NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi 1. Đã giải trình tự 11 đoạn gene chứa cả CP và MP của TMV với kích thước đầy đủ của từng gen lần lượt là 480 và 519 bp; và 23 đoạn gene RdRp của TMV với kích thước là 663bp. 2. Thiết kế thành công 2 vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bao gồm 1 vector mang gen đơn đoạn CP của TMV (RNAi TMV) và 1 vector mang gen đa đoạn chứa trình tự gen ghép nối từ 4 virus là TMV, CMV, TYLCV và TSWV (RNAi TCYS).

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Cây thuốc bệnh virus gây hại .4 1.1.1 Giới thiệu thuốc 1.1.2 Bệnh virus hại thuốc 1.2 Giới thiệu công nghệ RNAi 23 1.2.1 Lược sử nghiên cứu .23 1.2.2 Cơ chế hoạt động RNAi thực vật .26 1.2.3 Đặc điểm vai trò chế RNAi 30 1.3 Ứng dụng RNAi tạo chuyển gen kháng virus 31 1.3.1 Ứng dụng RNAi tạo trồng kháng loại virrus 31 1.3.2 Ứng dụng RNAi tạo trồng kháng đa virus 33 1.3.3 Nghiên cứu tạo trồng chuyển gen kháng virus ứng dụng RNAi Việt Nam 33 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Vật liệu nghiên cứu .36 2.1.1 Vật liệu thực vật 36 2.1.2 Chủng khuẩn plasmid .36 2.1.3 Hóa chất .36 2.1.4 Thiết bị 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu .37 2.2.1 Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền virus .37 2.2.2 Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen 40 2.2.3 Các phương pháp chuyển gen vào thuốc 41 2.2.4 Các phương pháp phân tích chuyển gen .43 2.2.5 Các phương pháp đánh giá chất lượng chuyển gen .48 3.1.1 Thu mẫu đánh giá mức độ nhiễm TMV thuốc .51 3.1.2 Kết thiết kế mồi cho phân lập virus từ mẫu bệnh 52 3.1.3 Kết nhân đoạn gen CP, MP, RdRp TMV từ mẫu bệnh .53 3.1.4 Kết nhân dòng gen TMV vào vector tách dòng pBT 54 3.1.5 Kết giải trình tự đoạn gen TMV .56 3.1.6 Phân tích độ đa dạng di truyền gen CP TMV 60 3.1.7 Phân tích độ đa dạng di truyền gen MP TMV .62 3.1.8 Phân tích độ đa dạng di truyền gen RdRp TMV 63 3.2.Thiết kế vector chuyển gen 67 3.2.1 Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc mannose 67 3.2.2 Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV đa gen TMV/CMV/TYLCV/TSWV (TCYS) chọn lọc mannose 71 3.3 Kết chuyển gen vào thuốc 80 3.3.1 Đánh giá hiệu quảchọn lọc mannose đến trình chuyển gen vào thuốc 80 3.3.2 Kết chuyển gen kháng virus vào giống thuốc thông qua A.tumefaciens 86 3.4 Phân tích, đánh giá tính kháng virus chuyển gen 88 3.4.1 Phân tích chuyển gen hệ T0 88 3.4.2 Phân tích phân li gen chuyển đánh giá khả kháng virus dòng thuốc chuyển gen hệ T1 101 3.4.3 Phân tích chuyển gen hệ T2 107 Chương THẢO LUẬN 124 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 135 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 137 SUMMARY 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 141 PHỤ LỤC 149 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Nguyên nghĩa AGO Protein Argonaute ATP Adenosin triphosphat bp Base pair CP Coat protein (protein vỏ) CMV Cucumber mosaic virus DNA Deoxyribonucleic acid Kb Kilobase kDa Kilodalton RNA Ribonucleic acid 10 RNase Ribonuclease 11 TMV Tobacco mosaic virus 12 TSWV Tomato spotted wilt virus 13 TYLCV Tomato yellow leaf curl virus i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc genome TMV 11 Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc genome TSWV .14 Hình 1.3 Con đường làm tắt gen thông qua siRNA 27 Hình 1.4 Con đường ức chế biểu gen thơng qua miRNA 29 Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp đánh giá đa dạng di truyền virus 37 Hình 2.2 Mơ hình thiết kế vector pK7M .40 Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp tạo thuốc chuyển gen 42 Hình 3.1 Hình ảnh mẫu bệnh biểu triệu chứng bệnh khảm thuốc 52 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen MP-CP (A) phần RdRp (B) TMV gel agarose .54 