Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Ở mức độ phân tửđiều kiện bất lợi của môi trường sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện vàtích lũy hàng loạt các gen và protein đáp ứng lại điều kiện bất lợi của môi trường.Các ge

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-CHU THỊ NGỌC ÁNH

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC

LÁ (Nicotiana tobacum L) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium

tumefacciens”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2014 - 2018

Thái Nguyên - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-CHU THỊ NGỌC ÁNH

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC

LÁ (Nicotiana tobacum L) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium

tumefaciens”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là một công trình nghiên cứu độc lập không có sự sao chép của người

khác Đề tài là một sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tạikhoa CNSH-CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Trong quá trình viếtbài có sự tham khảo một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Tiến Dũng và GS TS Ngô Xuân Bình Tôi xin cam đoan nếu có vấn

đề gì tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

Chu Thị Ngọc Ánh

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tớithầy giáo TS Nguyễn Tiến Dũng và thầy giáo GS TS Ngô Xuân Bình, giảng viênkhoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ vàhướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cảm ơn ThS Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốtnhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗdựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng độngviên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thờigian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài không thểtránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy

cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoaCông nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,thành công trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện Chu Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về tính chống chịu (stress) của thực vật

3 2.1.1 Khái niệm stress 3

2.1.2 Tính chất của các tác nhân gây stress 3

2.1.3 Phản ứng của thực vật với stress 3

2.2 Ảnh hưởng của stress đến sinh trưởng và phát triển cây trồng 5

2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

5 2.2.2 Ảnh hưởng của tính chịu hạn đến sinh trưởng và phát triển cây trồng

6 2.3 Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ thấp ở thực vật

6 2.3.1 Trên thế giới 7

2.3.2 Ở Việt Nam 9

2.4 Đặc điểm của gen CBF1 9

2.5 Chuyển gen ở thực vật 12

42.5.1 Khái niệm chuyển gen ở thực vật .12

2.5.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 12

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 21

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

3.1.2 Hóa chất 21

3.1.3 Thiết bị thí nghiệm 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 23

3.3.2 Phương pháp chuyển gen ở thuốc lá 26

3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp PCR 28

3.3.5 Các chỉ tiêu đánh giá 29

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Thiết kế vector chuyển gen 30

4.3 Chọn lọc và phân tích hiệu quả chuyển gen 34

4.4 Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AtCBF1 trên cây thuốc lá 36

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADP Adenosine Diphotphat

As

ACS

AcetosyringoneAgrocinopine SynthaseATP Adenosin Triphosphat

cs Cộng sự

CTAB

DREB

Cetyltrimethylammonium BromideDehydration-Responsive Element-BindingDNA Deoxynucleic acid

dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

Kb Kilo base

kDa Kilo Dalton

LB Luria và Bertani

LB Left Border

MAS Maker- Assisted Selection

MCS Multi Cloning Site

RMOP Regeneration Medium for Organogenesis PlantRNA Ribonucleic Acid

ROS

RFLP

Reactive Oxygen SpeciesRestriction Fragment Length PolymorphismtgSDS Sodium Dodecyl Sufate

TAE Tris bazơ - Axit acetic - EDTA

T-DNA Tranfer - DNA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.2 Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen 27

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 29

Bảng 3.4: Chương trình thực hiện phản ứng PCR 29

Bảng 4.1 Kết quả chuyển gen CBF1 ở cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 34

Bảng 4.3 Kết quả đánh giá hiệu quả chuyển gen CBF1 trên cây thuốc lá 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne 15

Hình 2.2 Ti-plasmid của A.tumefaciens dạng nopalin 16

Hình 2.3 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật 19

Hình 4.1 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gen AtCBF1 30

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen AtCBF1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn 31

Hình 4.3 Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen 36

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtCBF1 39

1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Phần 1

MỞ ĐẦU

Hàng trăm năm qua con người đã luôn tìm kiếm các phương pháp để cải tiếncây trồng với mục tiêu tăng năng suất cũng như chất lượng Mặc dù các phươngpháp chọn, tạo giống truyền thống đã mang lại nhiều thành tựu trong công tác pháttriển giống cây trồng, nhưng dường như vẫn chưa thỏa mãn nhu cầu thực tế Côngnghệ gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vốn gây rất nhiềukhó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một cây trồng hoànhảo hơn khi chúng được kết hợp với nhau Tính trạng mong muốn sẽ được tạo rabằng cách đưa thêm một đoạn gen vào hệ gen của cây bằng con đường trực tiếp haygián tiếp thông qua kỹ thuật chuyển gen

