Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè (camellia sinensis)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC DƯƠNG TRUNG THÀNH NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC DƯƠNG TRUNG THÀNH NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Thị Thu Huệ TS Hoàng Thị Thu Yến THÁI NGUYÊN - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Dương Trung Thành ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Huỳnh Thị Thu Huệ - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam; TS Hồng Thị Thu Yến - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học - người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô tập thể cán Khoa Công nghệ Sinh học, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên cán công tác Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Cử nhân Phạm Thị Hằng - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, tận tình dẫn giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tồn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Dương Trung Thành iii iiii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii LỤC MỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC vii CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH .viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ 1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển chè 1.1.2 Đặc điểm sinh học chè 1.1.3 Giá trị chè 1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 1.2.1.1 Tình hình sản xuất chè giới 1.2.1.2 Tình hình sản xuất chè Việt Nam 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu chè giới Việt Nam 14 iv 1.3 CATECHIN VÀ ANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ ivi .16 1.3.1 Catechin tác 16 1.3.2 Cơ chế sinh tổng chè 19 dụng hợp catechin catechin 1.3.3 Anthocyanidin reductase gen ANR quy định tổng hợp anthocyanidin reductase .2 iv Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Hóa chất .23 2.1.3 Thiết bị .24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .24 2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 24 2.2.2 Điện di RNA tổng số .25 2.2.3 Tổng hợp cDNA 26 2.2.4 Nhân gen ANR kĩ thuật PCR 26 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 28 2.2.6 Tách dòng gen ANR 29 2.2.7 Xác định trình tự gen .32 2.2.8 Xử lí số liệu phần mềm chuyên dụng 33 2.2.9 Thiết kế vector biểu 33 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Khuếch đại gen ANR từ mẫu chè nghiên cứu 35 3.2 Tạo dòng gen, xác định phân tích trình tự gen mã hóa anthocyanidin reductase .3 3.3 Thiết kế vector biểu vi khuẩn mang gen ANR 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh tắt ANR Anthocyanidin reductase Anthocyanidin reductase cDNA DNA bổ sung Complementary DNA DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide C Catechin Catechin CsANR Gen ANR chè ANR gene of Camellia sinensis DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate Đtg Đồng tác giả et al EC Epicatechin Epicatechin ECG Epicatechin-3-O-gallate Epicatechin-3-O-gallate EDTA Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EGC Epigallocatechin Epigallocatechin EGCG Epigallocatechin-3-O-gallate Epigallocatechin-3-O-gallate EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide GC Gallocatechin Gallocatechin Kb Kilô bazơ Kilo base LAR Leuacoanthocyanidin reductase Leuacoanthocyanidin reductase LB Môi trường LB Luria Bertani NAD Nicotinamid adenine dinucleotide Nicotinamid adenine dinucleotide NADP Nicotinamid adenine dinucleotide Nicotinamid adenine dinucleotide phosphate phosphate vi ORF Khung đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer F Mồi xuôi Primer forward Primer R Mồi ngược Primer reverse RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus UTR Vùng không dịch mã untranslated region vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích, suất, sản lượng chè giới giai đoạn 2010 - 2016 Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng số nước giới năm 2016 10 Bảng 1.3 Tình hình diện tích, suất, sản lượng chè Việt Nam năm gần 13 Bảng 1.4 Thành phần amino acid CsANR 21 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 26 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực phản ứng tổng hợp cDNA 26 Bảng 2.3 Trình tự đoạn mồi sử dụng nhân gen ANR 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen ANR 27 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo đầu sẳn phẩm PCR 29 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen ANR vector pJET1.2 29 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid 32 Bảng 3.1 Kết kiểm tra nồng độ RNA tổng số 36 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen ANR chè Trung du xanh với trình tự công bố Genbank 41 Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid gen mã hóa anthocyanidin reductase giơng chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank 44 587 A A T A A 603 A A T A A 612 A A A A G 667 C C C T C 717 C C C T C 776 C C C T C 803 A A G A A 804 T T C T T 906 C C C T C 909 G G G T G 911 C C C T C 912 T T A T T 977 T T T G T 992 C C C T C Kết phân tích trình tự nucleotide gen mã hóa CsANR2 giống chè nghiên cứu với trình tự cơng bố đăng ký ngân hàng GenBank (mã số GU944768, AY641729, HM003282, GU992400) cho thấy gen CsANR2 bảo thủ chè Hệ số tương đồng di truyền giống chè dao động từ 99 – 99,7% Trình tự nucleotide gen ANR mẫu chè nghiên cứu so sánh với trình tự mang mã số GU944768 có vị trí sai khác (bàng 3.2) với hệ số tương đồng 99,7%; có vị trí sai khác so với trình tự mang mã số AY641729 với hệ số tương đồng 99,1%; có 10 vị trí sai khác so với trình tự mang mã số HM003282 với hệ số tương đồng 99% có vị trí sai khác so với trình tự mang mã số GU992400 với hệ số tương đồng 99,2% Tương tự, kết phân tích trình tự amino acid CsANR2 có hệ số tương đồng di truyền cao giống chè dao động từ 95,7 - 99,5% thể hình 3.6 bảng 3.3 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | CsANR2VN MEAQPTAPKAACVVGGTGFVAATLIKLLLEKGYAVNTTVRDPGNQKKTSHLLALKGSGNLKIFRADLTDEQSFDAPVAGCDLVFHVATPV GU944768 T AY641729 T HM003282 T GU992400 Vị trí bám NAD NADP 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | CsANR2VN NFASEDPENDMIKPAIQGVVNVLKACAKVGTVKRVILTSSAAAVSINKLNGTGLVMDESHWTDTEFLNSAKPPTWGYPLSKTLAEKAAWK GU944768 A AY641729 A HM003282 A GU992400 A 190 200 210 220 230 240 250 260 270 | | | | | | | | | | | | | | | | | | CsANR2VN FAEENNINLITVIPTLMAGPSLTADVPSSIGLAMSLITGNEFLINGLKGMQMLSGSISISHVEDVCRAHVFVAEKESASGRYICCAVNTS GU944768 AY641729 .S HM003282 F F GU992400 V 280 290 300 310 320 330 | | | | | | | | | | | | | CsANR2VN VPELAKFLNKRYPEYNVPTDFGDFPSKAKLILSSEKLTKEGFSFKYGIEEFYDQSVEYFKAKGILKN GU944768 I AY641729 I HM003282 GU992400 F I G V I Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn CsANR2 từ giống chè Trung Du xanh với trình tự cơng bố ( ) Trình tự amino acid thay đổi CsANR2 so với trình tự cơng bố; Dấu ( ) gốc amino vùng liên kết chất bảo thủ Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid gen mã hóa anthocyanidin reductase ở giơng chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Genbank Vị trí ScANR2 GU944768 AY641729 HM003282 GU992400 75 A T T T A 119 V A A A A 181 F F F F V 223 L L L F L 259 S S S F S 268 N N S N N 304 S S S F S 321 F I I I I 326 V V V G V 331 A A A V A Kết so sánh trình tự amino acid CsANR2 hình cho thấy, amino acid quy định chức CsANR2 chè có tính bảo thủ cao CsANR2 chè Trung du xanh với trình tự cơng bố Kết sánh ra: Trình tự amino acid enzyme ANR giống chè Trung du xanh khác với trình tự mang mã số GU944768 vị trí (75, 119, 321) thể bảng 3.3 với hệ số tương đồng 99,1% Trình tự amino acid enzyme ANR giống chè Trung du xanh khác với trình tự mang mã số AY641729 vị trí (75, 119, 268, 321) thể bảng 3.3 với hệ số tương đồng 98,8% Trình tự amino acid enzyme ANR giống chè Trung du xanh khác với trình tự mang mã số HM003282 vị trí (75, 119, 223, 259, 304, 321, 326, 331) thể bảng 3.3 với hệ số tương đồng 97,6% Trình tự amino acid enzyme ANR giống chè Trung du xanh khác với trình tự mang mã số GU992400 vị trí (119, 181, 321) thể bảng 3.3 với hệ số tương đồng 99,1% Sự sai khác có ảnh hưởng đến hoạt tính CsANR2 cần phải có nghiên cứu sâu 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN VI KHUẨN MANG GEN ANR Từ vector tách dòng pJET chứa gen ANR phân lập từ giống chè xanh, tiến hành cắt vector tái tổ hợp hai enzyme giới hạn NcoI XhoI Đồng thời, phản ứng cắt NcoI XhoI tiến hành với vector pET32a(+) Tiếp theo, thực phản ứng lai đoạn gen ANR với vector pET32a (+) mở vòng điều kiện 22oC Vector pET32a(+) có kích thước 5.900 bp, gen ANR kích thước 1.014 bp, vector tái tổ hợp có kích thước khoảng kb Sản phẩm q trình lai biến nạp vào tế bào E.coli DH10B Sau biến nạp sốc nhiệt, dịch tế bào ni đĩa LB có bổ sung ampicillin nhằm chọn lọc tế bào mang gen thị kháng kháng sinh Kết biến nạp cho thấy số khuẩn lạc mọc bề mặt đĩa Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có kích thước đồng Theo lý thuyết, gen kháng ampicillin nằm vector khuẩn lạc có khả phát triển mơi trường kháng sinh khuẩn lạc chứa vector vector tái tổ hợp Để khẳng định chắn khuẩn lạc mang gen mong muốn, tiến hành tách plasmid cắt kiểm tra enzyme giới hạn Chúng lựa chọn 10 khuẩn lạc đĩa biến nạp ni mơi trường LB có bổ sung kháng sinh điều kiện 37oC, ni lắc 200 vòng/phút, qua đêm Sau đó, dòng tế bào tách plasmid kiểm tra gel agarose 0,8% Kết điện di kiểm tra plasmid thể hình 3.7 Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt gen ANR plasmid pET32a(+) (-): vector pET32a(+) không mang đoạn chèn, – 10: 10 dòng plasmid tách chiết Kết điện di cho thấy, 10 dòng thu có dòng số 01 có kích thước cao đối chứng vector pET32a(+) không mang đoạn chèn Vì vậy, chúng tơi tiến hành kiểm tra dòng plasmid enzyme giới hạn PCR với cặp mồi nhân đoạn gen ANR Plasmid tiếp tục tiến hành phản ứng cắt kiểm tra hai enzyme giới hạn NcoI XhoI Sản phẩm phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.8) Hình 3.8 Kết cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR NcoI XhoI M: maker 1kb, 1: sản phẩm cắt enzyme giới hạn Kết điện di hình 3.8 cho thấy, plasmid sau cắt hai enzyme tạo hai băng đậm rõ nét với kích thước khoảng 5900 bp 1000 bp tương đương với kích thước pET32a(+) gen ANR dạng thẳng Để khẳng định chắn hơn, chúng tơi tiến hành PCR kiểm tra dòng plasmid cặp mồi nhân gen ANR Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.9) Hình 3.9: Kết PCR kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR M: maker kb, (+): sản phẩm PCR từ đối chứng dương plasmid pJET1.2_ANR, (-): sản phẩm PCR đối chứng âm H2O, 1: sản phẩm PCR từ plasmid pET32a(+)_ANR Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu cho băng đậm, rõ nét có kích thước khoảng 1000 bp tương đương với kích thước đoạn gen ANR Như vậy, tạo dòng biến nạp vào E coli DH10B mang plasmid pET32a(+)_ANR Vector tái tổ hợp dùng cho mục đích biểu gen mong muốn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Gen ANR khuếch phản ứng PCR từ khuôn cDNA mẫu chè Trung Du xanh, kích thước sản phẩm PCR thu khoảng 1.0kb