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc dương tính 55 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm tách chiết plasmid tái tổ hợp (A)(Không dùng ảnh này, thay ảnh PCR) sản phẩm cắt enzyme cắt giới hạn Bam HI (B) dòng khuẩn lạc mang pBT/RdRp-TMV 55 Hình 3.5 Hình ảnh tổng hợp số trình tự gene CP TMV số dòng thu thập vùng khác nước (có thể để phụ lục) 59 Hình 3.6 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen CP phân lập mẫu TMV Việt Nam .60 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide gen CP TMV Việt Nam 61 Hình 3.8 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen MP phân lập mẫu TMV Việt Nam .62 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide gen MP TMV Việt Nam .63 Hình 3.10 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen RdRp TMV Việt Nam .64 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng cắt 45 ii Hình 3.11 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen RdRp TMV Việt Nam .66 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I 68 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid pNOV-gusplus 69 Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pNOV-gusplus Pme I Hind III 69 Hình 3.17 Bản đồ cấu trúc vector pK7M 70 Hình 3.18 Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen CP TMV 73 Hình 3.19 Ảnh điện di sản phẩm ghép nối tạo đoạn gen đa đoạn TCYS 74 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang pENTR-TMV 75 Bảng 3.6 Các phân đoạn thu theo tính tốn lý thuyết cắt plasmid pK7M, pK7M-TMV pK7M-TCYS enzyme Xba I Hind III 77 Hình 3.21 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M-TMV (A), pK7M-TCYS (B) enzyme Xba I Hind III 77 Hình 3.22 Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang pK7M-TMV 78 Hình 3.23 Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tách chiết từ A.tumefacien enzyme giới hạn Xba I Hind III 80 Hình 3.24 Ảnh hưởng nồng độ mannose tới khả tạo chồi thuốc 83 Hình 3.25 Hình ảnh rễ thuốc C9-1 tạo môi trường chọn lọc chứa mannose 83 Hình 3.26 Kết điện di sản phẩm PCR gen chuyển từ số dòng thuốc T0 chuyển gen 89 Hình 3.27 Kết điện di sản phẩm PCR gen chuyển số dòng K326 chuyển gen T0 89 iii Hình 3.28 Kết phân tích southern blot thuốc chuyển gen kháng TMV 92 Hình 3.29 Kết phân tích southern blot thuốc chuyển gen TCYS hệ T0 .93 Hình 3.30 Hình ảnh điện di kết RT-PCR kiểm tra số dòng T0 TMV 100 1-6 dòng chuyển gen tương ứng với dòng từ 7-12; (+): đối chứng dương plasmid; WT: thuốc không chuyển gen 100 Hình 3.31 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gen virus thuốc chuyển gene sau lây nhiễm 101 Hình 3.32 Hình ảnh sàng lọc thuốc T1 chuyển gen môi trường chọn lọc mannose 103 Hình 3.33 Kết phân tích southern blot sản phẩm PCR gen chuyển dòng thuốc chuyển gen hệ T1 104 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thơng tin trình tự mồi nhân gen TMV 53 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng trình tự nucleotide gen CP TMV Việt Nam .61 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng trình tự nucleotide gen MP TMV Việt Nam 63 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền múc độ nucleotidee đoạn gen RdRp TMV dòng Việt Nam so với so với giới 65 Bảng 3.5 Danh sách mồi cho thiết kế cấu trúc RNAi 72 Bảng 3.7 Ảnh hưởng mannose tới trình tạo đa chồi giống thuốc K326 81 Bảng 3.8 Ảnh hưởng mannose tới trình tạo đa chồi giống C9-1 81 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ mannose tới trình tạo rễ chồi thuốc thuộc hai giống K326 C9-1 82 Bảng 3.10 Hiệu chọn lọc thuốc chuyển gen sử dụng mannose theo qui trình .84 Bảng 3.11 Hiệu chọn lọc thuốc chuyển gen sử dụng mannose theo qui trình .85 Bảng 3.12 Kết chuyển cấu trúc RNAi TMV TCYS vào thuốc K326 C9-1 87 Bảng 3.13 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gene