Đến nay, sau hơn 20 năm đưa vào canh tác, cây trồng biến đổi gen đangmang lại những hiệu quả rõ rệt như tăng năng suất, cải thiện chất lượng, giảm ônhiễm môi trường, nâng cao thu nhập cho người dân,… Cây trồng biến đổi gen hiệnđang chiếm một diện tích đáng kể trên toàn cầu và hứa hẹn còn tiếp tục phát triểntrong những năm tới

Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như hạn, mặn, lạnh,… thực vật phảithay đổi các quá trình sinh lý, sinh hóa để tồn tại và thích nghi Ở mức độ phân tửđiều kiện bất lợi của môi trường sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện vàtích lũy hàng loạt các gen và protein đáp ứng lại điều kiện bất lợi của môi trường.Các gen đáp ứng bất lợi của môi trường được chia làm hai nhóm: nhóm gen trựctiếp chống lại điều kiện môi trường bất lợi và nhóm gen điều hòa biểu hiện của cácgen chức năng tham gia trực tiếp vào phản ứng chống chịu điều kiện bất lợi

Gần đây, Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ Sinh học

và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã phân lập đượcmột số gen có khả năng tăng cường tính chống chịu stress của cây trồng như hạn,lạnh, nóng Tuy nhiên các gen này cần thiết phải tiến hành đánh giá biểu hiện cũngnhư khả năng ứng dụng trên cây trồng để làm cơ sở tiến hành các ứng dụng chuyểngen

Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng chuyển gen chịu nhiệt AtCBF1 trên cây thuốc lá.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen AtCBF1

Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá.

Nội dung 3: Nghiên cứu phương pháp chọn lọc và đánh giá hiệu quả

chuyển gen AtCBF1.

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, thu nhận được nhiều kinh nghiệmthực tế cũng như tác phong làm việc khoa học phục vụ cho công tác sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá làm cơ sở cho việc chuyển

gen này trên các cây trồng khác như lúa, ngô, cà chua…

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về tính chống chịu (stress) của thực vật

2.1.1 Khái niệm stress

Khái niệm stress được dùng để chỉ những yếu tố bên ngoài gây ảnh hưởngbất lợi cho thực vật và phản ứng của cơ thể thực vật đối với các tác nhân gây stressnày Đó là tính chống chịu của thực vật đối với điều kiện bất lợi của môi trường [3]

Dưới các điều kiện tự nhiên và nhân tạo thực vật không ngừng chịu cácstress Các tác nhân gây nên stress cho thực vật là khô, hạn, lạnh, nóng, mặn, sự ônhiễm không khí Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặctrưng của thực vật Sinh lý stress nghiên cứu mối quan hệ khăng khít đó giữa cơ thểvới môi trường, đồng thời đưa ra những biện pháp nhằm giúp cho cây trồng nângcao khả năng chống các stress của môi trường [3]

2.1.2 Tính chất của các tác nhân gây stress

Stress có thể làm giảm mạnh sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, qua

đó làm giảm năng suất cây trồng Do đó tìm hiểu cơ chế gây hại của các tác nhângây stress cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọngtrong trồng trọt

Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có nhiềustress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật Ví dụ stress thiếu nướcthường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ cao ở lá

Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác nhân stresschỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ) có những yếu tố môi trường phải mất nhiều ngàyhay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất, chất khoáng ) [3]

Tác nhân gây stress cho loài thực vật này có thể không gây cho loài thực vật khác

2.1.3 Phản ứng của thực vật với stress

Phản ứng của cơ thể thực vật với các tác nhân gây stress có thể là phản ứngđặc thù hay không đặc thù Phản ứng đặc thù là những phản ứng ngược với nhữngbiến đổi theo qui luật tự nhiên bình thường Ví dụ khi nhiệt độ cao, qui luật tự nhiên

bình thường là độ nhớt của tế bào giảm nhưng ở đây cơ thể phản ứng đặc thù ngượcqui luật trên là độ nhớt không bị giảm dưới tác động của nhiệt độ cao - phản ứngnày dẫn đến thích nghi Phản ứng không đặc thù là những phản ứng tuân theo quiluật bình thường của tự nhiên như khi gặp nhiệt độ cao thì độ nhớt giảm [3].

