Phân lập đoạn gen CP từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

1. Đặt vấn đềĐậu tương (Glycine max(L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệpvà có tác dụngcải tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa caodo mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễbị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá(Soybean mosaic virus –SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –BYMV) vàmột sốvirus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớnnhất đến cây đậu tương.SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ dorệp là môi giớivàvirus có thểtruyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm pháttriển, số lượng quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương. Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoavà 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém 87. Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt 95.Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trênthường có hiệu quả 2thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loàiSMV và BYMV là sử dụngcác giống đậu tương kháng bệnh, nhưngnguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi trong chiến lược tạo cây chuyểngen kháng virus 3, 31, 98.Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôitiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế, dinh dưỡng cao, nguyên liệu cho cơng nghiệp có tác dụng cải tạo đất trồng bảo vệ môi trường Hiện nay, suất sản lượng đậu tương nước ta thấp, chất lượng hạt chưa cao mức độ ổn định giống, ảnh hưởng nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, virus gây bệnh khảm (Soybean mosaic virus – SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus – BYMV) số virus gây bệnh khác Trong đó, SMV BYMV loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn đến đậu tương SMV BYMV lây nhiễm từ bệnh sang khoẻ rệp môi giới virus truyền qua hạt Khi đậu tương bị bệnh, có phần xanh nhạt, đậm biến vàng xen kẽ, non bị biến dạng, đọt non xoăn lại, đốt thân co ngắn, chậm phát triển, số lượng biến dạng, sần sùi, có vị đắng thường lép Bệnh khảm SMV BYMV gây thiệt hại đáng kể suất, chất lượng sản lượng hạt đậu tương Năng suất đậu tương giảm tới 40% bị nhiễm virus trước hoa 91% hạt đậu thu có vết lốm đốm, chất lượng [87] Việc nhiễm lúc nhiều loại virus khác gây thiệt hại lớn suất chất lượng hạt [95] Hiện nay, sản xuất đậu tương chủ yếu dừng biện pháp phịng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm SMV BYMV Do biện pháp phịng bệnh bao gồm chọn lọc bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh trồng, thu dọn tàn dư bệnh đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh Tuy nhiên, biện pháp thường có hiệu thấp tốn nhiều cơng sức Biện pháp có hiệu để phịng hai lồi SMV BYMV sử dụng giống đậu tương kháng bệnh, nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên SMV BYMV hạn chế Chính hướng tiếp cận tạo đậu tương chuyển gen kháng virus quan tâm nghiên cứu, chuyển gen có nguồn gốc từ lồi virus gây bệnh theo nguyên lý kỹ thuật RNA interference (RNAi) RNAi xem kỹ thuật đại có hiệu ứng dụng để kháng lại loài virus gây bệnh thực vật Dựa nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, số tác giả ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi chiến lược tạo chuyển gen kháng virus [3], [31], [98] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo đậu tương chuyển gen kháng bệnh” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Tạo dòng chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm đậu tương kỹ thuật RNAi 2.2 Mục tiêu cụ thể (i) Xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm đậu tương Việt Nam (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV (iii) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng SMV BYMV cao đối chứng không chuyển gen; (iv) Tạo đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin hệ gen gen CP SMV, thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen CP, tách dịng xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV Phân tích đa dạng trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn gen CP phân lập từ SMV Việt Nam số trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế 3.2 Phân tích tương đồng gen CP hệ gen SMV BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác Xác định đoạn bảo thủ gen CP tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin gen CP 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV kỹ thuật Gateway Biến nạp vector chuyển gen mang đoạn gen CPi thiết kế vào A tumefaciens 3.4 Biến nạp cấu trúc RNAi vào thuốc Phân tích có mặt đoạn gen CPi hai lồi SMV BYMV thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Đánh giá tính kháng SMV BYMV chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen 3.5 Chuyển cấu trúc RNAi vào đậu tương thơng qua A tumefaciens Phân tích, xác định có mặt đoạn gen chuyển CPi đậu tương chuyển gen Những đóng góp luận án 4.1 Phân lập đoạn gen CP từ SMV dịng SL1 SL2 có kích thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid Hai trình tự đoạn gen CP SMV đăng ký Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103 4.2 Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng đơn lồi SMV khả kháng đồng thời hai loài SMV BYMV 