Thiết kế vector biểu hiện protein amidase aliphatic từ rhodococcus erythropolis PR4 và đánh giá hoạt tính enzyme

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN HÀ THU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN AMIDASE ALIPHATIC TỪ Rhodococcus erythropolis PR4 VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN HÀ THU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN AMIDASE ALIPHATIC TỪ Rhodococcus erythropolis PR4 VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 84.20.20.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Bằng Phương Thái Nguyên - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Phạm Bằng Phương Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Mọi thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Hà Thu ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp nỗ lực, cố gắng thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đinh Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Phạm Bằng Phương người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm hướng dẫn hỗ trợ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán làm việc Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên đặc biệt Th.S Ma Thị Trang tạo điều kiện để giúp đỡ học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi lúc khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày… tháng… năm 2018 Học viên Nguyễn Hà Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục đích nghiên cứu .2 Nội dung nghiên cứu .2 Ý nghĩa luận văn .2 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung nhóm vi khuẩn Rhodococcus 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Rhodococcus .3 1.1.2 Khái quát vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 gen mã hóa amidase aliphatic .4 1.2 Tổng quan chung amidase .5 1.2.1 Hệ thống phân loại enzyme .5 1.2.2 Đặc tính amidase 1.2.3 Khả thủy phân sinh học 1.3 Ứng dụng amidase y dược công nghiệp 11 1.3.1 Tổng quan nhóm phức amide aliphatic 11 1.3.2 Ứng dụng amidase y dược 13 1.3.3 Ứng dụng amidase công nghiệp xử lý chất thải chứa amide aliphatic 1.4 Đặc điểm chủng vi khuẩn E coli sử dụng tạo dòng biểu 15 1.4.1 E coli DH5α JM109 .15 1.4.2 E coli BL21 16 1.4.3 E coli BL21 (DE3) pLysS 16 1.4.4 E coli M15 (pREP4) .17 1.5 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 17 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Đối tượng, phạm vi vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu .21 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất nghiên cứu 24 2.4.1 Dụng cụ nghiên cứu 24 2.4.2 Thiết bị nghiên cứu 24 2.4.3 Hóa chất nghiên cứu 25 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25 2.5.2 Phương pháp khuếch đại gen PCR 26 2.5.3 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 27 2.5.4 Phương pháp gắn nối gen vào vector 28 2.5.5 Phương pháp tách chiết plasmid .28 2.5.6 Phương pháp biến nạp .29 2.5.7 Phương pháp kiểm tra gắn nối gen 30 2.5.8 Phương pháp cảm ứng biểu protein IPTG 31 2.5.9 Phương pháp thu nhận protein 31 2.5.10 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Nghiên cứu khuếch đại gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 33 3.1.1 Tách chiết ADN hệ gen Rhodococcus erythropolis PR4 33 3.1.2 Khuếch đại gen mã hoá amidase phương pháp PCR .34 3.2 Tạo dòng gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 .35 3.2.1 Vector tạo dòng .35 3.2.2 Gắn nối đoạn gen amiE vào vector tạo dòng pGEM T-easy 37 3.2.3 Kiểm tra gắn nối enzyme giới hạn 37 3.3 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 38 3.3.1 Thiết kế vector biểu 38 3.3.2 Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu pET28a 40 3.3.3 Kiểm tra gắn