Tính chống chịu stress của thực vật như là quá trình hình thành các đặc điểmthích nghi đó là những phản ứng tự vệ mang tính đặc thù Phản ứng đáp ứng của câyvới các điều kiện bất lợi có thể rất khác nhau tùy thuộc vào đặc tính và cường độcủa các nhân tố gây ra stress

Đặc điểm của phản ứng trước hết phụ thuộc vào cường độ của tác nhân gâyphản ứng Ở cường độ các nhân tố còn thấp chưa tới ngưỡng gây stress thì cây biểuhiện bình thường Khi tác nhân có cường độ mạnh đến ngừng gây stress cơ thể mớixuất hiện phản ứng tự vệ, lúc đó cơ thể xuất hiện những đặc tính mới mà trước đóchưa có, đó là những đặc điểm chống chịu stress [3]

Khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi là tiềm năng của toàn bộ cơ thểthực vật Nhưng thường sự chống chịu chỉ xuất hiện từng lúc theo sự xuất hiện từngyếu tố nhất định phát huy ưu thế của nó lên cơ thể, lúc đó cơ thể phát sinh ra khảnăng chống chịu yếu tố do tiềm năng chống chịu có sẵn trong cơ thể, khi gặp yếu tốnào sẽ gây phản ứng tự vệ thích ứng của cơ thể với yếu tố đó

Có hai hình thức chống chịu: chống chịu riêng biệt từng yếu tố gây stress vàchống chịu liên kết với nhiều yếu tố gây stress đồng thời

Theo một số nhà khoa học Phản ứng tự vệ của cây trước các stress của môitrường thể hiện chung nhất là những biến đổi tính chất của nguyên sinh chất của tếbào

- Giảm mức độ phân tán của nguyên sinh chất

- Tăng tính thấm của nguyên sinh chất

- Biến tính protein của nguyên sinh chất

- Hóa coaxecva nguyên sinh chất

Khi gặp các stress của môi trường phản ứng đặc trưng để tự vệ của thực vật

là những phản ứng theo chiều hướng ngược lại những phản ứng bình thường khôngđặc trưng Ví dụ khi gặp nhiệt độ cao chiều hướng phản ứng bình thường của cây

không có khả năng chịu nóng là độ nhớt giảm Nhưng với cây chịu nóng khi gặpnhiệt độ cao độ nhớt lại tăng lên để chịu được nhiệt độ cao.

Trong quá trình phản ứng tự vệ với các stress của môi trường nhiều khi cơthể tạo ra những đặc tính thích nghi của cây với yếu tố bất lợi và chuyển yếu tố bấtlợi thành điều kiện sống bình thường của cây, yếu tố cần thiết cho cây sinh trưởngphát triển Ví dụ một số cây do sống trong môi trường mặn đã hình thành đặc tínhthích nghi với môi trường mặn đó, dần dần đất mặn là điều kiện sống thích hợp choloại cây này, cây phát triển tốt trong môi trường mặn so với môi trường bìnhthường Như vậy từ khả năng chống chịu đã chuyển thành đặc tính thích nghi

2.2 Ảnh hưởng của stress đến sinh trưởng và phát triển cây trồng

Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tạimột chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trìnhphát triển Do đó, khác với động vật, thực vật thường xuyên đối mặt trực tiếp vớicác điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển.Những tác động bất lợi từ môi trường có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh

và hình thái; từ đó ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng

2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trường vẫn đủ nước do nhiệt

độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của hệ mạch Đồngthời nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế cácquá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các enzym hoạt động yếu Ở nhiệtthấp màng nguyên sinh chất bị tổn hại làm tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chấtdinh dưỡng của tế bào Nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng bộ rễ

Sự hút nước và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nước và chất dinhdưỡng Nhiệt độ thấp làm tổn hại đến màng tế bào, màng các bào quan như lục lạp,

ty thể từ đó ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh lý của cây như quang hợp, hôhấp Ở các cây không chịu lạnh các lipid của màng có tỷ lệ chuỗi axit béo bão hoàcao hơn cây chịu lạnh, do đó gặp lạnh màng có khuynh hướng đổi thành trạng tháibán tinh thể Khi tính lỏng của màng kém, các protein của màng không hoạt động

bình thường dẫn đến hậu quả xấu cho sự vận chuyển các chất, sự biến đổi nănglượng và hoạt động enzym [18].