4.3 Tạo 19 dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng hai lồi SMV BYMV 4.4 Chuyển thành cơng cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 DT2008, thu dòng chuyển gen từ giống ĐT12 19 dòng chuyển gen từ giống DT2008 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Về khoa học Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV kháng đồng thời hai loài SMV, BYMV để tạo thuốc chuyển gen có tính kháng SMV BYMV cao đối chứng không chuyển gen khẳng định sở khoa học tính hiệu biện pháp sử dụng gen có nguồn gốc từ lồi virus gây bệnh để chuyển vào trồng nhằm tạo chuyển gen kháng virus theo nguyên lý kỹ thuật RNAi 5.2 Về thực tiễn Kết lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương tổn thương tái sinh thành công đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV BYMV cho thấy khả ứng dụng kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật RNAi chọn tạo giống đậu tương Việt Nam Kết thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi SMV BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo chuyển gen thuốc đậu tương khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi mở triển vọng ứng dụng thực tiễn chọn giống trồng Việt Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương bệnh virus đậu tương Cây đậu tương có tên khoa học Glycine max (L.) Merill (2n = 40) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) Đậu tương loại trồng quan trọng giá trị dinh dưỡng giá trị cải tạo đất Hạt đậu tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid chứa nhiều chất quan trọng cho hoạt động sinh lý thể người động vật, như: isoflavone, lecithin, tocopherol saponin Thêm hạt đậu tương chứa nhiều protein chức nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trị chăm sóc bảo vệ sức khỏe người [149], [158] Các sản phẩm từ đậu tương tăng lên đáng kể so với loại trồng khác nhu cầu protein dầu [82] Cây đậu tương trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt thuộc nhóm hàng năm Rễ đậu tương loại rễ cọc, gồm rễ rễ bên Rễ tập trung tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả cố định đạm [1] Thân đậu tương phân cành, thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều lơng, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có dạng bò hay nửa bò Cành đậu tương mọc từ đốt thân, đốt thân mang hai mầm, đốt thứ hai mang hai đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên đốt mang kép Đậu tương tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa phát sinh từ nách lá, đầu cành đầu thân Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, có màu tím hay trắng, thời kỳ hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống thời vụ gieo chịu ảnh hưởng phối hợp ánh sáng nhiệt độ [1], [2] Quả đậu tương loại ráp, bên ngồi vỏ thường có lớp lơng bao phủ, màu sắc vỏ chín có màu vàng xám đen Quả thẳng cong Mỗi thường có từ - hạt phổ biến hạt Hạt đậu tương có nhiều hình dạng bầu dục, tròn dài, tròn dẹt Vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g Hình dạng màu sắc rốn hạt dấu hiệu đặc trưng cho giống đậu tương [1], [2] Với giá trị kinh tế giá trị sử dụng, đậu tương xem loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới, với vị trí đứng thứ tư sau lúa, ngô lúa mỳ Ở Việt Nam, đậu tương trồng từ lâu nhu cầu tiêu thụ đậu tương lớn, nên sản xuất đậu tương nước trọng, diện tích gieo trồng tăng lên đáng kể Đậu tương trồng vùng nông nghiệp, 28 tỉnh thành khắp nước, 70% miền Bắc 30% miền Nam Cây đậu tương nước ta trồng chủ yếu vùng cao, nơi đất không cần màu mỡ (khoảng 65%) 35% trồng vùng đất thấp, khu vực đồng sông Hồng Theo số liệu Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng, suất sản lượng đậu tương khơng có tăng đáng kể so với năm trước Nguồn giống đậu tương kháng bệnh chống chịu cao nguyên nhân giải thích cho phát triển chậm ngành sản xuất đậu tương nước ta Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh đậu tương cách tiếp cận mới, có hiệu ngành chọn giống đậu tương Cây đậu tương mắc số bệnh vi khuẩn, nấm virus, bệnh khảm SMV BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani Fusarium solani fsp Phaseoly, bệnh đốm vi khuẩn hại đậu tương số bệnh hại khác Thống kê giới cho thấy có 100 loại virus gây hại đậu tương Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp gây thiệt hại lớn đến suất chất lượng sản phẩm Tại nơi bị nhiễm bệnh nặng, suất bị giảm đến 50% ngồi đồng, mức giảm lên đến 93% - 95% điều kiện lây nhiễm thí nghiệm [17] Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn bệnh virus đậu tương, vùng Georgia Mỹ (37%), Australia Thái lan (60%), New Zealand khu vực Bắc Mỹ (4050%) [28], [80], [158] Bệnh khảm đậu tương virus nhóm khảm (Potyvirus) gây Bệnh phát lần Mỹ vào năm 1900 đến virus khảm đậu tương có mặt hầu hết vùng trồng đậu tương giới [80] Việt Nam công bố phát loại virus từ năm 1994, chủ yếu tập trung vùng trồng đậu tương lớn, khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng Bằng Sông Hồng Tây Nguyên [1], [12] Các nhà khoa học xác định có số lồi virus đặc biệt nguy hiểm, gây hại đậu tương, có SMV BYMV [17], [73] SMV lồi virus gây bệnh khảm đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ Potyviridae, virus chủ yếu gây bệnh đậu tương, bệnh xảy toàn giới [44] SMV gây