Đã tạo dòng gen ANR vector pJET1.2, xác định phân tích trình tự gen mã hóa anthocyanidin reductase từ mẫu chè nghiên cứu Gen ANR có ORF 1014 nucleotide, mã hóa 337 amino acid Trình tự gen ANR từ mẫu chè nghiên cứu so với trình tự cơng bố có hệ số tương đồng di truyền 99 - 99,7%, trình tự amino acid suy diễn CsANR2 có độ tương đồng cao so với trình tự cơng bố Genbank (95,7- 99,5%), khơng có khác biệt trình tự amino acid vùng quy định chức so với trình tự cơng bố Đã tạo dòng vi khuẩn E.coli mang vector biểu gen ANR (pET32a(+)_ANR) KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu đặt vấn đề cần nghiên cứu sâu đa hình trình tự nucleotide đơn (các SNPs) gen ANR chè nghiên cứu biểu gen ANR TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Quang Anh (2005) , “Trà sức khỏe”, Báo sức khỏe đời sống Hoàng Văn Chung, (2012), “Nghiên cứu tuyển chọn đầu dòng số biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng mới chè Shan vùng núi cao tỉnh Bắc Kạn”, Luận án tiến sỹ Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên Lê Tất Khương, Hoàng Văn Chung (1999) Giáo trình chè Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Phương, Hoàng Văn Chung, Hoàng Thị Thu Yến (2010) Bước đầu nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng chè shan (Camellia sinensis var assamica (Mast) Pierre sec Phamh) kỹ thuật RAPD Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên 63: 149 -157 Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng (2004) Đánh giá tính đa hình RAPD genome số giống chè Tạp chí cơng nghệ sinh học 2: 109-116 Trần Đình Long, Mai Hoàng Thạch, Hoàng Tuyết Minh (1997) Chọn giống trồng NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Đỗ Văn Ngọc (2000) Giống chè, kỹ thuật trồng chăm sóc NXB Nông Nghiệp, Viện nghiên cứu chè, Phú Thọ Đỗ Ngọc Qũy, Lê Thất Khương (2000) Giáo trình chè sản xuất chế biến tiêu thụ.NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hữu Thọ (2003) Nghiên cứu xác định khu vực địa lý tiềm vùng dẫn địa lý chè Tân Cương Sở Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, Thái Nguyên 10 Nguyễn Hữu Thọ, Bùi Thị Minh Hòa, Đinh Ngọc Lan, Nguyễn Mạnh Thắng, Dương Thu Hoàng (2008) Nghiên cứu chuỗi giá trị ngành chè nằm đưa giải pháp nâng cao tính cạnh tranh chè Thái Nguyên thị trường, Báo cáo kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộThái Nguyên 11 Trần Đức Trung (2009) Nghiên cứu đa dạng di truyền giống/ dòng chè (Camellina sinensis (L.)O Kuntze) Việt Nam thị hình thái thị phân tử microsatellite(SSR) Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 12 Lương Văn Vượng, Phạm Huy Thông, Lê Văn Đức, Lê Hồng Vân (2013) Kỹ thuật sản xuất chế biến chè xanh NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 13 Hồng Thị Thu Yến, Nguyễn Văn Tuấn, Hoàng Thị Ngà (2012) Nghiên cứu đa dạng di truyền genome số dòng chè (Camellia sinensis) trồng xã Tân Cương – Thành phố Thái Nguyên kỹ thuật RAPD Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Nguyên 96: 139 -143 14 Hoàng Thị Thu Yến, Dương Thị Nhung, La Quang Thương, Hà Thị Loan (2014) Nghiên cứu thị SSR số giống/dòng chè trồng Thái Ngun Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Nguyên 120: 13-19 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 Adhami VM, Malik A, Zaman N, Sarfaraz S, Siddiqui IA, Syed DN, Afaq F, Pasha FS, Saleem M, Mukhtar H (2007), “Combined inhibitory effects of green tea polyphenols and selective cyclooxygenase-2 inhibitors on the growth of human prostate cancer cells both in vitro and in vivo”, Clinical Cancer Research,13(5), 1611–1619 16 Ashihara H., Deng W W., Mullen W., Crozier A (2010), "Distribution and biosynthesis of