2.2.2 Ảnh hưởng của tính chịu hạn đến sinh trưởng và phát triển cây trồng

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượngsản phẩm của cây trồng

Khi hạn hán cây bị stress nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng:

- Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo [8] Sự co nguyênsinh các tế bào diễn ra khi nồng độ nước trong môi trường quá cao hay do stressnước làm cho nước trong tế bào thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tếbào co lại, thể tích không bào thu hẹp Khi môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mấtnước không bào co lại, mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra Sự héo tạm thời nhưngcũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước nghiêm trọng và kéo dài

- Hạn hán cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ Khi thiếu nước do hạnhán sự cung cấp nước cho rễ không đủ trong đêm để thủy hoá các mô đã bị thiếunước ban ngày, các lông hút bị tổn thương lớp ngoài vùng vỏ bị phủ suberin đãlàm giảm áp suất rễ để đẩy cột nước lên trong mạch gỗ Đặc biệt khi thiếu nước sẽhình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ phá vỡ tính liên tục của cột nước nên cộtnước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục

- Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước quabiểu bì

- Hạn hán làm giảm mạnh quang hợp Sự thiếu nước làm giảm cường độquang hợp Khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40-50% quang hợp của lá bịđình trệ [3]

- Hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây Do thiếu nước ảnh hưởng đến cáchoạt động sinh lý nhất là quang hợp, nên làm giảm sinh trưởng, cây chậm lớn, năngsuất giảm sút

2.3 Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ thấp ở thực vật

2.3.1 Trên thế giới

Ở phía bắc nước Nhật, hiện tượng bất thụ do nhiệt độ lạnh được xem nhưvấn đề nghiêm trọng nhất làm năng suất lúa giảm rất nhiều [43] Đối với kiểu gencây lúa mẫn cảm với tính trạng bất thụ do nhiệt độ lạnh, giai đoạn tăng trưởng nhạycảm nhất là giai đoạn làm đòng, đặc biệt là giai đoạn vi bào tử chuyển từ pha

“tetrad” sang pha đầu tiên của nhiễm thể thu nhỏ lại, xét trên cơ sở gián phân nhiễmthể trong di truyền tế bào [36] Nhiệt độ thấp trong suốt qúa trình phát sinh vi bào tử(microsporogenesis) sẽ làm cho thoái hóa vi bào tử và tạo ra hiện tượng phình to tếbào hạt phấn Mặt khác, cơ quan của noãn vẫn duy trì được khả năng thụ tinh mộtcách bình thường, nhưng tiến trình phát triển microspore hoàn toàn bị ức chế [19]

Do đó, hiện tượng thoái hóa microspore hoặc hiện tượng phình to tế bào hạt phấnđược xem như phản ứng của kiểu gen bất thụ đối với sự tổn thương do nhiệt độ lạnh[33] Cơ chế chống chịu lạnh hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu một cách chi tiết,còn nhiều câu hỏi chưa được giải đáp thỏa đáng Muốn đạt được một kết qủa thànhcông về thụ phấn, cây lúa cần có đủ số lượng hạt phấn cần thiết trong túi phấn Sốlượng hạt phấn giảm theo nghiệm thức xử lý lạnh làm cho tỉ lệ bất thụ gia tăng rất

có ý nghĩa [39] Những giống lúa chống chịu lạnh thường sản sinh ra số lượng hạtphấn nhiều hơn giống nhiễm [41] Như vậy, chúng ta có thể nói rằng số lượng hạtphấn là một yếu tố quan trọng trong cơ chế chống chịu lạnh Người ta còn ghi nhận

số lượng hạt phấn tương quan thuận với chiều dài túi phấn [34]; [44], và dường nhưchiều dài túi phấn có tương quan với hiện tượng chống chịu lạnh [46] Hiện tượngchống chịu lạnh là tính trạng di truyền số lượng và chưa có một gen chủ lực nàođược xác định [43] Futsuhara và Toriyama (1966) ước đoán rằng: số gen chốngchịu lạnh có thể là 4 gen hoặc nhiều hơn 4 gen Chúng liên kết rất chặt với gen Pr(tính trạng võ trấu màu tím), Rc (tính trạng võ lụa hạt gạo màu nâu), d2 (tính trạnglùn), gh (tính trạng võ trấu màu vàng), nl (neck leaf), và bc (tính trạng thân rạ giòn,

dễ bẻ gãy = brittle) trên nhiễm sắc thể số 3, 4, 5 và 7 [14]; [37]; [45]

Giống lúa “Norin-PL8” có gen chống chịu lạnh kế thừa từ giống lúa Silewah(japonica) Saito và ctv (2001) đã quan sát trên hai đoạn nhiễm sắc thể được hội tụ

gen mục tiêu từ Silewah, định vị trên nhiễm thể số 3 - vai ngắn, và trên nhiễm thể số