T0 .89 Bảng 3.14 Kết kiểm tra tính kháng TMV dòng thuốc chuyển cấu trúc RNAi TMV lây nhiễm nhân tạo 95 Bảng 3.15 Kết kiểm tra tính kháng virus dòng thuốc chuyển cấu trúc RNAi TCYS 96 Bảng 3.16 Kết kiểm tra ELISA OD 405 nm dòng thuốc T0 chuyển cấu trúc RNAi TMV sau lây nhiễm TMV 98 Bảng 3.17 Kết kiểm tra ELISA OD 405 nm dòng thuốc T0 chuyển cấu trúc RNAi TCYS sau lây nhiễm TMV CMV .99 v Bảng 3.18 Kết phân li 3:1 gen chọn lọc dòng thuốc chuyển gen hệ T1 môi trường chứa mannose 102 Bảng 3.19 Kết đánh giá tính kháng virus dòng thuốc chuyển gen hệ T1 104 Hình 3.34 Kết lai northern mẫu thuốc chuyển gen (trên) ảnh gel agarose điện di ARN (dưới) với 40µg RNA tổng số mẫu 107 Bảng 3.20 Tỉ lệ nhiễm bệnh dòng thuốc chuyển gen không chuyển gen 109 Bảng 3.21 Tỉ lệ hại số sâu hại dòng thuốc nghiên cứu 111 Bảng 3.22 Tần suất bắt gặp loài thiên địchtrên ruộng thuốc 112 Bảng 3.23 Tần suất bắt gặp lồi cỏ dại ruộng thí nghiệm 112 Bảng 3.24 Tốc độ tăng trưởng số (SL) chiều cao (CC) dòng thuốc thí nghiệm .114 Bảng 3.25 Chiều cao sinh học (cm) chiều cao ngắt (cm) dòng thuốc thí nghiệm .115 Bảng 3.26 Các yếu tố cấu thành suất dòng thuốc thí nghiệm 116 Bảng 3.27 Diện tích (dm2) cường độ quang hợp (mg chất khơ/dm2/h) dòng thuốc thí nghiệm .118 Bảng 3.28 Hàm lượng diệp lục (mg/g tươi) dòng thuốc thí nghiệm 120 Bảng 3.29 Hàm lượng đường khử (mg/g) axit hữu tổng số (%) dòng thuốc thí nghiệm .122 Bảng 3.30 Hàm lượng nitơ tổng số (%) protein (%) có dòng thuốc thí nghiệm 123 vi MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Thuốc (Nicotiana tabacum L.) công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia giới Việc trồng sản xuất thuốc thu hút nhiều nhân cơng, góp phần tạo cơng ăn việc làm thu nhập cho nhiều đối tượng lao động Khơng để sản xuất thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Ngoài ra, thuốc xem mơ hình cho nhiều nghiên cứu sinh học nghiên cứu trình trao đổi chất thực vật, hay vai trò, chức gen protein,… Với khả dễ tái sinh chấp nhận gen ngoại lai, thuốc mơ hình cho nghiên cứu mang tính ứng dụng sản xuất vacine thực vật hay dược liệu, làm nguồn nhiên liệu sinh học thay Tuy nhiên, với đặc điểm sinh học mình, thuốc trồng mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt bệnh virus gây nên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất chất lượng thuốc Trong đó, số loại virus gây hại phổ biến kể đến là: TMV (Tobacco mosaic virus) TSWV (Tomato spotted wilt virus), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Cucumber mosaic virus (CMV) Khi nhiễm virus, thiệt hại suất lên tới 95-100% Cho đến chưa có loại thuốc bảo vệ thực vật có khả chống lại bệnh virus gây trồng Con người hạn chế tác hại virus kiểm sốt mức độ định thông qua số biện pháp thông dụng sử dụng giống kháng bệnh, giống bệnh, biện pháp canh tác,… Song biện pháp mang tính chất phòng trừ, đòi hỏi nhiều thời gian công sức, hiệu kinh tế thấp Hiện nay, với tiến lĩnh vực sinh học, người ta tạo số loại trồng kháng bệnh virus gây thông qua biện pháp tạo trồng chuyển gen mang gen đoạn gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh (Reddy el al., 2009) Cho tới năm cuối kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi xem kỹ thuật đại hữu hiệu việc chống lại bệnh virus gây thực vật Bên cạnh đó, việc thay gen chọn lọc gây nên lo lắng độ an toàn với sức khỏe người môi trường gen kháng lại kháng sinh hygromycin (hpt) kanamycin (nptII) kháng lại chất diệt cỏ phosphinothricin (bar) chlorosulfuron (als) hệ gen chọn lọc tích 1 Các dòng thuốc chuyển gene kháng virus thử nghiệm mơ hình nhà lưới, quy mô nhỏ, cần phải thử nghiệm trồng quy mô lớn hơn, nơi thường xuyên xảy dịch bệnh virus Lúc khẳng định thêm tính kháng ảnh hưởng sinh vật khác mơi trường Tiếp tục phân tích đánh giá tính