nối enzyme giới hạn 41 3.4 Đánh giá khả biểu amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 vi khuẩn E coli .42 3.5 Kết đánh giá sinh trưởng tế bào E coli tái tổ hợp amiE-PR4 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Kết luận 45 Kiến nghị .45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Tiếng việt Tiếng nước AMP : Ampicillin Ampicillin bp : Cặp bazơ nitơ Base pair CoA : Coenzyme Acetoacetyl Cs : Cộng kDa : Kilo dalton ADN : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit IPTG : Isopropyl Thiogalactoside kb : Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth NCBI : Ngân hàng gen Etilendiamin tetraaxetic acid Kilo base Nation Centre for Biotechnology Information PCR : Khuếch đại gen R erythropolis : Rhodococcus erythropolis RE : Enzyme giới hạn TAE : Tris-acetate-EDTA TTH : Tái tổ hợp SDS –PAGE : Điện di SDS- polyacrylamide gel Polymerase Chain Recation Restriction enzyme Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) X-gal :5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-Dalactoside vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thành phần vector pGEM® T-easy .22 Bảng 2.2 Các thành phần vector biểu pET-28a(+) 23 Bảng 2.3 Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 24 Bảng 2.4 Hóa chất sử dụng đề tài 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen amiE 27 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng .28 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid EcoRI SalI 30 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt mở vòng plasmid 30 Bảng 3.1: Kết đo độ tinh nồng độ ADN 34 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc X-ray amidase peptide Hình 1.2 Phản ứng xúc tác thủy phân amit hình thành axit amoniac tương ứng Hình 1.3 Cơ chế kiểm sốt phiên mã T7 promoter .16 Hình 1.4 Sơ đồ ứng dụng sản xuất thuốc kháng HIV 20 Hình 2.1 Vector plasmid pGEM® T-easy 21 Hình 2.2 Vector biểu pET-28a(+) 23 Hình 2.3 Chu kỳ nhiệt khuếch đại gen amiE 27 Hình 3.1 Hình ảnh điện di ADN hệ gen tách chiết từ .33 Rhodococcus erythropolis PR4 33 Hình 3.2 Hình ảnh điện di đoạn gen amiE khuếch đại từ ADN hệ gen 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di đoạn gen amiE tinh 35 Hình 3.4 Hình ảnh điện di vector pGEM T-easy .35 Hình 3.5 Vector pGEM T-easy-amiE thiết kế phần mềm NTI .36 Hình 3.6 Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết 37 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt dòng plasmid có khả mang gen amiE 38 Hình 3.8 Hình ảnh điện di vector pET28a pET28a cắt mở vòng .39 Hình 3.9 Hình ảnh điện di đoạn gen amiE thu nhận từ vector tạo dòng 39 Hình 3.10 Vector pET28a-amiE thiết kế phần mềm NTI .40 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm gắn nối amiE vào pET28a 41 Hình 3.12 Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc 41 nghi mang gen amiE .41 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen amiE 42 Hình 3.14 Hình ảnh điện di protein cảm ứng biểu tế bào E coli BL21(DE3)pLysS 43 Hình 3.15 Đánh giá sinh trưởng tế bào E coli tái tổ hợp amiE-PR4 44 3.7 cho thấy, dòng khuẩn lạc số (lần lượt giếng 3,4) cho băng sáng ứng với kích thước lý thuyết xấp xỉ 3000 bp pGEM T-easy 1000 bp amiE Như tách dòng thành cơng đoạn gen amiE 4361 bp ~3000 bp 2322 bp ~1000 bp Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt dòng plasmid có khả mang gen amiE (Giếng M: Lambda HindIII marker Giếng 1: Plasmid tách chiết từ KLX; Giếng 2, 3: Plasmid tách chiết từ KLT số cắt EcoRI SalI; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuếch đại amiE tinh sạch) 3.3 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 3.3.1 Thiết kế vector biểu - Kết tách chiết vector biểu Để sử dụng hiệu vector thương mại pET28a nhằm mục đích biểu gen amiE, kiểm tra cách biến nạp vector biểu pET28a (5369bp) vào tế bào khả biến E coli DH5α cấy trải mơi trường LB có bổ sung ampicillin Sau nuôi qua đêm 37 oC, thu 300 khuẩn lạc Chọn dòng khuẩn lạc nghi mang vector biểu pET28a, nuôi tăng sinh LB lỏng để tách chiết plasmid kiểm tra kích thước vector (giếng 1- Hình 3.8) Vector nghi tách thành cơng tiến hành cắt mở vòng SalI tiếp tục điện di kiểm tra (giếng - Hình 3.8) Kết cắt mở vòng cho thấy giếng – Hình 3.8 xuất băng vạch có kích thước xấp xỉ 5500 bp, kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết vector pET28 5368 bp Vì vậy, plasmid đủ điều kiện để tiến hành bước biểu gen M 6557 bp ~5500 bp 2322 bp Hình 3.8 Hình ảnh điện di vector pET28a cắt mở vòng (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: pET28a tách chiết từ khuẩn lạc xanh; Giếng 2: pET28a cắt mở vòng SalI) - Thu nhận đoạn gen tách dòng Bằng phương pháp thơi gel tinh nhằm thu đoạn gen amiE (~1000 bp) từ vector tách dòng pGEM-amiE Kết giếng 2,3 – Hình 3.9 cho thấy, sản phẩm thơi gel cho kích thước phù hợp với kích thước đoạn gen amiE (giếng - Hình 3.9) Vì kết luận sản phầm đủ điều kiện để gắn nối vào vector biểu 6557 bp 2027 bp ~1000 bp Hình 3.9 Hình ảnh điện di đoạn gen amiE thu nhận từ vector tạo dòng (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1,2,3: Đoạn gen amiE thu từ vector pGEM-amiE T-easy) 40 - Kết thiết kế vector biểu sử dụng vector NTI Hình 3.10 Vector pET28a-amiE thiết kế phần mềm NTI Cơ sở: Ở hai đầu đoạn gene amiE có chứa vị trí nhận biết enzyme giới hạn EcoRI SalI Đồng thời hai enzyme giới hạn chúng tơi sử dụng để cắt mở vòng vector pET28a Theo lý thuyết cắt đồng thời hai enzyme với vector pET28a văng hai băng: Một băng có kích thước bp (tương đương số nucleotide vị trí cắt EcoI SalI) đoạn xấp xỉ 5360 bp (tương đương kích thước vector pET28a cắt mở vòng) Từ đây, đoạn gen amiE có kích thước 1038 bp gắn nối vào vector biểu pET28a nhờ enzyme ligase T4 (Hình 3.10) 3.3.2 Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu pET28a - Kết tách chiết vector biểu gắn nối thành công gen amiE Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu pET28a (5369 bp) 16 oC 16h (Hình 3.11) Sản phẩm gắn nối kiểm tra phương pháp điện di so sánh với đoạn gen tách dòng thành cơng vector pET28 cắt mở vòng EcoRI SalI Kết hình 3.11 cho thấy, tất sản phẩm gắn nối (giếng 5-8 Hình 3.11) cho băng kích thước 6500 bp (kích thước dự kiến gắn nối thành công gen vào vector 6407 bp) 41 6557 bp 2027 bp ~1000 bp Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm gắn nối amiE vào pET28a (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1,2: Đoạn gen amiE thu từ vector pGEM-amiE Teasy; Giếng 3, 4: pET28 cắt mở vòng EcoRI SalI; Giếng 5-8: Sản phẩm gắn nối vào vector pET28a) Sản phẩm nghi gắn nối thành công biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21 (DE3)pLysS cấy trải đĩa thạch nuôi 37 oC qua đêm Các dòng khuẩn lạc chọn lọc ngẫu nhiên nuôi tăng sinh môi trường LB 37 oC qua đêm, tách chiết plasmid để sàng lọc dòng mang đoạn gen mong muốn 3.3.3 Kiểm tra gắn nối enzyme giới hạn Kết sàng lọc hình 3.12 cho thấy giếng 2,3,4 cho băng cao so với đối chứng (vector pET28a không gắn gen), plasmid tiếp tục kiểm tra có mặt đoạn gen enzyme giới hạn EcoRI SalI (giếng 2,3,4 – Hình 3.13) 6557 bp 2027 bp Hình 3.12 Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc nghi mang gen amiE (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: pET28a; Giếng 2, 3, 4: plasmid nghi ngờ mang gen amiE) 42 Hình 3.13 cho thấy, sau cắt kiểm tra với enzyme giới