tái tổ hợp

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Để nhân bản gen mã hoá cho kháng nguyên lõi của virut viêm gan B, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi HBCP1, HBCM1 và khuôn là 100 ng ADN tách từ khối u của bệnh nhân ung thư gan Với cặp mồi này, sản phẩm PCR thu được có chiều dài tính theo lý thuyết là 619 cặp bazơ Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% kết quả được chỉ ra ở hình 2

Hình 2: Điện di trên gel agaroza 1% kiểm tra sản phẩm PCR được tiến hành với khuôn là ADN tách chiết từ khối u

của bệnh nhân ung thư gan với cặp mồi HBCP1, HBCM1

Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và

EcoR I) Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được gắn vào vectơ PCRTM và biến nạp

vào vi khuẩn E coli chủng DH-5 ADN plasmid được

tách từ các khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng bằng phương pháp miniprep sau đó được tuyển chọn để thu nhận các plasmid

có khả năng mang gen hbc bằng cách điện di trên gel agarose 1% Chọn các plasmid có kích thước lớn hơn plasmid gốc để kiểm tra trước hết bằng cắt với enzyme giới

hạn EcoRI (hình 4)

Kết quả ở hình 4 cho thấy chỉ có plasmid tách từ clôn số 15 mang gen hbc Theo tính toán thì đoạn ADN được nhân bản chứa gen hbc có chiều dài 619 cặp bazơ Sau khi xử lý

với EcoR I, chỉ có plasmid tách từ clôn số 15 có đoạn ADN

được tách ra khỏi vector tái tổ hợp có chiều dài nằm trong vùng dự tính Để có thể khẳng định chắc chắn, chúng tôi đã

tiến hành xác định trình tự gen hbc với máy xác định trình

tự ADN tự động Trình tự gen hbc phân lập ở Việt Nam đã được đăng ký trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế với số đăng ký AJ298864 Gen hbc cũng đã được dịch mã sang protein và so sánh trình tự axit amin với trình tự axit amin của kháng nguyên lõi của virus viêm gan B đã được các tác giả Nhật Bản công bố Kết quả cho thấy độ tương đồng đạt tới 93,4 % (hình 5)

Hình 4: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn các

plasmid tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và

EcoR I) Kênh 1: Plasmid tách từ clôn 15; kênh 2: Plasmid

tách từ clôn 12

Hình 5: So sánh trình tự axit amin giữa HBcAg Viet Nam (HBCVN) và HBcAg của Nhật Bản (HBCNB) và nhận

được sự tương đồng cao (93,4%)

Biểu hiện gen hbc trong E coli được thực hiện với vectơ pMAL-c2 Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại có độ dài

566 cặp bazơ Sau khi xử lý với EcoR I và Hind III được

gắn vào vectơ pMAL-c2 rồi biến nạp vào E coli chủng

DH5 Plasmit tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt với EcoR

I và Hind III

Kết quả kiểm tra được nêu ở hình 6 Sau khi đã kiểm tra một cách chắc chắn, plasmit tái tổ hợp được biến nạp vào

E coli chủng BL21 (DE3) và cho biểu hiện để thu nhận

protein tái tổ hợp Biểu hiện gen hbc tái tổ hợp được cảm ứng bằng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM Protein tái

tổ hợp là loại protein liên kết với protein có ái lực với

maltoza (MBP) Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng điện di gel polyacrylamit 12,5 % được nêu ở hình 7

Hình 6: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn vectơ

pMAL-c2 tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI

và Hind III Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng

Hind III và EcoR I) Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Plasmid tách từ các

clôn khác nhau Sau khi cắt bằng EcoRI và Hind III, gen

hbc sẽ được tách khỏi vectơ

Hình 7: Điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra protein HBcAg tái tổ hợp Kênh M: Chỉ thị phân tử (từ cao xuống thấp: 93, 67, 43, 30, 20,1 và 14,4 kDa) Kênh 1: mẫu trước cảm ứng Kênh 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Mẫu sau cảm ứng