kháng virus dòng chuyển gen hệ NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133 Phạm Thị Vân, Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thị Thủy, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2012) Đánh giá thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm TMV hệ T1 Hội nghị Nghiên cứu Giảng dạy sinh học Việt Nam: 794-800 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Vân, Lê Văn Sơn (2013) Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với mơi trường Tạp chí Sinh học 35(3se): 188-194 Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thị Thủy, Nguyễn Văn Đoài, Phạm Thị Vân, Chu Hoang Hà, Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá ổn định tính kháng số loại virus dòng thuốc chuyển gen đa đoạn Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam, 2: 34-41 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thái Hà, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Văn Đoài, Phạm Thị Vân, Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá tính kháng virus, khả sinh trưởng tiêu hóa sinh số dòng thuốc chuyển gen hệ T1 Tạp chí Khoa học-ĐHQG, 30(1S): 226-234 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2014) Tạo thuốc mang gen đa đoạn kháng virus TMV, CMV, TYLCV TSWV kĩthuật RNAi Tạp chí Khoa học ĐHQGHN 30(3): 58-67 SUMMARY 1.Thesis title: 134 Evaluation virus resistant ability of transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) containing RNAi construct 2.Objective 1) To obtain CP gene of pathogenic strain of Tobacco mosaic virus-TMV for designing structural RNAi transformation vector 2) To construct RNAi vectors carrying single gene of TMV or multi-fragment of multiple virus (Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic virus-CMV, Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV and Tomato spotted wilt virusTSWV) 3) To develop transgenic lines of tobacco resistant to virus 3.Contents 1) Surveying and sampling TMV-infected tobacco in 15 provinces in Vietnam Detection of the presence of TMV in the samples by PCR Cloning and sequence analyzing a coat protein gene Analysis of diverdity and genetic clustering of collected virus trains based on CP gene 2) Constructing vector carrying RNAi structures: single structure that carrying the CP gene of TMV and a structure that carrying partially functional gene of four harmful tobacco viruses in Vietnam which are TMV, CMV, TYLCV and TSWV Both RNAi contruct contain manA that encodes phosphomannose isomerase enzyme allowing using mannose for selection 3) Evaluating inhibition ability of mannose on tobacco regeneration was assessed through three stages: creating multi-shoot, elongating shoot, and rooting of such tobacco cultivars as K326 and C9-1 4) Transforming RNAi constructs into two Nicotiana tabacum cv K326 and C9-1 via Agrobacterium tumefaciens 5) Detection of the presence of the transgene in the regenerated plants by the PCR reaction 6) Testing the resistance of the transgenic plants in greenhouse and garden experiment 135 7) Evaluation biosafe, growth and biochemical parameter of transgenic tobacco lines at T2 generation Results 1) 186 samples of leaves of tobacco mosaic disease in 15 provinces in Vietnam have been surveyed and collected Analysis genetic diversity of TMV genome Having sequenced 11 gene fragment containing both CP and MP of TMV with full size of each gene were 480 and 519 bp; and 23 fragment RdRp of TMV RdRp with size is 663bp 2) Having designed binary carrying construct with inverted repeat transgene cassette , containing patial coat protein gene sequence of TMV and multifragment TCYS flanked by an intron 3) Identified mannose concentrations at 30 g/l and 20 g/l are suitable for creating multi-shoot of K326 and C9-1, respectively