hạn, plasmid nghi ngờ mang gen cho băng với kích thước lý thuyết tương ứng với 5369 bp pET28a 1038 bp gen amiE Như vậy, gắn nối thành công đoạn gen amiE vào vị trí vector pET28a 6557 bp 2027 bp Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen amiE (Giếng M: Lambda HindIII marker Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại amiE tinh sạch; Giếng 2, 3, 4: Plasmid nghi ngờ mang gen cắt với EcoRI SalI; Giếng 5: vector pET28a; Giếng 6: pET28a cắt mở vòng với EcoRI SalI) 3.4 Đánh giá sơ khả biểu amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 vi khuẩn E coli - Kết cảm ứng biểu amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 vi khuẩn E coli BL21 DE3 IPTG Sau chuyển vector biểu pET28-amiE vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3)pLysS cấy trải đĩa thạch LB nuôi 37 oC qua đêm cảm ứng biểu gen việc bổ sung IPTG nồng độ 1mM nuôi 4h Qua kết điện di SDS-PAGE (Hình 3.14) cho thấy, ngồi phân đoạn protein tương ứng với mẫu đối chứng khơng cảm ứng IPTG (giếng – Hình 3.14) mẫu protein từ giếng đến xuất thêm băng đậm có kích thước ~40 kDa Kết cho thấy phân đoạn protein thu điều kiện thích hợp từ mơi trường ni E.coli có kích thước ~40 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein amidase aliphatic (38,069 kDa) 43 45 kDa 36 kDa ~40 kDa Hình 3.14 Hình ảnh điện di protein cảm ứng biểu tế bào E coli BL21(DE3)pLysS (Giếng M: Protein marker low range M3913 Sigma; Giếng 1: Đối chứng dương - PR4amiE E coli BL21 DE3 không bổ sung IPTG; Giếng 2-9: Cảm ứng biểu amiE E coli BL21 DE3 IPTG) 3.5 Kết đánh giá sinh trưởng tế bào E coli tái tổ hợp amiE-PR4 Kết kiểm tra điều kiện cảm ứng biểu amidase IPTG nồng độ khác môi trường nuôi Nuôi tăng sinh E coli BL21-amiE môi trường LB-Kana acrylamide (với việc bổ sung acrylamide theo tỉ lệ 1:10) đồng thời bổ sung IPTG kích hoạt hoạt động T7 promoter hình thành khả biểu amidase Trong nghiên cứu này, E coli tái tổ hợp nuôi dưỡng điều kiện dinh dưỡng chất cảm ứng biểu với tế bào đối chứng dương Qua hình 3.15a 3.15b, ta nhận thấy, xuất số lượng lớn khuẩn lạc trắng đĩa thạch ni E coli tái tổ hợp (Hình 3.15b), không xuất khuẩn lạc đĩa thạch chứa E coli khơng có gen mã hóa amidase (Hình 3.15a) Có thể nhận xét E.coli tái tổ hợp có khả phát triển mơi trường chứa acrylamide Hình 3.15c 3.15d cho ta thấy, mơi trường bổ sung IPTG không bổ sung acrylamide xuất xấp xỉ 100 khuẩn lạc (Hình 3.15c) môi trường bổ sung acrylamide với nồng độ 40mg/mL (Hình 3.15d) có gấp lần số lượng khuẩn lạc trắng so với hình 3.15c Có thể nhận xét rằng, acrylamide làm tăng khả sinh trưởng E coli tái tổ hợp Khi so sánh số lượng khuẩn lạc hình thành mẫu chứa acrylamide IPTG (Hình 3.15e, f) có số lượng khuẩn lạc tương đối so với mẫu chứa IPTG (Hình 3.15c) acrylamide (Hình 3.15d) mẫu lại cho thấy kích thước khuẩn lạc lớn bình thường Bên cạnh tăng nồng độ acrylamide từ 40mg/ml (Hình 3.15e) lên 80mg/ml (Hình 3.15f), số lượng kích thước khuẩn lạc đồng thời tăng theo Kết cho thấy, amidase aliphatic có khả gia tăng biểu khả phân giải acrylamide thành amit ammonia đồng thời bảo vệ tế bào E coli sinh trưởng môi trường a Đối chứng không cảm ứng IPTG b E coli BL21 (DE3) c E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ni mơi trường có IPTG d E coli BL21(DE3) tái tổ hợp ni mơi trường có acrylamide 40 mg/mL e E coli BL21 (DE3)-TTH nuôi môi trường có IPTG, acrylamide 40 mg/mL f E coli BL21 (DE3)-TTH ni mơi trường có IPTG, acrylamide 80 mg/mL Hình 3.15 Đánh giá sinh trưởng tế bào E coli tái tổ hợp amiE-PR4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã tách chiết đoạn gen amiE (1038 bp) từ vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 