0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 giờ

IV KẾT LUẬN

Gen mã hóa cho kháng nguyên lõi của virus viêm gan B đã được nhân bản từ ADN tách từ khối u của bệnh nhân ung thư gan, sau đó được tạo dòng, xác định trình tự và dịch mã sang protein Gen này có chiều dài 552 cặp bazơ và mã hóa cho một protein dài 183 axit amin So sánh trình tự axit amin của HBcAg của Việt Nam và HBcAg được các tác giả

Nhật Bản công bố trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế thấy có sự tương đồng cao (93,4%) [2]

Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để biểu hiện gen hbc ở E

coli Sau khi xử lý sản phẩm PCR và vectơ đồng thời với 2

enzyme giới hạn là EcoR I và Hind III, gen hbc được gắn vào vectơ nhờ ligaza và biến nạp vào E coli chủng BL21

(DE3) Cảm ứng được tiến hành với 1mM IPTG trong

khoảng thời gian 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 giờ

Protein tái tổ hợp đươc kiểm tra bằng điện di trên gel

polyacrylamide 12,5 % Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng bằng IPTG, protein tái tổ hợp tăng dần theo thời gian từ 30 phút đến 4 giờ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tạp chí:

1 Blumberg, B S., 1997

Hepatitis B virus, the vaccine, and the control of primary cancer of the liver Proc Natl Acad Sci USA, 94,

7121-7125

2 Horikita M., Itoh S., Yamamoto K., Shibayama T.,

Tsuda F., Okamoto H., 1994

Differences in the entire nucleotide sequence between

hepatitis B virus genomes from carriers positive for

antibody to hepatitis B e antigen with and without active disease J Med Virol 44:96-10

3 Trịnh Quân Huấn 2000:

Virus viêm gan B NXB Y học, 2000

4 Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1996 Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen kháng nguyên

bề mặt của virut viêm gan B từ khối u của bệnh nhân ung thư gan Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, 1996: 20-25

5 Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1998 Trình tự gen kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B phân lập từ khối u của bệnh nhân ung thư gan EMBL gene bank số HBV012481

6 Đinh Duy kháng, Nguyễn Văn Vũ, Đái Thị Hằng Nga, Nguyễn Thị Nga, Đái Duy Ban, 1999

Ứng dụng kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) để phát hiện

ADN của virut viêm gan B trong khối U của bệnh nhân ung thư gan Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc,

1151-1156

7 Đồng Văn Quyền, Bạch Như Quỳnh, Đái Duy Ban, Đinh Duy Kháng 1999

Nghiên cứu biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) ở trực khuẩn Escherichia coli Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 239-244

8 Dong Van Q., Bach Nhu Q., Le Thi T., Dinh Duy K

2000

Cloning of gene encoding hepatitis B virus core antigen (HBcAg) AC # AJ298864

SUMMARY

Cloning and expression of the gene encoding hepatitis B core antigen

from human liver tumor biopsies

Dang Truong Minh, Le Thi Tam, Bach Nhu Quynh, Dong Van Quyen, Dinh Duy Khang

Institute of Biotechnology

The gene encoding hepatitis B core antigen has been cloned from human liver tumor biopsies This gene is 549 bp long and codes for the 183 amino acid long protein The amino acid sequence of the hepatitis B core antigen that isolated

by us had high identity (93,4%) when the alignment with the HBcAg sequence of Japanese authors was carried out [2]

The pMAL-c2 vector was used for hbc gene expression in

E coli After purification, the PCR product was treated

with EcoR I and Hind III then ligated into pMALC2

expression vector with the same restriction sites using T4

ligase The ligate was transformed competent cells E coli

DH5, then we selected the recombinant plasmids that

ware able to carry hbc gene Plasmids were extracted from randomly picked up colonies and checked with agarose gel electrophoresis using original pMALC2 vector as standard

We colected only the plasmids with larger size for checking

with restriction enzyme EcoR I and Hind III Result of

digestion with restriction enzyme confirmed that, the hbc

gene was already inserted into pMALC2 vector to be

available for E coli transformation Recombinant vectors were used to transforme E coli strain BL21 (DE3) for

expression The expected fusion protein with molecular mass about 61 kDa would be expressed after 3 hours

induction with 1 mM IPTG The fusion protein included maltose binding protein (MBP) with molecular mass 41 kDa and recombonant HBcAg with predicted molecular mass 20 kDa were checked with polyacrylamide gel

electrophoresis

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Đinh Duy Kháng