In addition, mannose concentration at 30 g/l in combination with 7,5 g/l sucrose is fit for elongating shoot while its concentration at 30 g/l is appropriate for rooting transgenic tobacco in both K326 and C9-1 cultivars The mannose selection of transgenic tobacco using gus gene showed that the transgenic effectiveness is ranging 16-17% of K326 and 9-11% of C9-1 cultivars 4) Two constructs RNAi TMV and RNAi TCYS were transformed into tobacco (cv K326 and C9-1) via A tumefaciens PCR Analysis of CP and TCYS transgenic K326 lines which regeneration on mannose selective medium using primers revealed 20 and 28 positive lines The corresponding results at transgenic C9-1 lines are 10 and 20 lines 5) The rate of resistance to TMV obtained at T0 of cultivar K326 and C9-1 respectively 70.83% and 70% Broad-spectrum antiviral ratio is 5/28 K326 lines and 2/20 C9-1 transgenic lines The rate of generation of antiviral T1 ranged from 5-20% 6) The results of biosafety, productivity and quality evaluation of transgenic tobacco lines at T2 generation showed that both two transgenes structures 136 not affect the appearance of the pests, natural enemies , weed; The existence of the transgene structure does not alter the growth and normal development of the tobacco lines carrying transgenes TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 137 Vũ Thị Bản, Tào Ngọc Tuấn (2005) Kết nghiên cứu chọn tạo số giống thuốc vàng sấy Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá, Kết nghiên cứu khoa học 2001-2005, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nơng nghiệp: 40-46 Nguyễn Ngọc Bích Bùi Cách Tuyến (2005) Kết điều tra theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc phía Nam, Kết nghiên cứu khoa học 20012005, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 85-89 Nguyễn Văn Biếu, Nguyễn Văn Vân, Vương Chí Hiếu (2001) Thành phần sâu bệnh hại thuốc tỉnh phía Bắc Việt Nam, Kết nghiên cứu khoa học 1996 - 2000, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 7077 Nguyễn Mạnh Chinh, Nguyễn Đăng Nghĩa (2007) Trồng, chăm sóc phòng trừ sâu bệnh thuốc Nxb Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Hà Viết Cường (2012) Bài giảng Virus thực vật, phytoplasma viroid Nxb Đại học Nông nghiệp Đỗ Đình Dũng, Đào Đức Thức, Nguyễn Hồng Thái, Ngơ Văn Dư (2013) Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh khảm TMV, Kết nghiên cứu khoa học 2005 - 2010, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc Nxb Nông nghiệp: 34-42 Đỗ Tấn Dũng, Hà Viết Cường, Trần Nguyễn Hà (2012) Giáo trình Miễn dịch thực vật Nxb Đại học Nông nghiệp Ngơ Mạnh Dũng, Chu Hồng Hà, Lê Văn Sơn (2014) Tách dòng xác định trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) virus gây bệnh xanh lùn (CLRDV) bơng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 119(05): 151-155 Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Nguyễn Thị Thanh Hảo, Chu Hoàng Hà (2015) Nghiên cứu chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium tumefaciens vào Dendrobium Sonia để tạo giống kháng virus khảm vàng Tạp chí Khoa học Phát triển 13(2): 264-271 138 10 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010) Kết bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIA(c) vào phơi non dòng ngơ mơ hình Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(2): 173-180 11 Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011) Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam: 316326 12 Trần Thị Hồng Hà, Lưu Văn Chính, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương (2013) Đánh giá hoạt tính sinh học polysaccharide hợp chất tách chiết từ nấm hương (Lentinus edodes) Tạp chí Sinh học 35(4): 445-453 13 Lê Huy Hàm, Phạm Thị Lý Thu (2014) Hệ thống quản lý an toàn sinh học trồng biến