Đoạn gen amiE tách dòng từ chủng Rhodococcus erythropolis PR4 có kích thước tương đồng với gen amiE lý thuyết (đã công bố ngân hàng Gen) - Tạo dòng biểu thành cơng protein amidase aliphatic kích thước tiểu đơn vị xấp xỉ 40 kDa thơng qua vi khuẩn E coli Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli khác để tìm giải pháp tối ưu cho việc biểu amidase aliphatic vi khuẩn E coli - Tiến hành thu nhận môi trường nuôi vi khuẩn tái tổ hợp sử dụng chất nhóm phức acrylamide nhằm đánh giá khả phân giải acrylamide tạo dẫn xuất amit ammonia TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tham khảo tiếng việt Phạm Thị Trân Châu (2007) Công nghệ sinh học Tập 3, NXB Giáo dục, Hà Nội Dương Văn Cường, Nguyễn Huy Thuần (2017), Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Phạm Thành Hổ (2005), Nhập môn công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thái Sơn (2010), “Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu quy trình xác định nhanh vi khuẩn lao lao kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” , Học viên quân y, Hà Nội,16 Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở di truyền phân tử Kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội II Tài liệu tham khảo tiếng anh Abramova, L I., Bajburdov, T A., Grigoryan, E P., Zilberman, E N., Kurenkov, V F., et al (1992), Polyacrylamide, Khimiya, Moscow- Russian Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (2002), Short Protocol in Molecular Biology, Vol and 5thed, John Wiley & Sons Inc, USA Baneyx, F (1999) "Recombinant protein expression in Escherichia coli" Curr Opin Biotechnol, 10(5), 411-421 10 Biological Resource Center, NITE (NBRC), Rhodococcus erythropolis PR4 (=NBRC100887), https://www.nite.go.jp/en/nbrc/genome/project/ annotation /pr4.html., 10/10/2014 11 Brown DA, Chidambaram MV, Clarke JJ, McAleese DM, (1978), “Design of iron (III) chelates in oral treatment of anemia: solution properties and absorption of iron (III) acetohydroxamate in anemic rats”, Bioinorg Chem, Sep, 9(3), pg 255-275 12 Calderbank, A (1989), “The occurrence and significance of bound pesticide residues in soil”, Rev Environ Contam Toxicol., 108, pg 71-103 13 Ciskanik, L M., J M Wilczek, R D Fallon (1995), “Purification and characterization of an enantioselective amidase from Pseudomonas chlororaphis B23, Appl Environ Microbiol, 61, pg 998–1003 14 Croll, B T.; Arkell, G M.; Hodge, R P J., “Residues of acrylamide in water”, Water Res ,8, pg 989-993 15 Doran JP, Duggan P, Masterson M, Turner PD, O’Reilly C (2005) “Expression and purification of a recombinant enantioselective amidase”, Protein Expr Purif, 40:190–196 16 Farkas, E.; Kurzak, B (1990), “Potentiometric and Spectroscopic Studies of Binary and Ternary Copper(II) Complexes with Histidinehydroxamic Acid”, J Coord Chem, 22, pg 145-151 17 Field E A., Price C J., Sleet R B., Marr M C., Schwetz B A, Morrissey R E (1990), “Developmental toxicity evaluation of acrylamide in rats and mice”, Fundam Appl Toxicol, 14, pg 502-512 18 Fournand D., A Arnaud, P Galzy.(1998), “Study of the acyl transfer activity of a recombinant amidase overproduced in an E Coli strain Appli-cation for shortchain hydroxamic acid and acid hydrazide synthesis”, J Mol.Catal, B4, pg 77–90 19 Fournand D, Bigey F, A Arnaud (1998), “Acyl Transfer Activity of an Amidase from Rhodococcussp Strain R312: Formation of a Wide Range of Hydroxamic Acids”, Appl Environ Microbiol, Vol 64, No 8, pg 2844–2852 20 Fournand D, Arnaud A (2001), “Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity”, J Appl Microbiol, 91, pg 381–393 21 Glick BR, Pasternak JJ (2003), “Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA”, ASM Press, USA, 3rded 22 Gao, W Y., H Mitsuya, J S Driscoll, D G Johns (1995), “Enhancement by hydroxyurea of the anti-human immunodeficiency virus type potency of b-fluoro29,39-dideoxyadenosine in peripheral blood mononuclear cells”, Biochem Pharmacol, 50, pg 274–276 23 Grinberg VY, Burova TV, Grinberg NV, Shcherbakova TA, Guranda DT (2008), “Thermodynamic and kinetic stability of penicillin acylase from Escherichia coli”, Biochim Biophys Acta, 1784(5), pg 736–746 24 Hamer, R R L., J J Tegeler, E S Kurtz, R C Allen, S C Bailey, M E Elliott, L Hellyer, G C Hessley, P Przekop, B S Freed, J White, L L Martin (1996), “Dibenzoxepinone hydroxylamines and hydroxamic acids: dualinhibitors of cyclooxygenase and 5-lipoxygenase with potent topical anti- inflammatory activity”, J Med Chem, 39, pg 246–252 25 Hashimoto, Y., M Nishiyama, O Ikehata, S Horinouchi, T Beppu (1991), “Cloning and characterization of an amidase gene fromRhodococcus species N-774 and its expression in Escherichia coli”, Biochim Biophys Acta, 1088, pg 225–233 26 Heitner, H I., and R G Ryles ( November 1992), European patent, B1, 514648 27 Hidenobu Komeda, Nozomi Hariyama , Yasuhisa Asano (2006), “LStereoselective amino acid amidase with broad substrate specificity from Brevundimonas diminuta: characterization of a new member of the leucine aminopeptidase family”, Appl Microbiol Biotechnol, 70, pg 412–42 28 Hirrlinger B., A Stolz, H.-J Knackmuss (1996), “Purification and prop-erties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantio-selectively hydrolyzes 2-arylpropionamides”, J Bacteriol, 178, pg 3501–3507 29 Holmes, L B (1996), “Hydroxamic acid: a potential human teratogen that could be recommended to treat ureaplasma”, Teratology, 53, pg 227–229 30 Hynek Strnad, Miroslav Patek, Jan Fousek, Juraj Szokol, Pavel Ulbrich, Jan Nesvera, Vaclav Paces, Cestmir Vlceka (2014), Genome Sequence of Rhodococcus erythropolis Strain CCM2595, a Phenol Derivative-Degrading Bacterium, genomea.asm.org, 20/3/2014 31 Hodgson J (1995), “Remodeling MMPIs”, BioTechnology, 13, 554–557 32 Kobs, G (1997) “Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM®-T Systems”, Promega Notes, 62, pg 15–18 33 M., Fujiwara, Y., Goda, M., Komeda, H., and Shimizu, S (1997), “Identification of active sites in amidase: Evolutionary relationship between amide bond- and peptide bond-cleaving enzymes (hydrolaseyaspartic acidynitrileyseriney Rhodococcus”, Proc Natl Acad Sci, USA, 94, pg 11986-11991 34 Kobayashi, M., H Komeda, T Nagasawa, M Nishiyama, S Horinouchi, T Beppu, H Yamada, and S Shimizu (1993), “Amidase coupled with low-mo-lecularmass nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1”, Eur J Bio-chem, 217, pg 327–336 35 Koide, Y., M Uchino, K Yamada.(1987), “ Studies of collectors IX The flotation of a trace amount of uranium by using 2-(alkylamino)propionohy-droxamic acid and cotelomer-type surfactants bearing hydroxyaminocar-bonyl and pyridyl groups” , Bull Chem Soc Jpn, 60, pg 3477–3483 36 Kurzak B, Kozłowski H, Farkas E (1992), “Hydroxamic and aminohydroxamic acids and their complexes with metal ions”, Coordination Chemistry Reviews, 114(2), pg 169–200 37 K V Lavrov, I A Zalunin, E K Kotlova, A S Yanenko (2010), “A New Acylamidase from Rhodococcus erythropolis TA37 can Hydrolyze N-Substituted Amides”, Biochemistry (Moscow), Vol 75, No 8, pg 1111-1119 38 Labahn, J., Neumann, S., Büldt, G., Kula, M R., Granzin, J (2002), “An alternative mechanismfor amidase signature enzymes”, J Mol Biol., 322, pg 1053– 1064 39 Laczi, Krisztián; Kis, Ágnes; Horváth, Balázs; Maróti, Gergely; Hegedüs, Botond (2015), "Metabolic responses of Rhodococcus erythropolis PR4 grown on diesel oil and various hydrocarbons", Applied Microbiology and Biotechnology, 99 (22), pg 9745–9759 40 L E Ryabchenko, D A Podchernyaev, E K Kotlova, A S Yanenko (2006), “Cloning the Amidase Gene from Rhodococcus rhodochrous M8 and Its expression in Escherichia coli”, Russian Journal of Genetics, Vol 42 (8), pg 886– 892 41 Lewellyn, M E.May (1996), World patent, WO, 96/14271 42 Ma DY, Zheng QY, Wang DX, Wang MX (2006), “Dramatic enhancement of enantioselectivity of biotransformations of beta-hydroxy nitriles using a simple Obenzyl protection/docking group”, Org Lett, 8, pg 3231–3234 43 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989), Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory, USA “Molecular Cloning-A 50 44 Mayaux, J.-F., E Cerbelaud, F Soubrier, D Faucher, D Pe´tre´ (1990), “Purification, cloning, and primary structure of an enantiomer-selective ami-dase from Brevibacteriumsp strain R312: structural evidence for genetic coupling with nitrile hydratase”, J Bacteriol,172, pg 6764–6773 45 Mayaux, J.-F., E Cerbelaud, F Soubrier, P Yeh, F Blanche, D Pe´tre´ (1991), “Purification, cloning, and primary structure of a new enantiomer-selective amidase from Rhodococcusstrain: structural evidence for a con-served genetic coupling with nitrile hydratase”, J Bacteriol, 173, pg 6694–6704 46 Mbuyi, J M., J Dequeker, F Bloemmen, E Stevens (1982) "Plasma proteins in human cortical bone: enrichment of alpha HS-glycoprotein, alpha acidglycoprotein, and IgE", Calcif Tissue Int, 34(3), pg 229-231 47 Mohamed S Nawaz, Ashraf A.Khan, John E.Seng, Julian E Leakey, Paul H Siitonen, Carl E Cerniglial (1994), “Purification and Characterization of an Amidase from an Acrylamide-Degrading Rhodococcus sp”, Appl Environ Microbiol, 60, pg 3343–3348 48 Mohamed S Nawaz, Wirt Franklin, Carl E Cerniglla (1994), “Degradation of Aliphatic Amide Mixture by Immobilized and Nonimmobilized Cells of Pseudomonas sp”, Environmental science and technology, 28, pg 1106-1109 49 Makoto Urai, Yoshizaki, Hirosi Anzai, Jun Ogihara, Noriyuki Iwabuchi, Shigeaki Harayama, Michio Sunairia, Mutsuyasu Nakajima (2007), “Structural analysis of mucoidan, an acidic extracellularpolysaccharide produced by a pristaneassimilatingmarine bacterium Rhodococcus erythropolis PR4”, Carbohydrate Research, 342, pg 927–932 50 Malamas MS, Carlson RP, Grimes D, Howell R, Glaser K, Gunawan I, Nelson JA, Kanzelberger M, Shah U, Hartman DA (1996), “Azole phenoxy hydroxyureas as selective and orally active inhibitors of 5-lipoxygenasez”, J Med Chem, 39(1), pg 237-245 51 Novagen (2006) "pET System Manual" TB055 11th Edition, Rev.B, 0403, USA 52 Nagasawa, T., and H Yamada (1989), “Microbial transformation of nitriles”, Trends Biotechnol, 7, pg 153-158 51 53 Nawaz, M S., W Franklin, and C E Cerniglia (1993), “Degradation of of acrylamide by immobilized cells of a Pseudomonas sp and Xanthomonas maltophilia”, Can J Microbiol, 39, pg 207-212 54 O’Mahony R, Doran J, Coffey L, Cahill OJ, Black GW, O’Reilly C (2005), “Characterisation of the nitrile hydratase gene clusters of R erythropolis strains AJ270 and AJ300 and Microbacterium sp AJ115 indicates horizontal gene transfer and reveals an insertion of IS1166”, Antonie Van Leeuwenhoek, 87, pg 221–232 55 Park HJ, Uhm KN, Kim HK (2008), “R-stereoselective amidase from R erythropolis no acting on 4-chloro-3-hydro-xybutyramide”, J Microbiol Biotechnol, 18, pg 552–559 56 Robert Mierendorf, Keith Yeager, R Novy (1994) "pET system: Your choice for expression.", News letter of Novagen Inc, 1(1) 57 Snell D, Colby J (1999), “Enantioselective hydrolysis of racemic ibuprofen amide to s-(?)