BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN" pdf

TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh, Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học I. MỞ ĐẦU Viêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xem là một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới. Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng kháng nguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận định HBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới. Bệnh này thường để lại hậu quả nghiêm trọng là xơ gan và ung thư gan với tỷ lệ tử vong cao. Do vậy viêm gan B hiện là một vấn đề đang được chú trọng trong chương trình bảo vệ sức khoẻ cộng đồng toàn cầu [1]. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV trên toàn cầu, như vậy HBV có thể được xem như một trong những mầm bệnh phổ biến nhất đối với con người. Số người chết liên quan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới khoảng 2 triệu người. Ở Việt Nam, theo báo cáo của bộ Y tế từ năm 1978 đến năm 1990, số mắc viêm gan B khoảng 20.000 người/năm và tỷ lệ tử vong là 0,7% - 0,8%. Hiện tại, Việt nam vẫn đang được xếp vào một trong những quốc gia có tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [3]. Điều quan trọng là cho đến nay chưa có một hoá trị liệu nào đặc hiệu để điều trị viêm gan B. Phương pháp duy nhất để tránh viêm gan B là dự phòng bằng vắc xin. Vì vậy có thể coi dự phòng viêm gan B cũng là một biện pháp hữu hiệu để dự phòng ung thư gan nguyên phát. Trước tình hình lây nhiễm của HBV như hiện nay, thì việc đẩy mạnh sản xuất vắc xin trong nước bằng việc nhập khẩu một dây chuyền công nghệ hiện đại kết hợp với việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen từ đối tượng gây bệnh phân lập trong nước là cần thiết. Chúng tôi đã nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B với mục đích sản xuất được loại kháng nguyên này để tạo ra bộ sinh phẩm chẩn đoán viêm gan B cũng như phát triển vắc xin tái tổ hợp [4, 5, 7]. Tuy nhiên, để có thể đánh giá một cách chính xác về mặt dịch tễ học của virus viêm gan B thì việc phối hợp giữa phát hiện HBsAg, kháng thể kháng HBsAg và kháng thể kháng HBcAg là cần thiết. Kháng thể kháng HBcAg hình thành sớm và tồn tại gần như suốt cả cuộc đời người đã bị nhiễm HBV, vì vậy khó có thể bỏ sót các trường hợp hợp nhiễm HBV nếu phát hiện kháng thể loại này. Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và thiết kế vectơ để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên lõi của virus viêm gan B (gen hbc) từ khối u của bệnh nhân ung thư gan nhằm thu nhận kháng nguyên lõi tái tổ hợp để phục vụ công tác chẩn đoán. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR: Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR được thiết kế nhờ chương trình phần mềm PC/Gene dựa trên trình tự của đoạn ADN thuộc genôm của virus viêm gan B chứa gen hbc đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [2]. Vị trí bám của mồi vào vùng chứa gen hbc được nêu ở hình 1. Hình 1: Vị trí của cặp mồi HBCP1, HBCM1 trong một vùng ADN genôm của virus viêm gan B, chứa toàn bộ gen kháng nguyên lõi của virus viêm gan B với chiều dài 552 cặp bazơ (phần in đậm). Theo lý thuyết, cặp mồi HBCP1, HBCM1 tạo ra sản phẩm PCR với chiều dài là 619 cặp bazơ. Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR được tiến hành với 100 ng ADN tách từ khối u làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệu HBCP1 và HBCM1, có trình tự như sau: HBCP: 5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3' HBCM1:5'-TCCCACCTTATGAGTCCAAGGG-3' Sử dụng 1 đơn vị Taq Polymeraza của công ty Perkin Elmer cho mỗi ống phản ứng. PCR được tiến hành nhờ máy chu kỳ nhiệt MJ PTC-100 (Mỹ) với chương trình như sau: Biến tính ADN trong 3 phút rồi chạy 30 chu kỳ (95 0 C 50 giây, 55 0 C 50 giây, 72 0 C 1 phút 25 giây). Sau khi kết thúc chu kỳ, giữ ở nhiệt độ 72 0 C 8 phút sau đó giữ ở 4 0 C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%. Tách dòng gen được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM với bộ Kit của hãng Invitrogen. Gen hbc tái tổ hợp với vectơ tách dòng trước hết được kiểm tra bằng cắt với enzym giới hạn EcoR I, sau đó được giải trình tự với máy xác định trình tự ADN tự động (ALFExpress) với bộ Kit của hãng Amersham- Pharmacia Biotech. Sau khi giải trình tự, gen được dịch mã sang protein và so sánh với trình tự axit amin kháng nguyên HBcAg của các tác giả khác bằng chương trình phần mềm PC/gene. Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để thiết kế vectơ biểu hiện gen hbc ở E. coli. Cặp mồi treo hai vị trí giới hạn EcoR I và Hind III có trình tự: HBcR1: GGAATTCATGGACATTGACCC EcoR I HBcH3: AAGCTTCTAACATTGAGATTCC Hind III Tiến hành PCR với cặp mồi HBCR1 và HBCH3, sau đó gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 để tạo dòng phụ. Gen hbc được cắt ra khỏi vector tách dòng pCR 2.1 bằng EcoR I và Hind III, sau đó gắn vào vectơ pMAL- c2 để thu nhận vectơ tái tổ hợp. Vectơ mang gen hbc được biến nạp vào E. coli chủng BL21 và cho biểu hiện để thu protein tái tổ hợp. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Để nhân bản gen mã hoá cho kháng nguyên lõi của virut viêm gan B, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi HBCP1, HBCM1 và khuôn là 100 ng ADN tách từ khối u của bệnh nhân ung thư gan. Với cặp mồi này, sản phẩm PCR thu được có chiều dài tính theo lý thuyết là 619 cặp bazơ. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% kết quả được chỉ ra ở hình 2. Hình 2: Điện di trên gel agaroza 1% kiểm tra sản phẩm PCR được tiến hành với khuôn là ADN tách chiết từ khối u của bệnh nhân ung thư gan với cặp mồi HBCP1, HBCM1. Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I). Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR được gắn vào vectơ PCRTM và biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH-5. ADN plasmid được tách từ các khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng bằng phương pháp miniprep sau đó được tuyển chọn để thu nhận các plasmid có khả năng mang gen hbc bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Chọn các plasmid có kích thước lớn hơn plasmid gốc để kiểm tra trước hết bằng cắt với enzyme giới hạn EcoRI (hình 4). Kết quả ở hình 4 cho thấy chỉ có plasmid tách từ clôn số 15 mang gen hbc. Theo tính toán thì đoạn ADN được nhân bản chứa gen hbc có chiều dài 619 cặp bazơ. Sau khi xử lý với EcoR I, chỉ có plasmid tách từ clôn số 15 có đoạn ADN được tách ra khỏi vector tái tổ hợp có chiều dài nằm trong vùng dự tính. Để có thể khẳng định chắc chắn, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự gen hbc với máy xác định trình tự ADN tự động. Trình tự gen hbc phân lập ở Việt Nam đã được đăng ký trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế với số đăng ký AJ298864. Gen hbc cũng đã được dịch mã sang protein và so sánh trình tự axit amin với trình tự axit amin của kháng nguyên lõi của virus viêm gan B đã được các tác giả Nhật Bản công bố. Kết quả cho thấy độ tương đồng đạt tới 93,4 % (hình 5). Hình 4: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn các plasmid tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI. Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và EcoR I). Kênh 1: Plasmid tách từ clôn 15; kênh 2: Plasmid tách từ clôn 12. Hình 5: So sánh trình tự axit amin giữa HBcAg Viet Nam (HBCVN) và HBcAg của Nhật Bản (HBCNB) và nhận được sự tương đồng cao (93,4%). Biểu hiện gen hbc trong E. coli được thực hiện với vectơ pMAL-c2. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại có độ dài 566 cặp bazơ. Sau khi xử lý với EcoR I và Hind III được gắn vào vectơ pMAL-c2 rồi biến nạp vào E. coli chủng DH5. Plasmit tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt với EcoR I và Hind III. Kết quả kiểm tra được nêu ở hình 6. Sau khi đã kiểm tra một cách chắc chắn, plasmit tái tổ hợp được biến nạp vào [...]... virut < /b> viêm < /b> gan < /b> B từ khối u của < /b> b nh nhân ung thư gan < /b> Kỷ y u Viện Công nghệ Sinh học, 1996: 20-25 5 Đinh Duy Kháng,< /b> Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1998 Trình tự gen < /b> kháng < /b> nguyên < /b> b mặt của < /b> virut < /b> viêm < /b> gan < /b> B phân lập từ khối u của < /b> b nh nhân ung thư gan < /b> EMBL gene bank số HBV012481 6 Đinh Duy kháng,< /b> Nguyễn Văn Vũ, Đái Thị Hằng Nga, Nguyễn Thị Nga, Đái Duy Ban, 1999... dụng kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) để phát hiện < /b> ADN của < /b> virut < /b> viêm < /b> gan < /b> B trong khối U của < /b> b nh nhân ung thư gan < /b> B o < /b> cáo < /b> khoa < /b> học Hội nghị CNSH toàn quốc, 1151-1156 7 Đồng Văn Quyền, B ch Như Quỳnh, Đái Duy Ban, Đinh Duy Kháng < /b> 1999 Nghiên c u bi u < /b> hiện < /b> gen < /b> kháng < /b> nguyên < /b> b mặt của < /b> virut < /b> viêm < /b> gan < /b> B (HBsAg) ở trực khuẩn