đổi gen Nxb Hà Nội 14 Tran Thi Cuc Hoa (2007) Assessment of the inhibition ability of mannose on soybean seed germination, shoot elongation and rooting for the establishment of a mannose selection system in soybean transformation Omorice 15: 2128 15 Trần Thị Cúc Hòa, Bùi Bá Bổng (2003) Hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens lúa (Oryza sativa L.) sử dụng hệ thống chọn lọc mannose Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn 1+2: 60-63 16 Trần Đình Kiên (2011) Giáo trình Cây thuốc Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 17 Trần Đăng Kiên, Lê Việt Hùng, Hoàng Tự Lập, Tào Ngọc Tuấn, Đinh Văn Năng (2013) Hồn thiện qui trình cơng nghệ sản xuất hai giống thuốc lai VTL1H, VTL5H Cao Bằng Lạng Sơn, Kết nghiên cứu khoa học 2005 - 2010, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc Nxb Nông nghiệp: 720 18 Phạm Văn Lầm (2005) Kỹ thuật bảo vệ thực vật Nxb Lao động 139 19 Hoàng Tự Lập, Nguyễn Hồng Quân, Kiều Văn Tuyển (2013) Sản xuất thử nghiệm giống thuốc VTL6H, VTL81 Cao Bằng, Lạng Sơn, Kết nghiên cứu khoa học 1986 - 1996, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 20-34 20 Vũ Triệu Mân (2007) Bệnh chuyên khoa Nxb Đại học Nông nghiệp Hà Nội 21 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998) Giáo trình Bệnh nơng nghiệp Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 22 Đinh Văn Năng, Nguyễn Văn Cường, Mai Thu Hà, Vũ Minh Tân (2013) Xây dựng hoàn thiện qui trình kỹ thuật sản xuất thuốc theo phương pháp khay lỗ tỉnh phía Bắc, Nghiên cứu sử dụng số mùn hữu làm giá thể phân bón sản xuất thuốc nguyên liệu Kết nghiên cứu khoa học 2010-2013, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá: 117-130 23 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh (2011) Cây trồng cơng nghệ sinh học: Đánh giá an tồn môi trường sức khỏe người Nxb Hà Nội 24 Lò Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hồng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen kháng Soybean mosaic virus Bean yellow mosaic virus Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 118(04): 111115 25 Bùi Thanh Tùng, Hồng Minh Tấn, Nguyễn Đình Vinh (2013) Ảnh hưởng accotab đến khả diệt chồi, sinh trưởng, phát triển suất thuốc lào trồng Hải Phòng Tạp chí Khoa học Phát triển 11(4): 501505 26 Nguyễn Văn Vân (2014) Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nông sinh học đến sinh trưởng hoa giống thuốc K.326 trồng miền Bắc Việt Nam Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Đại học Nông nghiệp Hà Nội 27 Phạm Thị Vân (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(4A): 679-687 140 28 Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2009a) Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 241-249 29 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2009b) Xác định virus khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus-CMV) thuốc Cao Bằng Hà Tây thơng qua tách dòng giải trình tự gen mã hóa protein MP CP Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 47(3): 1-7 30 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265-275 31 Đào Thị Xuân, Vũ Minh Tân, Nguyễn Xuân Toản (2012) Triển vọng dòng thuốc vàng sấy TL16 qua kết khảo nghiệm sản xuất vùng thuốc nguyên liệu phía Bắc Tạp chí Khoa học công nghệ, Bộ Công thương 12: 32-34 32 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2008) Phân lập gen mã hóa protrein vỏ virus gây bệnh xoăn vàng cà chua thu thập cà chua dại tỉnh Thái Ngun Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(4): 467-474 33 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng mậu, Lê Trần Bình (2009) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus gây bệnh xoăn cà chua Báo cáo hội nghị tồn quốc Cơng nghệ sinh học: 544-549 34 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2011) Tạo