4 - vai dài [42] Các tác giả này đã tiến hành lập bản đồ QTL theo kiểu” finemapping”, tập trung trên nhiễm thể số 4, trên cơ sở quần thể hồi giao (BC) và NIL(nearly isogenic lines) Norin-PL8 là giống lúa chống chịu lạnh được phát triển nhờlai hồi giao giữa giống japonica chống chịu lạnh Silewah với một dòng lúa NhậtHokkai 241, trong đó dòng Hokkai 241 được dùng làm dòng tái tục (recurrentparent), và Silewah là giống cho gen mục tiêu (donor) Saito và ctv (2001) đã chọnđược một dòng Syo6 từ tổ hợp lai Kirara 397 / Norin

PL8 // Kirara 397 (quần thể BC1F5) Dòng Syo6 có chứa đoạn nhiễm sắc thể

số 3 và 4 hội tụ gen mục tiêu từ Norin-PL8 Sau hai lần hồi giao, tác giả đã chọnmột cây dị hợp tử đối với hội tụ gen mục tiêu ở nhiễm thể số 4, nhưng không có genmục tiêu ở nhiễm thể số 3 Cho cây này tự thụ phấn, người ta phát triển quần thểphân ly ký hiệu là BT4, và 114 cây BT4 này được chọn để sử dụng trong phân tíchbản đồ cách quãng Mẫu DNA được ly trích từ lá lúa theo phương pháp CTAB [29].RFLP marker được sử dụng có nguồn gốc từ chương trình genome cây lúa của Nhật(RGP) ký hiệu là “R” và “C”, có nguồn gốc từ Saito và ctv (1991) ký hiệu là

“XNpb” Phương pháp đánh giá kiểu hình tính trạng chống chịu lạnh trong nước cónhiệt độ lạnh [13], được xem như là phương pháp thống nhất trong thanh lọc giống

tượng khối sơ khởi đến giai đoạn trỗ Độ sâu mực nước 20 cm ở thí nghiệm ngoàiđồng và 24 cm ở trong nhà lưới Đánh giá hạt hữu thụ để kết luận về thanh lọcchống chịu lạnh Saito và ctv (2001) đã sử dụng phần mềm MAPL97 [20]; [53] đểphân tích QTL và bản đồ QTL Muốn xác định chính xác vị trí QTL trên nhiễm sắcthể số 4, người ta phát triển một quần thể hồi giao cải tiến, chọn Kirara 397 làmgiống tái tục Bổ sung thêm 5 RFLP marker (R738, R740, R1427, R2737 vàC1016), 2SCAR marker (SCAB1 và SCAM20) để phân tích Những marker đượcthể hiện trên bản đồ (hình 8-1B) Saito và ctv (2001) đã sử dụng 117 cá thể củaquần thể BT4 phân ly để phân tích theo phương pháp cách quãng đối với tính trạngchống chịu lạnh

Saito và ctv (2001) còn phát triển quần thể NIL để thực hiện kỹ thuật “finemapping” QTL điều khiển tính trạng chống chịu lạnh Người ta chọn lựa 12 dòngtái tổ hợp (recombinants) giữa R738 và R1427 trong quần thể BT4 Con lai của mỗi

“recombinant” được phát triển thành những dòng ổn định (fixed) thông qua phươngpháp MAS (markeraided selection) Kiểu hình chống chịu lạnh được đánh giá thôngqua giá trị trung bình của hạt hữu thụ Kiểu gen của BT4-9-7 là kiểu gen của Norin-PL8 đối với marker R738 Tính trạng chống chịu lạnh của BT4-76-2 và BT4-76-7 làkiểu gen của Norin-PL8 đối với marker R738 và R2737 Kết qủa như vậy cho thấyrằng QTL điều khiển tính chống chịu lạnh định vị giữa marker R738 và XNpb102

2.3.2 Ở Việt Nam

Hiện nay có nhiều công trình đi sâu vào nghiên cứu cơ chế chịu lạnh ở mức

độ gen Nhiệt độ thấp trước hết làm thay đổi hoạt động của một số gen, một số loạiprotein nhanh chóng được sinh tổng hợp [18]; [19] Lê Trần Bình và Cs (1989) đãphân tích thành phần protein ở các giống lúa khi bị lạnh tác động và thấy rằng: ởcác giống lúa chịu lạnh có một số protein mới suất hiện, một số khác hàm lượnggiảm xuống, hiện tượng này không thấy ở các giống lúa nhạy cảm với lạnh Ở mức

độ phân tử, khi gặp lạnh hoạt động của các enzyme cung cấp năng lượng nhưATPase của tonoplas tỏ ra bền vững ở những giống lúa chống chịu [34] Tính chấtcủa hệ thống màng nguyên sinh nói chung bị biến đổi dưới tác động của lạnh,những giống cây trồng chịu lạnh thì những biến động đó không làm cho các hoạtđộng trao đổi chất ngừng trệ hoàn toàn