Escherichia coli Kỷ y u Viện Công nghệ Sinh học 239-244 8 Dong Van Q., Bach Nhu Q., Le... 8, 9: M u sau cảm ứng 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và < /b> 4,0 giờ IV KẾT LUẬN Gen < /b> mã hóa cho kháng < /b> nguyên < /b> lõi < /b> của < /b> virus viêm < /b> gan < /b> B đã được nhân b n từ ADN tách từ khối u của < /b> b nh nhân ung thư gan,< /b> sau đó được tạo dòng,< /b> xác định trình tự và < /b> dịch mã sang protein Gen < /b> này có chi u dài 552 cặp bazơ và < /b> mã hóa cho một protein dài 183 axit amin So sánh trình tự axit amin của < /b> HBcAg của < /b> Việt Nam và < /b> HBcAg được... nucleotide sequence between hepatitis B virus genomes from carriers positive for antibody to hepatitis B e antigen with and without active disease J Med Virol 44:96-10 3 Trịnh Quân Huấn 2000: Virus viêm < /b> gan < /b> B NXB Y học, 2000 4 Đinh Duy Kháng,< /b> Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1996 Phân lập, tách dòng < /b> và < /b> xác định trình tự gen < /b> kháng < /b> nguyên < /b> b mặt của < /b> virut < /b> viêm.< /b> .. Dinh Duy K 2000 Cloning of gene encoding hepatitis B virus core antigen (HBcAg) AC # AJ298864 SUMMARY Cloning and expression of the gene encoding hepatitis B core antigen from human liver tumor biopsies Dang Truong Minh, Le Thi Tam, Bach Nhu Quynh, Dong Van Quyen, Dinh Duy Khang Institute of Biotechnology The gene encoding hepatitis B core antigen has been cloned from human liver tumor biopsies This gene... B n công b trong ngân hàng dữ li u gen < /b> Quốc tế thấy có sự tương đồng cao (93,4%) [2] Vectơ < /b> pMAL-c2 được sử dụng để bi u < /b> hiện < /b> gen < /b> hbc ở E coli Sau khi xử lý sản phẩm PCR và < /b> vectơ < /b> đồng thời với 2 enzyme giới hạn là EcoR I và < /b> Hind III, gen < /b> hbc được gắn vào vectơ < /b> nhờ ligaza và < /b> biến nạp vào E coli chủng BL21 (DE3) Cảm ứng được tiến hành với 1mM IPTG trong khoảng thời gian 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và.< /b> .. chủng BL21 (DE3) và < /b> cho bi u < /b> hiện < /b> để thu nhận protein tái tổ hợp Bi u < /b> hiện < /b> gen < /b> hbc tái tổ hợp được cảm ứng b ng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM Protein tái tổ hợp là loại protein liên kết với protein có ái lực với maltoza (MBP) Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp b ng điện di gel polyacrylamit 12,5 % được n u ở hình 7 Hình 6: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn vectơ < /b> pMAL-c2 tái tổ hợp mang gen.< /b> .. the hbc gene was already inserted into pMALC2 vector to be available for E coli transformation Recombinant vectors were used to transforme E coli strain BL21 (DE3) for expression The expected fusion protein with molecular mass about 61 kDa would be expressed after 3 hours induction with 1 mM IPTG The fusion protein included maltose binding protein (MBP) with molecular mass 41 kDa and recombonant HBcAg... gen < /b> hbc sau khi cắt b ng EcoRI và < /b> Hind III Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt b ng Hind III và < /b> EcoR I) Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Plasmid tách từ các clôn khác nhau Sau khi cắt b ng EcoRI và < /b> Hind III, gen < /b> hbc sẽ được tách khỏi vectơ < /b> Hình 7: Điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra protein HBcAg tái tổ hợp Kênh M: Chỉ thị phân tử (từ cao xuống thấp: 93, 67, 43, 30, 20,1 và < /b> 14,4 kDa) Kênh 1: m u trước... đươc kiểm tra b ng điện di trên gel polyacrylamide 12,5 % Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng b ng IPTG, protein tái tổ hợp tăng dần theo thời gian từ 30 phút đến 4 giờ TÀI LI U THAM KHẢO Tạp chí: 1 Blumberg, B S., 1997 Hepatitis B virus, the vaccine, and the control of primary cancer of the liver Proc Natl Acad Sci USA, 94, 71217125 2 Horikita M., Itoh S., Yamamoto K., Shibayama T., Tsuda F., Okamoto . TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BI U HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA B NH NHÂN UNG THƯ GAN Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, B ch Như Quỳnh, Đồng. dòng và thiết kế vectơ để bi u hiện gen mã hóa kháng nguyên lõi của virus viêm gan B (gen hbc) từ khối u của b nh nhân ung thư gan nhằm thu nhận kháng nguyên lõi tái tổ hợp để phục vụ công. Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1998. Trình tự gen kháng nguyên b mặt của virut viêm gan B phân lập từ khối u của b nh nhân ung thư gan.