Nghiên cứu thiết kế vector và biểu hiện gen AtCBF1 trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HỒNG THỊ TƯƠI NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ TƯƠI NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotinana tabacum L.) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tiến Dũng CHỮ KÝ PHÒNG QLĐTSĐH CHỮ KÝ KHOA CHUYÊN MÔN CHỮ KÝ GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Thái Nguyên – 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Tiến Dũng ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018 Học Viên Hoàng Thị Tươi ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa luận văn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu chung thuốc 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Các đặc điểm thực vật học thuốc 1.2 Giới thiệu gen CBF1 1.3 Tính chống chịu thực vật 1.3.1.Tính chịu hạn 1.3.2 Tính chịu nóng 11 1.3.3 Tính chịu lạnh 13 1.4 Ảnh hưởng stress nóng, hạn, lạnh đến trồng 14 1.4.1 Ảnh hưởng stress nóng 14 1.4.2 Ảnh hưởng hạn 15 1.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lạnh 16 1.5 Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu thực vật 17 1.6 Phương pháp chuyển gen thực vật qua Agrobacterium 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:GenAtCBF1 23 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 23 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 23 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 23 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.3.3 Thiết bị thí nghiệm 25 2.4 Nội dung nghiên cứu 25 2.4.1 Nội dung 1: Phân lập gen AtCBF1 25 2.4.2 Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen 25 2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen thuốc 26 2.5 Phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 26 2.5.2 Phương pháp tạo cDNA từ mRNA tổng số 27 2.5.3 Phương pháp nhân gen AtCBF1 kỹ thuật PCR 27 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 28 2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dòng gen AtCBF1 28 2.5.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 29 2.5.7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp 29 2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmid 30 2.5.10 Phương pháp xác định trình tự 32 2.5.11 Thiết kế vector biểu AtCBF1 32 2.5.12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium 33 2.4.13 Phương pháp chuyển gen thuốc 33 2.5.14 Phương pháp chọn lọc phân tích chuyển gen 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lập gen AtCBF1 39 3.1.1 Phân tích gen AtCBF1 sở liệu database 39 3.1.2 Tách dòng gen AtCBF1 40 3.2 Thiết kế vector chuyển gen 45 3.3 Chuyển gen AtCBF1 vào thuốc thông qua A.tumerfaciens 45 3.4 Chọn lọc phân tích hiệu chuyển gen 47 3.5 Phân tích biểu gen chuyển AtCBF1 thuốc 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 27 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 28 Bảng 2.5 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 30 Bảng 2.6 Thành phần môi trường sử dụng chuyển gen 35 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR 37 Bảng 2.8: Chương trình thực phản ứng PCR 38 Bảng 3.2 Kết chọn lọc chuyển gen môi trường bổ sung Kanamycin 25mg/l 47 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Biểu gen AtCBF1 Arabidopsis thaliana 40 Hình 3.2 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng vector chuyển gen AtCBF1 42 Hình 3.3 Kết kiểm tra khuẩn lạc mang gen AtCBF1 PCR enzyme cắt giới hạn 43 Hình 3.4 Kết giải trình tự gen tách dòng AtCBF1 với cặp mồi ngược 44 Hình 3.5 Kết giải trình tự gen tách dòng AtCBF1 với cặp mồi ngược 44 Hình 3.6 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen 48 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT A D A s A A T B A B p B S C N C T A D dN N E D K kb D L B L M A M C M S N A N A D N O D P C R Q T L R M R N R O S D T A TD T E Ti U V Vi r A de A ce to A de Be nz Ba se pa ir C ôn Ce tyl tri D eo D eo Et hy Ki lo Ki lo Lu ria M ak M ult M ur αN Ni co tin a O pti Po ly m Q ua nti Re ge Ri bo Re ac tiv So di Tr is Tr an Tr is Tu m Ul tra Vi rul MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng, sinh sản suất trồng Nhiệt độ thấp dẫn đến thay đổi hình thái, sinh hóa hay chế phân tử từ làm giảm khả sinh trưởng, suất thập trí gây chết thất thu hồn tồn Ở chịu lạnh gặp nhiệt độ thấp thay đổi cấu trúc tế bào vai trò enzyme tham gia trính trao đổi chất tế bào để thích ứng với ngoại cảnh Nghiên cứu tạo chịu lạnh tiến hành nhiều nước giới mang lại hiệu cao công tác chọn tạo giống Bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhiều gene liên quan đến khả chịu lạnh sàng lọc phân tích trồng COR15a (Artus cộng sự, 1996), WCS120 (Houde cộng sự, 1992), COR78/RD29, COR47 (Thomashow, 1999), CBF (Hsieh cộng sự, 2002; Dubouzet cộng sự, 2003; Ito cộng sự, 2006) CBF (C-repeat binding