dòng cà chua P18 kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học 9(3): 333-340 35 Nguyễn Thị Hải Yến (2012) Nghiên cứu tạo cà chua kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật chuyển gen Luận án Tiến sĩ Sinh học Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 141 36 Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V and Sundaresan V (2005) Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana Geneome Res 15: 78-91 37 Ahmad M, Arif MI, Ahmad Z, Denholm I (2002) Cotton whitefly (Bemisia tabaci) resistance to organophosphate and pyrethroid insecticides in Pakistan Pest Manag Sci 58(2): 203-208 38 Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T (2003) A uniform system for microRNA annotation RNA 9(3): 277-279 39 Andika IB, Kondo H, and Tamada T (2005) Evidence that RNA silencingmediated resistance to beet necrotic yellow vein virus is less effective in roots than in leaves Mol Plant Microbe Interact 18: 194-204 40 Babitha KC, Vemanna RS, Nataraja KN, Udayakumar M (2015) Overexpression of EcbHLH57 Transcription Factor from Eleusine coracana L in Tobacco Confers Tolerance to Salt, Oxidative and Drought Stress PLoS One 10(9): e0137098 doi: 10.1371/journal.pone.0137098 41 Bahariah B, Parveez GK, Masani MY, Khalid N (2012) Construction of phosphomannose isomerase (PMI) transformation vectors and evaluation of the effectiveness of vectors in tobacco (Nicotiana tabacum L) Bioinformation 8(3): 151-157 42 Bakshi S, Saha B, Roy NK, Mishra S, Panda SK, Sahoo L (2012) Successful recovery of transgenic cowpea (Vigna unguiculata) using the 6phosphomannose isomerase gene as the selectable marker Plant Cell Rep 31(6): 1093-1103 43 Ballester A, Cervera M, Pena L (2008) Evaluation of selection strategies alternative to nptII in genetic transformation of citrus Plant Cell Rep 27: 1005-1015 44 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431: 356-363 142 45 Beachy RN, Loesch-Fries S, Tumer NE (1990) Coat protein-mediated resistance against virus infection Annu Rev Phytopathol 28: 451-474 46 Berlinger MJ, Taylor RA, Lebiush-Mordechi S, Shalhevet S, Spharim I (2002) Efficiency of insect exclusion screens for preventing whitefly transmission of tomato yellow leaf curl virus of tomatoes in Israel Bull Entomol Res 92(5): 367-373 47 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference Nature 409: 295-296 48 Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAimediated resistance to Bean golden mosaic virus in geneetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris) Mol Plant Microbe Interact 20(6): 717726 49 Bonnet J, Faile A, Malpica JM, García-Arenal F (2005) Role of recombination in the evolution of natural populations of Cucumber mosaic virus, a tripartite RNA plant virus Virology 33: 359-368 50 Braun CJ, Hemenway CL (1992) Expression of amino-terminal portions or full-length viral replicase genees in transgeneic plants confers resistance to potato virus X infection Plant Cell 4: 735-744 51 Brigneti GO, Voinnet WX, Li LH, Ji SW, Ding, and Baulcombe DC (1998) Viral pathogeneicity determinants are suppressors of transgenee silencing in Nicotiana benthaniana EMBL J 17: 6739-6746 52 Bríza J, Růzicková N, Niedermeierová H, Dusbábková J, Vlasák J (2010) Phosphomannose isomerase gene for selection in lettuce (Lactuca sativa L.) transformation Acta Biochim Pol 57(1): 63-68 53 Bucher E, Lohius D, van Poppel PM, Geerts-Dimitriadou C, Gold-bach R, and Prins M (2006) Multiple virus resistance at a high frequency using a single transgene construct J Gen Virol 87: 697-701 143 54 Buck AH and Blaxter M (2013) Functional diversification of Argonautes in nematodes: an expanding universe Biochem Soc Trans 41(4): 881-886 55 Burgyán J and