2.4 Đặc điểm của gen CBF1

Đặc điểm gen CBF1: Hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa DRE /

CRT và gây ra sự biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịulạnh của cây trồng Nó mã hóa một thành viên của phân họ DREB A-1 của họ hệ sốphiên mã ERF / AP2 (CBF1) Protein chứa một tên miền AP2 Có bốn thành viên

của họ CBF, đáp ứng với stress phi sinh học của cây Ba gen đầu tiên là CBF1 CBF2 và CBF3, rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4

rất cần thiết cho phản ứng khi có khô hạn xảy ra Gen CBF1 này liên quan đến phản

ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [56]

Các nghiên cứu về gene CBF1

Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tâytrồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên cứucủa Jian Li thuộc Đại học Nông nghiệp Sơn Đông đã cho thể hiện thành công haigen này trong cây Arabidopsis với hai dòng khác nhau Tất cả cây chuyển gen ấyđều thể hiện kiểu hình lùn, trổ bông muộn, lá dầy hơn và điểm những chấm hồng

Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 thể hiện sự chống chịu đáng kể đối với lạnh giá và khô hạn hơn dòng chuyển gen StCBF1 Mức độ thể hiện của nhiều gen liên

quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các gen ức chế cây tăng trưởng và trổbông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các cây chuyển gen

Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển Tuy nhiên, ScCBF1 có chức năng rõ hơn StCBF1 [57].

+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc trườngđại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh, Bắc Kinh,

Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu:” Hoạt động đặc biệt của gen CBF1 cây dương

trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp” Các yếu tố liên kết C-repeat (CBFs),cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố phản ứng mất nước (DREB1),đóng vai trò quan trọng trong việc thu nhận khả năng chịu stress, nhưng trong cây,các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress vẫn còn khó nắm bắt Để hiểu rõ hơn về

các cơ chế này, nhóm nghiên cứu đã phân lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây

dương (Populus spp) Và đánh giá biểu hiện của chúng trong điều kiện hạn hán,lạnh, nhiệt và muối Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý

một mối tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng

chịu lạnh Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứngsuất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với sự

phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương Sau đó, nhóm

nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm toàn bộ bộ gen trong Populus

trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả định; các gen được xác định

tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh học Hầu như tất cả các gen mụctiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis mà trung gian phản ứng với các tín

hiệu môi trường và nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò quan trọng của CBF1

trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp Cuối cùng, phân tích 528 cá thể củaPopulus simonii đã xác định sáu đa hình đơn nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q

<0,10) đáng kể (P <0,005) kết hợp với sản xuất malondialdehyde và rò điện phân,

cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của PsCBF1 trong quy định một số chức năng

liên quan đến màng tế bào Phát hiện của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu

biết mới về chức năng của PsCBF1 và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian CBF trong cây dương [58].

+ Nghiên cứu: “Biểu hiện cảm ứng ectopic của At-CBF1 trong cà chua

chuyển gien không có marker làm tăng khả năng chịu lạnh “Trong một nỗ lực để cảithiện khả năng chịu đựng lạnh của stress, một gen yếu tố liên kết C-lặp lạiArabidopsis C (At-CBF1) được thúc đẩy bởi promoter cảm ứng RD29A được đồngchuyển vào cà chua var Shalimar Marker (NPTII) - chuyển gen miễn phí thu được

trong thế hệ T (1) vì sự tích hợp không liên kết của các gen CBF1 và NPTII Phản

ứng chuỗi sao chép ngược polymerase đã khẳng định sự biểu hiện của CBF1 trongcác dòng chuyển gen T (1) Nghiên cứu mô hình biểu hiện trong T (1) dòng biến đổigen cho thấy sự gia tăng dần dần với thời gian làm lạnh kéo dài và cũng khẳng định

sự đảo ngược của biểu hiện về loại bỏ stress Cây chuyển gen không có sự khác biệt

về hình thái và nông học so với cây không biến đổi Khi cây chuyển gen non bị phơinhiễm với stress lạnh (4°C) trong 3 ngày, tăng tỷ lệ sống (50%) ở các dòng chuyểngen so với cây không biến đổi (10%) Cây chuyển gen chịu áp lực làm lạnh cho thấy

sự giảm đáng kể chỉ số tổn thương màng và peroxid hóa lipid và cũng làm tăng hàmlượng proline tự do đáng kể trong các mô lá so với cây không biến đổi Vì vậy,những phát hiện này chỉ ra rằng cây cà chua chuyển gen không có marker không

biểu hiện gen Arabidopsis CBF1 cung cấp khả năng bảo vệ và có khả năng chịulạnh đối với cà chua biến đổi gen mà không có bất kỳ biến đổi kiểu hình nào [59]