factor) nhóm gene có mặt nhiều loại thực vật Arabidopsis, lúa mì, cà chua, cải Ở Arabidopsis, CBF xác định bao gồm gene: CBF1, CBF2 CBF3 nằm nhiễm sắc thể số 4, yếu tố cảm ứng chịu lạnh (El Kayal cộng sự, 2006) chứng minh vai trò nâng cao tính chịu lạnh thơng qua chế bảo vệ tế bào gặp điều kiện bất lợi (Kasuga cộng sự, 1999; Gilmour cộng sự, 2004) Ở nước ta phần lớn trồng có khả chịu lạnh Với đặc điểm khí hậu có mùa đơng lạnh Miền Bắc, loại trồng thường gặp bất lợi, ngừng sinh trưởng thập chí bị chết Tuy nhiên cơng tác chọn tạo giống chịu lạnh nước ta chưa quan tâm nhiều Trong bối 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách dòng thành cơng gen AtCBF1 thiết kế vector pER8UBQ14::AtCBF1 phục vụ cho công tác chuyển gen trồng Chuyển thành công gen AtCBF1 vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens chủng GV3101 Chuyển gen thông qua chọn lọc kháng sinh kanamycin kết tái sinh chuyển gen thu 92 Kết kiểm tra ngẫu nhiên 30 chuyển gen PCR thu 26/30 dương tính với cặp mồi đặc hiệu AtCBF1 Các trồng nhà lưới sinh trưởng tốt 4.2 Kiến nghị Phân tích biểu gen AtCBF1 RT-PCR thuốc chuyển gen Đánh giá khả chịu lạnh thuốc chuyển gen Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 vào trồng khác lúa, ngô, cà chua, 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại môi trường lúa Nxb Nông nghiệp Tp.HCM Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, Nxb Khoa học Công nghệ Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, Giáo trình cho Cao học Nơng nghiệp Nxb Nơng nghiệp Hà Nội Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh lý thực vật, Nxb Giáo Dục, Hà Nội Trần Thị Phương Liên (1998), “Chuyên đề 3: Cơ chế phân tử tính chịu hạn thực vật” Ong Xuân Phong, Nguyễn Văn Mã (2014), Một số biến đổi sinh lý hạt nảy mầm non đậu tương điều kiện nhiệt độ thấp.Tạp chí Khoa học Phát triển, số 7: 1114-1119 Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trần Văn Tựa, Nguyễn Trung Kiên, Đỗ Tuấn Anh, Đặng Đình Kim (2011), Nghiên cứu khả chống chịu hấp thu chì, kẽm Dương xỉ Ptreris vittataL Tạp chí khoa học cơng nghệ 101 – 109 TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI 10 Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997), Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cupshaped cotyledon mutant Plant Cell 9: 841-857 55 11 Bartels, D and Sunkar R (2005), Drought and salt tolerance in plants, Critical reviews in plant sciences, 24 (1), pp 23-58 12 Bhargava, S and Sawant K (2013), Drought stress adaptation: metabolic adjustment and regulation of gene expression Plant Breeding, 132 (1), pp 21-32 13 Blum, A.(2005), Drought resistance, water-use efficiency, and yield potential—are they compatible, dissonant, or mutually exclusive, Crop and Pasture Science, 56 (11), pp 1159-1168 14 Collins W K; Hawks S N.Jr, (1993), Principles of hte Flue – cured Tobaco Production N.C State Univesity 2nd Ed 300 15 Chaves, M., Flexas J., and Pinheiro C (2009), Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell, Annals of botany, 103 (4), pp 551-560 16 Davis D L.; Nielsen M T (1999), Tobaco Production, Chemistry and technology B Blackwell Science 467 17 Ding Z S., Zhao M., Jing Y X., Li L B and Kuang T Y (2006), “EfficientAgrobacterium, Mediated transformation of Rice by Phosphomannose Isomerase/Mannose selection”,Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.29)5-303 18 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005), The plant cell defense andAgrobacterium tumefaciens.FEMS Microbiology letters, 247, pp 207213 19 Feng, J.-X., Liu D., et al (2005), An annotation update via cDNA sequence analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor gene family, Plant molecular biology, 59 (6), pp 853-868 56 20 Gelvin S B (2003),“Agrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp.16-37 21 Guo, H and Ecker J.R (2004), The ethylene signaling pathway: new insights, Current opinion in plant biology, (1), pp 40-49 22 Hao, D., Ohme-Takagi M., and Sarai A.(1998), Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive elementbinding factor (ERF domain) in plant, Journal of Biological Chemistry, 273 (41), pp 26857-26861 23 Harb, A., Krishnan A., Ambavaram M.M., and Pereira A (2010), Molecular and physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early responses leading Plant Physiol, pp 1254 – 1271 24 Hayano-Kanashiro, C., Calderón-Vázquez C., Ibarra-Laclette E., HerreraEstrella L., and Simpson J.(2009), Analysis of gene expression and physiological responses in three Mexican maize landraces under drought stress and recovery irrigation, PLoS One, (10), pp e7531 25 Hsiao, T.C and Xu L.K (2000), Sensitivity of growth of roots versus leaves to water stress: biophysical analysis and relation to water transport, Journal of experimental botany, 51 (350), pp 1595-1616 26 Jian Lia, Yaqing Wanga, Bo Yua, Qiping Songa, Yang Liua Tony, H.H.Chenb Gang Lia Xinghong Yanga Ectopic expression of StCBF1and ScCBF1 have different functions in response to freezing and drought stresses in Arabidopsis Plant science pp 221 -233 27 Jakoby, M., Weisshaar B (2002), bZIP transcription factors in Arabidopsis, Trends in plant science, (3), pp 106-111 28 Jian Li, Yaqing, Wang BoYu, Qiping Song, Yang Liu, Tony H.H.Chen Gang Li Xing hong, Yang (2018), Plant Science, 221-233 57 29 K S Mysore, R P Tuori, and G.B, Martin (2001), Arabidopsis genome sequence as a tool for functional genomics in tomato, Genome Biol 1086 – 1186 30 Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM(1984), Taproot elongation rates of Soybean cultivars in the glasshouse and their relatio to field rooting depth Crop Sci 24: 916 - 920 31 Le, M.Q., Pagter M., and Hincha D.K (2015), Global changes in gene expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RTPCR, during acclimation of three Arabidopsis thaliana accessions to subzero temperatures after cold acclimation, Plant molecular biology, 87 (12), pp 1- 15 32 Le Bras, M., Clement M., Pervaiz S., and Brenner C (2005), Reactive oxygen species and the mitochondrial signaling pathway of cell death Histol Histopathol, pp 205 – 219 33 Le DT, Nishiyama R, Watanabe Y, Mochida K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, and Tran LS (2011), Genom-Wide Expression Proling of Soybean Root and Shoot Tissues under Dehydration Stress DNA Research 18: 17 - 29 34 Lei, Y., Yin C., and Li C (2006), Differences in some morphological, physiological, and biochemical responses to drought stress in two contrasting populations of Populus przewalskii, Physiologia Plantarum, 127 (2), pp 182-191 35 Maruyama, K., Takeda M., et al (2009), Metabolic pathways involved in cold acclimation identified by integrated analysis of metabolites and transcripts regulated by DREB1A and DREB2A, Plant physiology, 150 (4), pp 1972-1980 58 36 Reed S M (1993),Use of stomatal size to distinguish betwween haploid and dihaploid tobaco plant, Tobaco sciences 37: 84 – 86; 37 Riechmann, J.L and Meyerowitz E.M (1998), The AP2/EREBP family of plant transcription factors, Biological chemistry, 379, pp 633-646 38 Rizhsky, L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., and Mittler R (2004), When defense pathways collide The response of Arabidopsis to a combination of drought and heat stress, Plant physiology, 134 (4), pp 1683- 1696 39 Sakuma, Y., Maruyama K., (2006), Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression, The Plant Cell, 18 (5), pp 1292-1309 40 Singh S , Rathore M, Goyary D, Singh RK, Anandhan S, Sharma DK, Ahmed Z Carrot antifreeze protein enhances chilling tolerance in transgenic tomato, Haldwani 263 41 Seki, M., Narusaka M., et al (2002), Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high‐salinity stresses using a fulllength cDNA microarray, The Plant Journal, 31 (3), pp 279292 42 Sheard, L.B and Zheng N (2009), Plant biology: signal advance for abscisic acid, Nature, 462 (7273), pp 575-576 43 Shinwari, Z.K., Nakashima K.,(1998), An Arabidopsis Gene Family Encoding DRE/CRT Binding Proteins Involved in Low-Temperature Responsive Gene Expression, Biochemical and biophysical research communications, 250 (1), pp 161-170 44 Tuteja, N and Sarvajeet S.G (2012), Plant acclimation to environmental stress, Springer Science & Business Media, USA 59 45 Tuteja, N and Sopory S.K (2008), Chemical signaling under abiotic stress environment in plants, Plant signaling & behavior, (8), pp 525-536 46 Xiong, L., Schumaker K.S., and Zhu J.-K (2002), Cell signaling during cold, drought, and salt stress, The plant cell, 14 (suppl 1), pp S165-S183 47 Yang, S., Vanderbeld B., Wan J., and Huang Y (2010), Narrowing down the targets: towards successful genetic engineering of drought-tolerant crops, Molecular plant, (3), pp 469-490 48 Yoshida, T., Fujita Y., et al (2010), AREB1, AREB2, and ABF3 are master transcription factors that cooperatively regulate ABRE‐dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full activation, The Plant Journal, 61 (4), pp 672-685 60 61 62 63 64 65 66 67 ... ĐẠI HỌC NƠNG L M HỒNG THỊ TƯƠI NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR VÀ BIỂU HIỆN GEN AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC L (Nicotinana tabacum L. ) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC... nghệ gene cần thiết Vì vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu thiết kế vector biểu gen AtCBF1 thuốc (Nicotiana tabacum L. ) 1.2 Mục đích nghiên cứu - Thiết kế vector. .. l p gen AtCBF1 39 3.1.1 Phân tích gen AtCBF1 sở liệu database 39 3.1.2 Tách dòng gen AtCBF1 40 3.2 Thiết kế vector chuyển gen 45 3.3 Chuyển gen AtCBF1 vào thuốc