Havelda Z (2011) Viral suppressors of RNA silencing Trends Plant Sci 16(5): 265-272 56 Callaway A, Giesman-Cookmeyer D, Gillok ET, Sit TL, Lommel SA (2001) The multifunctional capsid proteins of plant RNA virus Annu Rev Phytopatho 39: 419-460 57 Carr JP, Beachy RN, Klessig DF (1989) Are the PR1 proteins of tobacco involved in genetically engineered resistance to TMV? Virology 169(2): 470-473 58 Chen D, Ren Y, Deng Y, Zhao J (2010) Auxin polar transport is essential for the development of zygote and embryo in Nicotiana tabacum L and correlated with ABP1 and PM H+-ATPase activities J Exp Bot 61(6): 18531867 59 Chen J, Chen H, Hu H (1998) Selection of ningnanmycin overproduction strains by resistance of self-secondary metabolites Wei Sheng Wu Xue Bao 38(6): 484-486 60 Collmer CH, Vogt VM, Zaitlin M (1983) H protein, a minor protein of TMV virions, contains sequences of the viral coat protein Virology 126(2): 429448 61 Covey S, Al-Kaff N, Lãingara A and Turner D (1997) Plants combat infection by genee silencing Nature 385: 781-782 62 Cuellar W, Gaudin A, Solorzano D, Casas A, Nopo L, Chudalayandi P, Medrano G, Kreuze J and Ghislain M (2006) Self-excision of the antibiotic resistance gene nptII using a heat inducible Cre-loxP system from transgenic potato Plant Mol Biol 62: 71-82 63 Czech B and Hannon GJ (2011) Small RNA sorting: matchmaking for Argonautes Nat Rev Genet 12: 19-31 144 64 Darwish M, Lopez-Lauri F, Vidal V, El Maâtaoui M, Sallanon H (2015) Alternation of light/dark period priming enhances clomazone tolerance by increasing the levels of ascorbate and phenolic compounds and ROS detoxification in tobacco (Nicotiana tabacum L.) plantlets J Photochem Photobiol B 148: 9-20 65 Daryl, Bowman T and Sisson V (2000) A historical overview of flue-cured Tobacco Breeding in The USA Tobacco Science 44: 59-64 66 De Block M and Debrouwer D (1991) Two T-DNA’s co-transformed into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infection are mainly integrated at the same locus Theor Appl Genet 82: 257-263 67 Degenhardt J, Poppe A, Montag J, Szankowski I (2006) The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plants Plant Cell Rep 25(11): 1149-1156 PHỤ LỤC 145 Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy thuốc in vitro Loại môi trường Thành phần Nảy mầm hạt (MS) MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Cảm ứng tạo chồi MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 (GM1) Bổ sung box: mg/l BAP Cảm ứng tạo chồi (GM2) MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Ra rễ (RM1) Ra rễ (RM2) Bổ sung box: mg/l BAP + 400 mg/l cefotaxime MS (I-V) + 30 mg/l mannose + g/l agar, pH = 5,8 Bổ sung box: 0,1 mg/l IBA + 250 mg/l cefotaxime MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Bổ sung box: 0,1 mg/l IBA + 250 mg/l cefotaxime Phụ lục Thành phần môi trường nuôi khuẩn Môi trường Thành phần LB đặc g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l bacto agar, pH = 7,0 LB lỏng g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = 7,0 ½ MS lỏng ½ MS (I-V) + 30 g/l sucrose, pH = 5,8 146 ... Nghiên cứu khả kháng bệnh virus thuốc (Nicotiana tabacum L.) chuyển gen mang cấu trúc RNAi Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1) Phân lập, đánh giá đa dạng di truyền TMV, xác định trình tự bảo thủ gen. .. vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi 2) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi mang gen đơn đoạn TMV gen đa đoạn chứa trình tự gen đồng thời virus TMV, CMV, TYLCV TSWV 3) Tạo dòng thuốc chuyển. .. chuyển gen kháng đơn virus kháng virus phổ rộng 4) Đánh giá khả kháng virus, mức độ an toàn sinh học, khả sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen Nội dung nghiên cứu 1) Khảo sát, thu thập mẫu thuốc