2.5 Chuyển gen ở thực vật

2.5.1 Khái niệm chuyển gen ở thực vật

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ởdạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nóichung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổhợp hoặc gắn và bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổnghợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thểchuyển gen [2]; [4]

Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định tínhkhách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính trạng nhấtđịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền Thông qua chuyển gen,các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển,thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen

2.5.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loạithành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phươngpháp chuyển gen trực tiếp

2.5.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

- Phương pháp chuyển gen nhờ sung bắn gen

- Chuyển gen nhờ silicon carbide

2.5.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ virus

- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năngchuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao tránh được sự hình thành của cáccây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắttiền [4].

Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phươngpháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản saocủa một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần

số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉmang gen ở một số vị trí

Đặc biệt là khi nhược điểm của A.tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá

mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực vàđược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp

chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạp giốngtrên thế giới

2.5.2.3 Đặc điểm và cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Đặc điểm chung của vi khuẩn A.tumefaciens:

A.tumefaciens là loài vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh khối u cho 140 loài cây trồng [28] A.tumefacien là một trong hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá

mầm Việc tạo thành khối u do quá trình tổng hợp amino acid mới và các dẫn xuấtcủa đường được biết chung là opine [27]; [49] Loại opine tổng hợp trong khối u nhưnopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine phụ thuộc vào dòng

Agrobacterium

khởi đầu sự hình thành khối u Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc

từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u Do đó nhiều dòng

A.tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình thành khối u dị hóa một cách có

chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng opine như là một nguồn cacbon vànitơ

Cả việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loạiplasmid có kích thước lớn là Ti-plasmid (Tumour inducing: Ti gây ra khối u) trong

tế bào vi khuẩn A.tumefaciens.

Cấu trúc và chức năng Ti-plasmid

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens, có kích thước khoảng 200-250 kb [48] Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt

người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Kết quả phân tích di

truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc vir (virulence)

liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp

hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium Có hai dòng Ti-plasmid là nopaline và octopine, trong đó kiểu nopanie phổ biến trong các dòng A.tumefaciens.

Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen

ở thực vật Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình

tiếp hợp giữa A.tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương Hiện nay trong

kỹ thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen

cần chuyển vào thực vật Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không

được chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trìnhchuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật [7]

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne

Cấu trúc và chức năng T-DNA

T-DNA là nhân tố chính trong việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thựcvật và hợp nhất với hệ gen nhân Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật làhoàn toàn ngẫu nhiên [26]; [52] Các vùng tương đồng với T-DNA đã được tìm thấy

ở các Ti-plasmid khác nhau Trong các dòng A.tumefaciens kiểu nopaline được sử

dụng phổ biến Vùng T-DNA có kích thước khoảng 24 kb T-DNA được giới hạnbởi đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn khoảng 25 bp gọi là đoạn biên [35] Ở

đoạn biên bên phải (Right Boder - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình

chuyển T-DNA Đoạn biên bên trái (Left Border - LB) gián tiếp tham gia vào quátrình chuyển T-DNA [8]; [22]; [31]

Ở một số khối u kiểu octopine, có hai đoạn không kề nhau đã được tìm thấy

T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u, tạo ra nhiều mRNA polyadenyl Cácloại sản phẩm phiên mã của T-DNA tích lũy lại là tương đối thấp so với các mRNAcủa thực vật [30] Giải trình tự T-DNA kiểu nopaline đã cho thấy có 13 khung đọc

ứng là 8 và 6 Các sản phẩm phiên mã biên phải của T-DNA kiểu nopaline có chức

Ở Ti-plasmid nopaline, các gen opine synthase bao gồm nopaline synthase

hai protein chịu trách nhiệm đối với sự tổng hợp manopine và một sản phẩm củagen xúc tác cho sự biến đổi ngược manopine thành agropin [6]; [27] Ở Ti-plasmid

nopaline vị trí tmr mã hóa một enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin và sự đột

biến ở đây dẫn đến sự tăng sinh rễ từ các khối u đã gây ra ở một số loài Các vị trí

tms 1 và tms 2 liên quan đến sự tổng hợp không điều hòa của auxin và sự đột biến

một trong hai vị trí gây nên sự tăng sinh chồi từ các khối u ở nhiều loại thực vật Vì

vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms 2 và tmr) mà sản phẩm của chúng không

chịu sự điều hòa bình thường của các con đường chuyển hóa thực vật liên quan đến

sự tổng hợp phytohormone Do đó các gen tms 1, tms 2 và tmr được xem là các gen

(vùng gây độc)

Cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens.