flavan-3-ols in Camellia sinensis seedlings and expression of genes encoding biosynthetic enzymes", Phytochemistry, 71 (5-6), 559566 17 Chen C, Wei K, Wang L, Ruan L, Li H, Zhou X, Lin Z, Shan R & Cheng H (2015), “Expression of Key Structural Genes of the Phenylpropanoid Pathway Associated with Catechin Epimerization in Tea Cultivars”, Front Plant Sci, 8(702) 18 Chen D, Wan SB, Yang H, Yuan J, Chan TH, Dou QP (2011), “EGCG, green tea polyphenols and their synthetic analogs and prodrugs for human cancer prevention and treatment”, Adv Clin Chem, 53,155–177 19 Erba D, Riso P, Bordoni A, Foti P, Biagim PL, Testolin G (2005), “Effectiveness of moderate green tea consumption on antioxidative status and plasma lipid profile in humans”, Journal of Nutritional Biochemistry, 16 (3), 144–149 20 Eungwanichayapant P D., Popluechai S (2009), "Accumulation of catechins in tea in relation to accumulation of mRNA from genes involved in catechin biosynthesis", Plant Physiol Biochem, 47 (2), 94-97 21 Gargouri M, Manigand C, Maugé C, Granier T, Langlois d'Estaintot B, Cala O, Pianet I, K B, Chaudière J & Gallois B (2009), “Structure and epimerase activity of anthocyanidin reductase from Vitis vinifera”, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 65(9) 989–1000 22 Harbowy M E., Balentine D A (1997), “Tea chemistry”, Critical Reviews ill Plant Sciences, 16 (5), 415-480 23 Jankun J, Selman SH, Swiercz R, Skrzypczak-Jankun E (1997), “Why drinking green tea could prevent cancer”, Nature, 387-561 24 Khan N, Afaq F, Saleem M, Ahmad N, Mukhtar H (2006), “Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (−)- epigallocatechin3-gallate”, Cancer Research, 66 (5), 2500–2505 25 Kirita M., Honma D., Tanaka Y., Usui S., Shoji T., Sami M., Yokota T., Tagashira M., Muranaka A., Uchiyama M., Kanda T., Maeda-Yamamoto M "Cloning of a novel O- methyltransferase from Camellia sinensis and synthesis of o-methylated EGCG and evaluation of their bioactivity", J Agric Food Chem, 58 (12), 7196-7201 26 Kondo K, Kurihara M, Miyata N, Suzuki T, Toyoda M (1999), “Scavenging mechanisms of (−)-epigallocatechin gallate and (−)epicatechin gallate on peroxyl radicals and formation of superoxide during the inhibitory action”, Free Radical Biology and Medicine, 27 (7– 8), 855863 27 Lee M J., Lambert J D., Prabhu S., Meng X., Lu H., Maliakal P., Ho C T., Yang C S (2004), "Delivery of tea polyphenols to the oral cavity by green tea leaves and black tea extract", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 13 (1), 132-137 28 Liu M, Tian HL, Wu JH, Cang RR, Wang RX, Qi XH, Xu Q & Chen XH (2015), “Relationship between gene expression and the accumulation of catechin during spring and autumn in tea plants (Camellia sinensis L.)”, Hortic Res 2, 15011 29 Lu YP, Lou YR, Xie JG, Yen P, Huang MT, Conney AH (1997), “Inhibitory effect of black tea on the growth of established skin tumors in mice: effects on tumor size, apoptosis, mitosis and bromodeoxyuridine incorporation into DNA”, Carcinogenesis, 18 (11), 2163–2169 30 Luximon-Ramma A, Neergheen VS, Bahorun T, Crozier A, Zbarsky V, Datla KP, Dexter DT & Aruoma OI (2006), “Assessment of the polyphenolic composition of the organic extracts of Mauritian black teas: a potential contributor to their antioxidant functions”, Biofactors, 27(1-4), 79-91 31 Mukhtar H, Ahmad N (2000), “Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health”, American Journal of Clinical Nutrition, 71 (6 Suppl), 1698S–1702S 32 Nance CL, Shearer WT (2003), “Is green tea good for HIV-1 infection?”