thiệt hại đáng kể suất, chí số trường hợp tổn thất lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương Những đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, bị biến dạng, bị nhiễm giai đoạn muộn làm giảm sản lượng chất lượng hạt [85] [86] Họ Potyviridae biết đến có số lượng loài lớn loài virus gây bệnh thực vật Nếu nhiễm Potyvirus loài virus khác thiệt hại suất chất lượng hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145] Những bị nhiễm Potyvirus dễ bị nhiễm nấm gây bệnh [145] SMV lây nhiễm qua hạt với tỷ lệ trung bình 10% thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật thời gian bị nhiễm [104] Phản ứng khác biệt giống sức đề kháng với SMV biểu tượng đậu tương mẫn cảm với bệnh khảm khảm hệ thống (S), chết hoại (N), khơng có triệu chứng kháng (R) Quan sát Cho Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành nhóm, chủng SMV từ G1 đến G7 [49] BYMV lồi virus thuộc nhóm Potyvirus, tìm thấy thuộc họ đậu đỗ (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, …) số loài thực vật khác [28], [80] Khi đậu tương nhiễm BYMV xuất vết khảm đường biến vàng ngoằn ngoèo bề mặt lá, làm không phát triển dẫn tới bị chết Bệnh khảm vàng BYMV gây thiệt hại đáng kể suất chất lượng hạt, đặc biệt đậu đỗ, có đậu tương [137] Khi bị nhiễm BYMV, suất hạt đậu tương bị giảm, số trường hợp giảm tới 74% - 80% [96] Đối với đậu tương, SMV BYMV nhiễm đồng thời triệu chứng khó phân biệt Ảnh hưởng việc nhiễm lúc nhiều loại virus khác dẫn tới suất đậu tương bị giảm từ 66% - 80% [80], [91] Bằng quan sát thực địa nhóm tác giả Ukraine xác định triệu chứng nhiễm hai loại SMV BYMV đậu tương vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev kết xác nhận kính hiển vi điện tử kỹ thuật ELISA [103] Trên sở phân tích gen thiết lập phát sinh lồi số tác giả cho BYMV phân lập từ vùng thuộc Cộng hòa Séc phân bố ba nhóm sơ đồ hình khơng phụ thuộc vào chủ [142] Phản ứng đậu tương SMV BYMV phụ thuộc vào kiểu gen giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, nhiệt độ khơng khí điều kiện mơi trường khác [41] 1.1.2 Sự xâm nhập SMV BYMV vào tế bào đậu tương SMV BYMV xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương xâm nhiễm qua mơi giới trung gian rệp Virus thể trùng có mối quan hệ sinh học với nhau, virus tiềm ẩn thời gian dài thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành ruột vào máu trở lại tuyến nước bọt Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus nhân lên thể côn trùng thời điểm trùng có khả truyền bệnh cách nhanh chóng Tuy nhiên khả truyền bệnh trùng có hạn chế tuổi trùng thường ngắn [12], [13] SMV có khả xâm nhập vào tế bào qua vết thương nhẹ cọ xát với nhau, cịn truyền bệnh trường hợp hạt phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn SMV di chuyển tế bào chất di chuyển sang tế bào khác thông qua sợi liên bào Sau ngày virus nhiễm hết đơn, sau ngày nhiễm hết đoạn gân kép phần đoạn thân sát gốc [80], [145] Sau ngày virus nhiễm hết dọc thân ngọn, khoảng sau 25 ngày virus nhiễm tồn Virus nhiễm qua nhân giống vơ tính, qua hạt giống, qua phấn hoa, qua côn trùng [108] Cách thức truyền virus gây bệnh qua trung gian làm cho đậu tương có khả nhiễm bệnh cao, trưởng thành bị nhiễm virus từ 90 - 100% mức độ biểu bệnh khác [80], [161] SMV BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần protein (60 - 95%) nucleic acid (5 - 40%) [80], [91] Hệ gen SMV BYMV RNA sợi đơn dương (RNA (+)) Đời sống Potyvirus sau xâm nhập vào tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm trình dịch mã, xử lý polyprotein, nhân lên mRNA, trình lắp ráp RNA protein vỏ thành hạt virus di chuyển đến tế bào khác, tới phận khác [145] Quá trình xâm nhiễm SMV BYMV với q trình nhân lên RNA mơ tả hình 1.1 10 Hình 1.1 Sơ đồ mơ trình xâm nhiễm nhân lên SMV BYMV vào tế bào đậu tương Virus xâm nhập vào tế bào qua màng; Phân tử RNA (+) virus giải phóng vào nhân tế bào chủ; RNA (+) virus làm khuôn để tổng hợp sợi RNA(-); RNA (-) phiên mã tổng hợp mRNA; mRNA dịch mã tạo protein virus; RNA(-) làm khuôn tổng hợp RNA (+) tức hệ gen virus; Các phân tử RNA(+) kết hợp với protein vỏ tạo thành virus mới; Virus phá vỡ màng tế bào xâm nhiễm vào tế bào khác 1.1.3 Hệ gen SMV BYMV 1.1.3.1 Đặc điểm hệ gen SMV, BYMV Potyvirus Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm đường kính 11-15 nm bao gồm protein vỏ xếp đối xứng, xoắn ốc xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương có khoảng 10.000 nucleotide Hệ gen RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A protein virion kết nối gen (VPg) đầu 5’ RNA virus dịch mã tạo polyprotein phân cắt protease tạo thành 10 phân tử protein [93] Các gen hệ gen virus sử dụng ngày nhiều để phân tích lồi virus chủng virus khác Jayaram đtg (1992) 114 engineered common bean (Phaseolus vulgaris)”, Mol Plant Microbe Interact, 20, pp 717 – 726 40 Bousalem M., Douzery E J P., Fargette D (2000), “High genetic diversity, distant phylogenetic relationships and intraspecies recom bination events among natural populations of Yam mosaic virus: a contribution to understanding potyvirus evolution”, J Gen Virol., 81, pp 243-255 41 Bowers G R., Goodman R M (1979), “Soybean mosaic virus: Infection of soybean seed parts and seed transmission”, Phytopathology, 69 (6), pp 