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A.tumefaciens phải

tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình này được thực hiện nhờ

các gen chvA và chvB [6] Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển,

định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển 1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất β-1,2 glucan giữ vai trò

β-quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu

không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA [8]; [32]

Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã [38] Trong quá trình này

một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là acetosyringone

[9]; [31] Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện Gen vir A và gen vir C được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen vir C chỉ được phiên mã ở mức độ thấp Khi Agrobacterium

gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc acetosyringone tinh khiết,

sản phẩm của gen vir A sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen vir C Sau đó protein vir C đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C [9]; [49].

Hoạt động của các gen vir sinh ra sợi đơn T-DNA làm xuất hiện bản copy sợi

bên dưới của T-DNA Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) củaT-DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gần vào genome của tế bào

[10]; [51] Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T-DNA Protein vir

D1, D2 đóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái

T-sinh Sau đó, protein vir D2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T- DNA và tế

bào thực vật [12]; [25] Nếu gây đột biến hay loại bỏ đoạn RB thì hầu như mất hoàn

toàn khả năng chuyển DNA, nếu đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển DNA Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T-DNA là từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từđoạn RB và kết thúc ở LB [28]; [49]

T-Phương tiện để chuyển đoạn T-DNA vào nhân tế bào thực vật là phức

protein và sợi T-DNA Phức hợp sợi đơn T-DNA-vir D2 được bao bọc bởi protein vir E2 có trọng lượng 96 kDa Sự phối hợp này giúp ngăn cản sự tấn công của

nuclease, hơn nữa sợi đơn T-DNA duỗi thẳng làm giảm kích thước của phức xuốngxấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền

trên màng tế bào Protein vir E2 chứa đựng hai tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein vir D2 [12]; [25] Thực tế cho thấy hai protein này có vai trò

quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật Nếuloại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong các protein này bị giảm, nhưngkhông ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T-DNA và tương tác giữa T-DNA vớigenome tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác có thể đảm nhận một phần

tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein vir E cần thiết đối với quá trình bài xuất protein vir E2 sang tế bào thực vật [24].

Protein vir D4 cũng là bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T-DNA Chức năng của protein vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết đối

với quá trình di truyền T-DNA [49]

Các nghiên cứu công bố đã nói lên vai trò của operon vir B có kích thước 9,5

kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển phức từ

vi khuẩn sang tế bào thực vật Protein vir B là protein có tính kị nước, giống protein kết hợp trên màng khác Phần lớn protein vir B đã được phát hiện giống như kênh protein xuyên màng Tuy nhiên, cũng có thể vài protein vir B khác được phân phối

lại trong quá trình phát sinh và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận

chuyển Trong đó protein vir B2, vir B11 là hai nhân tố cơ bản của bộ máy vận

chuyển T-DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật Sau khi T-DNA qua màng

tế bào chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và

sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây lên sự phát triển thái quá của hàng loạt tếbào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u

Mô hình mô tả các sự kiện xảy ra ở mức phân tử trong sự tương tác giữa tế

bào thực vật và Agrobacterium để hình thành khối u.

Hình 2.3 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật

và cơ chế chuyển T-DNA

2.5.2.4 Quy trình nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens như sau

Bước 1: Thiết kế vector mang gen.

Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.

Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp vào A.tumerfaciens.

Bước 4: Lây nhiễm A.tumerfaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực

vật để tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích

Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công

Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh

Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được cần đánh giá sự ổn định di truyềnqua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang genmong muốn Đồng thời đánh giá tác động của cây chuyển gen để đưa ra sản xuất vàcung cấp cho thị trường

Sàng lọc cây sau chuyển gen:

Để tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang gen được chuyểnvào, thông thường trong các nghiên cứu đều sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ

sung những chất mà chỉ có tế bào có tính trạng chọn lọc nhất định mới có thể sinhtrưởng được, đó là những gen kháng kháng sinh Các kháng sinh được sử dụng phổbiến để chọn lọc các thể biến nạp plasmid tái tổ hợp là ampicilin, chloramphenicol,gentamixin, kanamycin, rifamicin, spectinomicin, tetracycline Ở hệ biểu hiện lànấm thì gen chỉ thị chọn lọc dựa vào nguồn dinh dưỡng là LEU2, TRP1, URA3,HIS3,… [3]