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 112 (5), 851– 853 33 Pang Y, Abeysinghe IS, He J, He X, Huhman D, Mewan KM, Sumner LW, Yun J & Dixon RA (2013), “Functional characterization of proanthocyanidin pathway enzymes from tea and their application for metabolic engineering”, Plant Physiol 161(3) 1103-1116 34 Punyasiri PA, Abeysinghe SB & Kumar V (2005), “Preformed and induced chemical resistance of tea leaf against Exobasidium vexans infection”, J Chem Ecol 31(6), 1315-1324 35 Rani A., Singh K., Ahuja P S., Kumar S (2012), "Molecular regulation of catechins biosynthesis in tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Gene, 495 (2), 205-210 36 Rani A., Singh K., Sood P., Kumar S., Ahuja P S (2009), "pCoumarate:CoA ligase as a key gene in the yield of catechins in tea [Camellia sinensis (L.) O Kuntze]", Funct Integr Genomics, (2), 271275 37 Sang S, Tian S, Wang H, Stark RE, Rosen RT, Yang CS & Ho CT (2003), “Chemical studies of the antioxidant mechanism of tea catechins: radical reaction products of epicatechin with peroxyl radicals”, Bioorg Med Chem, 11(16), 3371-3378 38 Singh K., Rani A., Kumar S., Sood P., Mahajan M., Yadav S K., Singh B., Ahuja P S (2008), "An early gene of the flavonoid pathway, flavanone 3-hydroxylase, exhibits a positive relationship with the concentration of catechins in tea (Camellia sinensis)", Tree Physiol, 28 (9), 1349-1356 39 Singh K., Rani A., Paul A., Dutt S., Joshi R., Gulati A., Ahuja P S., Kumar S (2009), "Differential display mediated cloning of anthocyanidin reductase gene from tea (Camellia sinensis) and its relationship with the concentration of epicatechins", Tree Physiol, 29 (6), 837 - 846 40 Thirugnanasambantham K, Mularidaran S, Mandal AK (2014), “Molecular cloning, computational and expression analysis of anthocyanidin reductase in tea (Camellia sinensis)”, Appl Biochem Biotechnol, 174 (1), 130 - 145 41 Wang YC & Bachrach U (2002), “The specific anti-cancer activity of green tea (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)”, Amino Acids, 22(2), 131-143 42 Wang YS, Gao LP & Shan Y (2012), “Influence of shade on flavonoid biosynthesis in tea (Camellia sinensis (L.) O.Kuntze)”, Sci Hort 141(7– 16) 43 Wu ZJ, Li XH, Liu ZW, Xu ZS & Zhuang J (2014), “De novo assembly and transcriptome characterization: novel insights into catechins biosynthesis in Camellia sinensis”, BMC Plant Biol, 14(277) 44 Xie DY, Sharma SB, Paiva NL, Ferreira D & Dixon RA (2003), “Role of anthocyanidin reductase, encoded by BANYULS in plant flavonoid biosynthesis”, Science, 299(5605) 396-399 45 Yang CS, Wang ZY (1993), “Tea and cancer: review”, Journal of the National Cancer Institute, 85 (13), 1038–1049 46 Yang D., Liu Y., Sun M., Zhao L., Wang Y., Chen X., Wei C., Gao L., Xia T (2012), "Differential gene expression in tea (Camellia sinensis L.) calli with different morphologies and catechin contents", J Plant Physiol, 169 (2), 163-175 47 Zhen YS, Chen ZM, Cheng SJ & Chen ML (2002), “Tea bioactivity and therapeutic potential”, London: Taylor & Francis Tài liệu internet 48 Các thành phần hóa học chè http://chemvn.net/chemvn/showthread.php?t=1274 49 Giá trị chè http://bannhanong.vietnetnam.net 50 Lịch sử chè wwww.Wikipedia the free encyclopedia The history of tea ... KHOA HỌC DƯƠNG TRUNG THÀNH NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC... nghiên cứu + Khuếch đại gen ANR mã hóa anthocyanidin reductase từ chè + Tạo dòng gen, xác định phân tích trình tự gen ANR thu + Thiết kế vector biểu gen mã hóa anthocyanidin reductase 3 Chương TỔNG... gen mã hóa anthocyanidin reductase chè (camellia sinensis) Mục tiêu đề tài Tạo dòng, xác định, phân tích trình tự thiết kế vector biểu gen mã hóa Anthocyanidin reductase phân lập từ chè trồng