569 572 42 Bramley P M., Elmadfa I., Kafatos A., Kelly F J., Manios Y., Roxborough H E., Schuch W., Sheehy P J A., Wagner K H (2000), “Vitamin E”, J Sci Food Agric., 80, pp 13–938 43 Brasileiro A C M., Aragao F J L (2001), “Marker genes for in vitro selection of transgenic plants”, Plant Biotech, 3, pp.113–121 44 Brunt A A., Crabtree K., Dallwitz M J., Gibbs A J., Watson L., Zurcher E J (2003), Plant Viruses Online, Descriptions and Lists from the VIDE Database Version: 20th August 1996 45 Bubner B., Gase K., Baldwin I T (2004), “Two - fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real time PCR”, BMC Biotechnology, 4, pp 4-14 46 Cahoon E B., Ripp K G., Hal S E., McGonigle B (2002), “Transgenic production of epoxy fatty acids by expression of a cytochrome P450 enzyme from Euphorbia lagascae seed”, Plant Physiol., 128, pp 615–624 47 Carrington J C., Jensen P E., Schaad M C (1998), “Genetic evidence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement”, Plant J., 14, pp 393 - 400 48 Chiera J M., Finer J J., Grabau E A (2004), “Ectopic expression of a soybean phytase in developing seeds of Glycine max to improve phosphorus availability”, Plant Mol Biol., 56, pp 895–904 49 Cho E K and Goodman R M (1982), “Evaluation of resistance in soybeans to soybean mosaic virus strains”, Crop Sci., 22, pp 1133-1136 115 50 Christou P., McCabe D E., Swai W F (1988), “Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles”, Plant Physiol., 87, pp 671– 674 51 Chu Hoang Lan, Nguyen Tuan Anh, Nguyen Vu Thanh Thanh, Nguyen Hiep Hoa, Chu Hoang Mau (2010), “Characterization of the GmDREB5 gene isolated from the soybean cultivar Xanh Tiendai, Vietnam”, IEEE, pp 354358 52 Chu Hoang Mau, Nguyen Thuy Huong, Chu Hoang Lan, Nguyen Tuan Anh, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2011), “Characteristics of the gene encoding pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS) in Vietnam soybean cultivars (Glycine max L Merrill)”, IACSIT Press., pp 319-323 53 Chu Hoang Mau, Nguyen Tuan Anh, Pham Thi Thanh Nhan, Dinh Thi Ngoc, Bui Thi Tuyet (2010), “The characteristics of chaperonin gene isolated local soybean cultivars (Glycine max L Merrill) grown in Tay Nguyen region, Viet Nam”, CCEA, pp 452-456 54 Chyi Y., Jorgense R A., Goldstein D., Tanksley S D., Figueroa L F (1986), “Locations and stability of Agrobacterim-mediated T-DNA insertions in the Lycopersicon genome”, Mol Gen Genet., 204, pp 64 – 69 55 Cunha N B., Murad A M., Cipriano T M., Araújo A C G., Aragão F J L., Leite A., Vianna G R., McPhee T R., Souza G H M F., Waters M J.(2011), “Expression of f unctional recombinant human growth hormone in transgenic soybean seeds”, Transgenic Res., 20, pp 811–826 56 Dahmer M L., Collins G B., and Hildebrand D F (1991), “Lipid content and composition of soybean somatic embryos”, Crop Sci., 31, pp 741–746 57 Dahmer M L., Hildebrand D F., Collin, G B (1992), “Comparative protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos”, In Vitro Cell Dev Biol, 28, pp 106–114 58 DeCleene M and DeLey J (1976), “The host range of crown gall”, Bot Rev., 42, pp 389–466 59 Denli A M., Tops B B J., Plasterk R H A., Ketting R F., Hannon G J (2004), “Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex”, Nature 432, pp 231–235 116 60 DeRonde J A., Laurie R N., Caetano T., Greyling M M., Kerepesi I (2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica,138, pp 123– 132 61 Dougherty W., Parks, D (1991), “Post-translational processing of the tobacco etch virus 49-kDa small nuclear inclusion polyprotein: Identification of an internal cleavage site and delimitation of VPg and proteinase domains”, Virology, 183, pp 449-456 62 Dugas D V., Bartel, B (2004), “MicroRNA regulation of gene expression in plants”, Curr Opin Plant Biol., 7, pp 512–520 63 Elbashir S M., Lendeckel W., Tuschl T (2001), “RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs”, Genes Dev., 15, pp 188–200 64 Eun A J C., Seoh M L., Wong S M (2000), “Sim ultaneous quantitation of two orchid viruses by the TaqMan real-time RT-PCR”, J Virol Meth., 87, pp 151-160 65 FAO/WHO (1990), Expert consultation on protein quality evaluation Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 66 Finer J J., Nagasawa A (1988), “Development of an embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill.)”, Plant Cell Tissue and Organ Cult., 15, pp 125–136 67 Fire A., Xu S., Montgomery M K., Kostas S A., Driver S E., Mello C C (1998), “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”, Nature, 391, pp 806-811 68 Fondong V N., Pita J S., Rey M E C., de Kochko A., Beachy R N., Fauquet C M (2000) “Evidence of synergism between African cassava mosaic virus and a new double-recombinant geminivirus infecting cassava in Cameroon”, J Gen Virol., 81, pp 287–297 69 Fuentes A., Ramos P.L., Fiallo E., Callard D., Sánchez Y., Peral R., Rodríguez R., Pujol, M (2006), “Intron-hairpin RNA derived from replication associated protein C1 gene confers immunity to Tomato yellow leaf curl virus infection in transgenic tomato plants”, Transgenic Res.,15, pp 291-304 117 70 Furutani N., Yamagishi N., Hidaka S., Shizukawa Y., Kanematsu S., Kosaka Y (2007), “Soybean mosaic virus resistance in