-ibuprofen by Rhodococcus AJ270”, Enzyme, 24, pg 160–163 58 Sonke T, Ernste S, Tandler RF, Kaptein B, Peeters WP, van Assema FB, Wubbolts MG, Schoemaker HE (2005), “L-Selective amidase with extremely broad substrate specificity from O anthropi NCIMB 40321” Appl Environ Microbiol, 71, pg 7961–7973 59 S S Rao.; D K Jaiswal, P K Ramachandran (1991), “Distribution and metabolism of the insect repellant N,N-Diethylphenylacetamide on Oral Exposure in Rats”, Toxicol Lett., 55, pg 243-248 60 Sugantha priya S, Gowri Shankar J, Thirumalaisamy R, K P (2010) "Over Expression of IPTG inducible GST protein in E coli BL21.", Journal of Biomedical Sciences and Research, 2(1), pg 54-59 61 Tanii H., Miki N., Hayashi M., Hashimoto K Arch (1988), “Cytotoxicity of acrylamide and related compounds to mouse neuroblastoma and rat schwannoma cells”, Toxicol., 61, pg 298-305 62 The QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany 63 Thiery, A., Maestracci, M., Arnaud, A., Galzy, P , Nicolas, M (1986), “Purification and properties of an acylamide amidohydrolase (E.C 3.5.1.4) with a 52 wide activity spectrum from Brevibacterium sp R312”, J Basic Microbiol, 26, pg 299–311 64 Trott S, Burger S, Calaminus C, Stolz A (2002), “Cloning and heterologou"s expression of an enantioselective amidase from R erythropolis strain MP50”, Appl Environ Microbiol, 68, pg 3279– 3286 65 Tsafack, A., J Golenser, J Libman, A Shanzer, Z I Cabantchik (1995), “Mode of action of iron(III) chelators as antimalarials III Overadditive ef-fects in the combined action of hydroxamate-based agents onin vitro growth of Plasmodium falciparum”, Mol Pharmacol, 47, pg 403–409 66 Wang MX, Lin SJ (2002), ”Practical and convenient enzymatic synthesis of enantiopure alpha-amino acids and amides”, J Org Chem, 67, pg 6542–6545 67 Wang MX, Lu G, Ji GJ, Huang ZT, Meth-Cohn O, Colby J (2000), “Enantioselective biotransformations phenylacetonitriles and of phenylacetamides using racemic alpha-substituted Rhodococcus sp AJ270”, Tetrahedron Asymmetry, 11, pg 1123–1135 68 Wikipedia (2018), Acrylamide, https://vi.wikipedia.org/wiki/Acrylamide, ngày 15/6/2018 69 Wikipedia (2018), Amidase, https://en.wikipedia.org/wiki/Amidase, ngày 17/8/2018 70 Wikipedia (2018), Rhodococcus, https://en.wikipedia.org/wiki/Rhodococcus, ngày 9/8/2018 71 Yasuhisa Asano, Mineo Tachibana, Yoshiki Tani (1982), “Purification and Characterization of Amidase which Participates in Nitrile Degradation”, Agric Biol Chem., 46 (5), pg 1175-1181 72 Zhiquan Xue, Yapeng Chao, Dexian Wang, Meixiang Wang, Shijun Qian (2011) “Overexpression of a recombinant amidase in a complex auto-inducing culture: purification, biochemical characterization, and regio- and stereoselectivity”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38, pg 1931–1938 ... NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN HÀ THU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN AMIDASE ALIPHATIC TỪ Rhodococcus erythropolis PR4 VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME Ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành:... xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, thực đề tài nghiên cứu: Thiết kế vector biểu protein amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 đánh giá hoạt tính enzyme ” nhằm mục đích góp phần vào nghiên... xuất amidase quy mơ cơng nghiệp Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công vector biểu mang gene mã hóa amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4 đánh giá hoạt tính enzyme amidase aliphatic