transgenic soybean caused by post-transcriptional gene silencing”, Breed Sci., 57, pp 123–128 71 Furutani N., Hidaka S., Kosaka Y., Shizukawa Y., Kanematsu S., (2006), “Coat protein gene - mediated resistance to soybean mosaic virus in transgenic soybean”, Breed Sci., 56, pp 119–124 72 Gelvin S B (2010), “Plant proteins involved in Agrobacterium - mediated genetic transformation”, Annu Rev Phytopathol., 48, pp 45–68 73 Gibbs A., Harrison B (1976), Plant virology the principles, Edward Amold 74 Gillings M., Broadbent P., Indsto J., Lee, R (1993), “Characterisation of isolates and strains of citrus tristeza clostero virus using restriction analysis of the coat protein gene amplified by the polymerase chain reaction”, J Virol Meth., 44, pp 305-317 75 Gough K H., Shukla D D (1992), “Major sequence variations in the N terminal region of the capsid protein of a severe strain of passion fruit woodiness potyvirus”, Arch Virol., 124, pp 389-396 76 Hamilton J H., Baulcombe D C (1999), “A species of small antisense RNA in post - transcriptional gene silencing in plants”, Science, 286, pp 950-952 77 Hammond R W., Crosslin J M., Pasini R., Howell W E., Mink G I (1999), “Differentiation of closely related but biologically distinct cherry isolates for prunus necrotic ringspot virus by polymerase chain reaction”, J Virol Meth., 80, pp 203-212 78 Hammond S M., Bernstein E., Beach D., Hannon G J (2000), “An RNAdirected nuclease mediates post - transcriptional gene silencing in Drosophila cells”, Nature, 404, pp 293 - 296 79 Hansen G., Wright M S (1999), “Recent advances in the transformation of plants”, Trends Plant Sci., 4, pp 226–231 80 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 118 81 Hartman G L., West E D., Herman, T K (2011), “Crops that feed the World Soybean-worldwide production, use and constraints caused by pathogens and pests”, Food Sec., 3, pp 5–17 82 Herbers K., Meuwly P., Frommer W B., Metraux J P., Sonnewald U (1996), “Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: Possible hexose sensing in the secretory pathway”, Plant Cell, (5), pp 793–803 83 Herbers K (2003), “Vitamin production in transgenic plants”, J Plant Physiol., 160, pp 821–829 84 Herman E M., Helm R M., Jung R., Kinney A J (2003), “Genetic modification removes an immunodominant allergen from soybean”, Plant Physiol., 132, pp 36–43 85 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 86 Hill J H (1999), Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean Diseases, 4th edn, pp 70–71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society 87 Hinchee M A W., Conner W D V., Newell C A., McDonnell R E., Sato S J, Gasser C S., Fischhoff D A., Re D B., Fraley R T., Horsch R B (1988), “Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer”, Nat Biotechnol., 6, pp 915–922 88 Homrich M S., Strohm B W., Weber R L M., Zanettini M H B (2012), “Soybean genetic transformation: A valuable tool for the functional study of genes and the production of agronomically improved plants”, Genet Mol Biol., 35, pp 998–1010 89 Hoppe P P., Krennrich G (2000), “Bioavailability and potency of naturalsource and all-racemic α -tocopherol in the human: a dis-pute”, Eur J Nutr., 39, pp 183–193 90 Hunst P L., Tolin S A (1983), “Ultrastructural cytology of soybean infected with mild and severe strains of soybean mosaic virus”, Phytopathology, 73, pp 615-619 119 91 James B (1982), Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 92 James C (2007), Global status of commercialized biotech/GM crops, Briefs 37, ISAAA 93 Jayaram C., Hill J H., Miller W A (1992), “Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene”, J Gen Virol., 73, pp 2067-2077 94 Jefferson R A., Burgess S M., Hirsh D (1986), “β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker”, Proc Natl Acad Sci USA,83, pp 8447–8451 95 Jefferson R A., Kavanagh T A., Bevan M W (1987), “GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, Embo., 6, pp 3901–3907 96 Jones M L., Mathewson C S., Adkins V K., Ayllon T (2003), “Use of behavioral contingencies to promote prevention of recurrent pressure ulcers”, Arch Phys Med Rehabil., 84 (6), pp 796-802 97 Karimi M., Inzé D., Depicker A (2002), “Gateway vectors for Agrobacterium - mediated plant transformation”, Trends Plant Sci., 7, pp 193 -195 98 Kasai M., Kanazawa A (2012), “RNA silencing as a tool to uncover gene function and engineer novel traits in soybean”, Breed Sci., 61, pp 468–479 99 Kasschau K D., Cronin S., Carrington J C (1997), “Genome amplification and long - distance movement functions associated with the central domain of tobacco etch potyvirus helper component-proteinase”, Virology, 228, pp 251262 100 Keller K E., Johansen I E., Martin R R., and Hampton R O (1998), “Potyvirus genome-linked protein (VPg) determines peaseed-borne mosaic virus pathotype-specific virulence in Pisum sativum”, Molec Plant Micr Inter 11: pp 124-130 101 Khalafalla M M., Rahman S M., El S H A., Nakamoto Y., Wakasa K., Ishimoto M (2005), “Optimization of particle bombard-ment conditions by monitoring of transient sGFP(S65T) expression in transformed soybean”, Breed Sci., 55, pp 257–263 120 102 Kim Y H., Kim O S., Lee B C., Roh J H., Kim M K., Im D J., Hur I B., Lee S C (1999), “Detection of soybean mosaic virus using RT-PCR”, Korean J Crop Sci., 44, pp 253-255 103 Kirichenko A N (2013), “The characterization of bean yellow mosaic virus isolated from soybean”, Mikrobiol Z., 75 (3), pp 68-73 104 Kirthi N., Maiya, S P., Murthy M R., Savithri H S.(2002), “Evidence for recombination among the tomato leaf curl virus strains/species from Bangalore”, India Arch Virol., 147 (2), pp 255 – 272 105 Kirthi N., Priyadarshini C G., Sharma P., Maiya S P., Hemalatha V., Sivaraman P., Dhawan P., Rishi N., Savithri H S (2004), “Genetic variability of begomoviruses associated with cotton leaf curl disease originating from India”, Arch Virol.,149, (10), pp 20 47– 2057 106 Kita Y., Nakamoto Y., Takahashi M., Kitamura K., Wakasa K., Ishimoto M (2010), “Manipulation of amino acid composition in soybean seeds by the combination of deregulated tryptophan bio-synthesis and storage protein deficiency”, Plant Cell Rep., 29, pp 87–95 107 Kita Y., Hanafy M S., Deguchi M., Hasegawa H., Terakawa T., Kitamura K., Ishimoto M (2009), “Generation and characterization of herbicide - resistant soybean plants expressing novel phosphino-thricin N-acetyltransferase genes”, Breed Sci., 59, pp 245–251 108 Koning, G., TeKrony, D M., Ghabrial, S A and Pfeiffer, T W (2002) Soybean mosaic virus (SMV) and the SMV resistance gene (Rsv1): influence on homopsis Spp seed infection in an aphid-free environment Crop Sci., 42, pp.178-185 109 Krause S R., Legall O., Fakhfakh H., Peypelut M., Marrakchi M., Varveri C., Pavan M A., Souche S., Lot H., Zerbini M., Candresse, T (2002), “Molecular and biological characterization of Lettuce mosaic virus (LMV) isolates reveals a distinct and widespread type of resistancebreaking isolate: LMV-Most”, Phytopathology, 92, pp 563-572 110 Kumar D., Yusuf M A., Singh P., Sardar M., Sarin N B (2013), “Modulation of antioxidant machinery in α-tocopherol-enriched transgenic 121 Brassica juncea plants tolerant to abiotic stress conditions”, Protoplasma, DOI 10.1007/s00709-013-0484-0 111 Li R., Yu K., Hatanaka T., Hildebrand D F (2010), “Vernonia DGATs increase accumulation of epoxy fatty acids in oil”, Plant Biotechnol., 8, pp 184–195 112 Li Z., Meyer S., Essig J S., Liu Y., Schapaugh M A., Muthukrishnan S., Hainline B E., Trick H N (2005), “High-level expression of maize γ-zein protein in transgenic soybean (Glycine max)”, Mol Breed., 16, pp 11–20 113 Lim H S., Ko T S , Hobbs H A., Lambert K N., Yu J M., McCoppin N K., Korban S S., Hartman G L., Domier L L (2007), “Soybean mosaic virus Helper Component-Protease Alters Leaf Morphology and Reduces Seed Production in Transgenic Soybean Plants”, Phytopathology, 97(3), pp 366372 114 Lopez S J., Kumar R R., Pius P K., Muraleedharan N (2004), “Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis [L.] O Kuntze)”, Plant molecular biology reporter, 22, pp 201-201 115 Maruthi M N., Seal S., Colvin J., Briddon R W., Bull, S E.(2004), “East African cassava mosaic Zanzibar virus – a recombinant begomovirus species with a mild phenotype”, Arch Virol., 149, pp 2365–2377 116 Masuta C., Nishimura M., Morishita H., Hataya T (1999), “A single amino acid change in viral genome- associated protein of potato virus Ycorrelates with resistance breaking in‘Virgin A Mutant’ tobacco”, Phytopathology, 89, pp 118 -123 117 McCabe D E., Swain W F., Martinell B J., Christou P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration”, Nat Biotechnol., 6, pp 923–926 118 McKern N M., Barnett O W., Whittaker L A., Mishra A., Strike P M., Xiao X W., Ward C W., Shukla D D (1993), “Sequence relationship among the coat proteins of strains of peamosaic, white lupin mosaic and bean yellow moasaic potyviruses”, Phytopathology, 83, pp 255-361 122 119 Nicolas O., Dunnington S W., Gotow L., Pirone T P., Hellmann G M (1997), “Variation in the VPg protein allow a potyvirus to overcome va gene resistance in tobacco”, Virology, 237, pp 452-459 120 Nishizawa K., Kita Y., Kitayama M., Ishimoto M (2006), “A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean”, Plant Cell Rep., 25, pp 1355–1361 121 Nishizawa K., Takagi K., Teraishi M., Kita A., Ishimoto M (2010), “Application of somatic embryos to rapid and reliable analysis of soybean seed components by RNA interference-mediated gene silencing”, Plant Biotechnol., 27, pp 409–420 122 Olhoft P M., Donovan C M., Somers, D A (2006), Soybean (Glycine max) transformation using mature cotyledonary node explants Methods in molecular biology: Agrobacterium protocols, 2nd ed Humana Press Inc, Totowa, N, pp 385-396 123 Owens L D., Cress, D E (1985), “Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids”, Plant Physiol., 77, pp 87–94 124 Padgette S R., Kolacz K H., Delannay X., Re D., LaVallee B J., Tinius C N., Rhodes K., Otero Y I., Barry G F., Eichholtz D A (1995), “Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line”, Crop Sci., 35, pp 1451–1461 125 Parrott W A., Williams E G., Hildebrand D F., Collins G B (1989), “Effect of genotype on somatic embryogenesis from immature cotyledons of soybean”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 16, pp 15–21 126 Paz M M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Banerjee A K., Wang K (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium - mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167–179 127 Paz M M., Martinez J C., Kalvig A B., Fonger T M., Wang K (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium - mediated soybean transformation”, Plant Cell Rep., 25, pp 206–213 123 128 Pfosser M F., Baumann H (2002), “Phylogeny and geographical differentiation of Zucchini yellow mosaic virus isolates (Potyviridae) based on molecular analysis of the coat protein and part of the cytoplamsic inclusion protein genes”, Arch Virol., 147, pp 1599-1610 129 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 130 Qi Q., Huang J., Crowley J., Ruschke L., Goldman B S., Wen L., Rapp, W D (2011), “Metabolically engineered soybean seed with en-hanced threonine levels: biochemical characterization and seed-specific expression of lysineinsensitive variants of aspartate kinases from the enteric bacterium Xenorhabdus bovienii”, Plant Biotechnol., 9, pp 193–204 131 Qiong H., Yanbing N., Kai Z., Yong L., Xueping Z (2011), “Virus-derived transgenes expressing hairpin RNA give immunity to Tobacco mosaic virus and Cucumber mosaic virus”, Virology Journal, : 41 132 Qusus S (1997), Molecular studies on soybean mosaic virus-Soybean interactions Ph.D Dissertation, Virginia Polytechnic Institute and State University, pp.163 133 Rao S S., Hildebrand D (2009), “Changes in oil content of transgen-ic soybeans expressing the yeast SLC1 gene”, Lipids, 44, pp 945–951 134 Reinhart B J., Weinstein E G., Rhoades M W., Bartel B., Bartel D P (2002), “MicroRNAs in plants”, Genes Dev., 16, pp 1616–1626 135 Restrepo H M., Carrington J C (1994), “The tobacco etch potyvirus 6kilodalton protein is membrane associated and involved in viral replication”, J Virol., 68, pp 2388-2397 136 Rhoades M W., Reinhart B J., Lim L P., Burge C B., Bartel B., Bartel D P (2002), “Prediction of Plant MicroRNA Targets”, Cell, 110, pp 513-520 137 Roberts C A., Dietzgen R G., Heelan L A., Maclean D J (2000), “Real time RT-PCR fluorescnet detection of tomato spotted wilt virus”, J Virol Meth., 88, pp.1-8 124 138 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 139 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 140 Schaad M C., Haldeman C R., Cronin S., Carrington J C (1996), “Analysis of the VPg-proteinase (NIa) encoded by tobacco etch potyvirus: Effects of mutations on the subcellular transport, proteolytic processing, and genome amplification”, J Virol., 70, pp 7039-7048 141 Schwarz D S., Hutvagner G., Haley B., Zamore P D (2002), “Evidenc that siRNAs funtion as guides, nt primers in the Drosophila and human RNAi pathways”, Mol Cell, 10, pp 537-548 142 Selvaraj T., Nisha M C., Rajeshkumar S (2009), “Effect of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal of science and technology, (1), pp 222-234 143 Setchell K D (1998), “Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones”, J Clin Nutr., 68, pp 1333–1346 144 Shukla D D., Ward C W (1988), “Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group”, J Gen Virol., 69, pp 2703-2710 145 Shukla D D., Ward C W., Brunt, A A (1994), The Potyviridae, CAB International, University Press, Cambridge, UK 146 Smith N A., Singh S P., Wang M B., Stoutjesdijk P A., Green A G., Waterhouse P.M (2000), “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”, Nature, 407, pp 319–320 147 Srivastava V., Vasil V., Vasil I K (1996), “Molecular characterization of the face of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.)”, Theor Appl Genet., 92, pp 1031-1037 125 148 Stewart C N J., Adang M J., All J N., Boerma H R., Cardineau G., Tucker D., Parrott W A (1996), “Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryIAc gene”, Plant Physiol., 112, pp 121–129 149 Sugano M (2005), Soy in Health and Disease Prevention, CRC Press, New York, USA 150 Sunkar R., Zhu, J.K (2004), “Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and Other Small RNAs from Arabidopsis”, Plant Cell, 16, pp 2001-2019 151 Tabashnik B.E (1994), “Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis”, Annu Rev Entomol., 39, pp 47–79 152 Takagi K., Nishizawa K., Hirose A., Kita A., Ishimoto M (2011), “Manipulation of saponin biosynthesis by RNA interference-mediated silencing of β-amyrin synthase gene expression in soybean”, Plant Cell Rep., 30, pp 1835–1846 153 Tavva V S., Kim Y H., Kagan I A., Dinkins R D., Kim K H., Collins G B (2007), “Increased α-tocopherol content in soybean seed overexpressing the Perilla frutescens γ -tocopherol methyltransferase gene”, Plant Cell Rep., 26: pp 61–70 154 Tomlin E S., Branch S R., Chamberlain D., Gabe H., Wright M S., Stewart, C.N (2002), “Screening of soybean, Glycine max (L.) Merrill, lines for somatic embryo induction and maturation capability from immature cotyledons”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 38, pp 543–548 155 Topping J.F (1998), “Tobacco transformation”, Methods of Mol Biol., 81, pp 365 – 372 156 Topping J F., Wei W., Lindsey, K (1991), “Functional tagging of regulatory elements in plant genome”, Development, 112, pp 1009-1019 157 Tougou M., Yamagishi N., Furutani N., Shizukawa Y., Takahata Y., Hidaka S (2007), “Soybean dwarf virus -resistant transgenic soybeans with the sense coat protein gene”, Plant Cell Rep., 26, pp 1967–1975 158 United Soybean Board (2000), World Soybean Production 1999, Report, Chesterfield, MO, USA 126 159 Urcuqui I S., Haenni A L., and Bernardi F (2001), “Potyvirus proteins: a wealth of functions” Virus Research 74: pp 157-175 160 Valente M A S., Faria J A Q A., Soares-Ramos J R L., Reis P A B., Pinheiro G L., Piovesan N D., Morais A T., Menezes C C., Cano M A O., Fietto L G (2009), “The ER luminal binding protein (BiP) mediates an increase in drought tolerance in soybean and delays drought-induced leaf senescence in soybean and tobacco”, J Exp Bot., 60, pp 533–546 161 Vanderveken J J., Harris K F.,Maramorosch K (1977), Oils and other inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus Vectors Academic Press, London, pp 435-454 162 Walker D., Boerma H R., All, J Parrott W (2002), “Combining cry1Ac with QTL alleles from PI 229358 to improve soybean resistance to lepidopteran pests”, Mol Breed., 9, pp 43–51 163 Walsh K., North J., Barker I., Boonham N (2001), “Detection of different strains of Potato virus Y and their mixed infections using com petetive RTPCR”, J Virol Meth., 91, pp 167-173 164 Wang D., Maule A.J (1995), “Inhibition of host gene expression associated with plant virus replication”, Science, 267, pp 229-231 165 Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B (1998), “Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA”, Proc Natl Acad Sci USA, 95, pp 13959–13964 166 Wesley S V., Helliwell C A., Smith N A., Wang M B., Rouse D T., Lie Q., Gooding P S., Singh S P., Abbott D., Stoutjesdijk P A., Robinson S P., Gleave A P., Green A G., Waterhouse, P M (2001), “Construct design for efficient, effective and high - throughput gene silencing in plants”, Plant, 27, pp 581–590 167 Wingard S A (1928), “Hosts and symptoms of ring spot, a virus disease of plants”, J Agric Res., 37, pp 127−153 168 Won S L, Yul H K., Kook H K (2003), “Complete Genome Sequences of the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, Plant Pathol., 19 (3), pp 171-176 127 169 Xue R G., Xie H F., Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett., 28, pp 1551–1557 170 Yadav N S (1996), “Genetic modific ation of soybean oil quality In : Verma, D P S and R.C.Shoemaker (eds.) Soybean”, Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, Cab International, USA, pp 165–188 171 Yamada T., Takagi K., Ishimoto, M (2012), “Recent advances in soybean transformation and their application to molecular breeding and genomic analysis”, Breeding Science, 61, pp 480–494 172 Yamada Y., Nishizawa K., Yokoo M., Zhao H., Onishi K., Teraishi M., Utsumi S., Ishimoto M., Yoshikawa M (2008), “Anti-hypertensive activity of genetically modified soybean seeds accumulating novo – kinin”, Peptides, 29, pp 331–337 173 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 174 Ye F., Signer E R (1996), “RIGS (repeat - induced gene silencing) in Arabidopsis is transcriptional and alters chromatin configuration”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp 10881-10886 175 Yin Z., Malepszy S (2003), “The transgenes are expressed with different level in plants”, Biotechnologia, (61), pp 236-260 176 Zeng P., Vadnais D A., Zhang Z., Polacco J.C (2004), “Refined glu-fosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill]”, Plant Cell Rep., 22, pp 478–482 177 Zhang C., Song Y., Jiang F., Li G., Jiang Y., Zhu C., Wen F F (2012), “Virus resistance obtained in transgenic tobacco and rice by RNA interference using promoters with distinct activity”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 742748 178 Zhang X., Sato S., Ye X., Dorrance A E., Morris T J , Clemente T E., Qu F., (2012), “Robust RNAi-based resistance to mixed infection of three viruses in 128 soybean plants expressing separate short hairpins from a single transgene”, Phytopathology, ,101 (11), pp 1264-1269 179 Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T E (1999), “The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated trans-formation of soybean”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 56, pp 37–46 180 Zhu S., Walker D R., Boerma H R., All J., Parrott W A (2008), “Effects of defoliating insect resistance QTLs and a cry1Ac transgene in soybean nearisogenic lines”, Theor Appl Genet., 116, pp 455–463 181 Zilberman D., Cao X., Jacobsen S E (2003), “Argonaute4 control of locus specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation”, Science 299 (5607), pp 716-719 182 www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/nucleotide ... thuật RNAi chiến lược tạo chuyển gen kháng virus [3], [31], [98] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi. .. tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm đậu tương Việt Nam (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV hai loài SMV BYMV (iii) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi. .. 3.2 Phân tích tương đồng gen CP hệ gen SMV BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác Xác định đoạn bảo thủ gen CP tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin gen CP 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc