kháng virus
RNAi là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân thực và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hoà sự phát triển, tái cấu trúc nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus [34], [78]. Gần
đây, RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [36]. Nguyễn Thị Hải Yến (2012) đã sử dụng kỹ thuật RNAi bước đầu thành công trong việc tạo cây cà chua chuyển gen kháng virus khảm vàng lá cà chua [26].
Các bước chính ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo cây chuyển gen bao gồm: (1) Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) Sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen.
Để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi trong kỹ thuật chuyển gen kháng virus, công việc đầu tiên là việc thu thập và kiểm tra mẫu cây nhiễm virus từ các vùng sinh thái khác nhau. Kiểm tra sự có mặt của virus từ các mẫu thu được bằng phương pháp sinh học phân tử. Bước tiếp theo tiến hành phân lập gen hoặc một số vùng gen khác trong hệ gen của virus trên cơ sở thu thập thông tin về genome của virus, đặc biệt những thông tin của gen CP và một số gen trong hệ gen của virus, thiết kế các cặp mồi để nhân gen CP và một số gen khác, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen đích. Trên cơ sở phân tích so sánh trình tự gen của các dòng virus, chọn vùng bảo thủ để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi để chuyển vào đối tượng thực vật. Phân tích cây chuyển gen và đánh giá tính kháng của các dòng cây chuyển gen, tuyển chọn dòng cây chuyển gen kháng bệnh do virus gây bệnh [26].
Ngoài ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus, kỹ thuật RNAi có thể giúp cho việc nghiên cứu chức năng của gen trong hệ gen thực vật. Điều này đã mở ra triển vọng sử dụng các thư viện siRNA để nhận biết và phân tích sự
biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan đến các bệnh của thực vật. Thư viện các nhân tố RNAi có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu để phân tích chức năng hệ gen cây trồng. Xây dựng thư viện RNAi của tất cả các bệnh virus trên một đối tượng cây trồng cụ thể sẽ góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus.
Ứng dụng công nghệ RNAi trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus là một lĩnh vực rất mới mẻ và được cả thế giới quan tâm. Việc tạo cây chuyển gen kháng virus đã mở ra một triển vọng mới trong tạo thực phẩm sạch và an toàn cho môi trường.
Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (CP, Rep...) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế. Nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này. Trong những nghiên cứu đó, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy rằng, khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự câm gen là cao nhất [146], [166]. Năm 2007, Shinichiro và đtg đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng virus cao đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nhìn chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus hoặc làm giảm nhẹ các triệu chứng bệnh. Cũng vào năm này, Bonfim và đtg đã tạo ra được một dòng đậu tương chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với tính kháng lên đến 93% [39]. Furutani và đtg (2007) đã thành công tạo cây đậu tương biến đổi gen kháng SMV bằng kỹ thuật RNAi [70].
Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus mới chỉ đang được bắt đầu. Từ việc tổng kết các công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong thực tiễn, Đỗ Năng Vịnh (2007) đã khẳng định RNAi là một kỹ thuật mạnh mẽ và có triển vọng to lớn trong việc ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus và là kỹ thuật có thể chủ động tạo ra các giống cây trồng kháng các bệnh do virus gây ra ở thực vật [22]. Sự kết hợp kỹ thuật chuyển gen và RNAi sẽ là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc cải thiện và tăng cường khả năng kháng virus ở cây trồng.
Việc phân lập các gen thành phần của virus làm vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen để chuyển vào thực vật tạo cây chuyển gen kháng virus tại Việt Nam là rất cần thiết. Chu Hoàng Hà và đtg (2004) đã phân tích tính đa dạng trên cơ sở so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam [4]. Tiếp đến là nghiên cứu sự đa dạng trong trình tự gen CP của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua [23], của virus gây bệnh đốm của cây đu đủ [4], của virus Y ở cây khoai tây [16]. Ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo cây trồng kháng virus đã và đang được tiến hành nghiên cứu ở một số phòng thí nghiệm và thu được thành công nhất định. Nhóm nghiên cứu của Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là một trong những đơn vị đi đầu và thành công trong việc ứng dụng công nghệ RNAi để tạo cây trồng kháng virus và một số dòng cây chuyển gen kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này [3], [4]. Thành công đầu tiên có thể kể đến là cây thuốc lá chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus (CMV) và Tobacco mosaic virus (TMV). Những dòng thuốc lá chuyển đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen CP của CMVvà TMV đã cho thấy hiệu quả kháng lên tới 60% đối với hai chủng virus này. Các cây biểu hiện khả năng kháng cao sau 3 lần lây nhiễm đồng thời hai chủng virus đã cho thấy khả năng kháng bệnh được duy trì cho thế hệ sau [19]. Nghiên cứu ứng dụng
kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus, các tác giả đã phát triển thành công 6 cấu trúc RNAi, tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng virus Cucumber mosaic virus cao [19]. Tiếp đến là nghiên cứu đu đủ kháng bệnh đốm vòng do Papaya ringspot virus. Kết quả ban đầu cho thấy, trong số 45 dòng đu đủ chuyển gen được chọn tạo, có 34/45 dòng có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng. Dù trồng trong môi trường nhiễm bệnh nhưng các cây đu đủ chuyển gen vẫn phát triển mạnh, cho quả đều, đẹp, năng suất cao [3]. Nguyễn Thị Hải Yến và đtg (2009, 2011) đã thiết kế cấu trúc RNAi và tạo được dòng cà chua kháng Tomato yellow leaf curl Vietnam virus bằng kỹ thuật RNAi [24], [25].
Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng cho thấy, tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector chuyển gen. Cấu trúc vector chứa nhiều gen quan trọng của Tomato yellow leaf curl Vietnam virus có khả năng kháng cao hơn cấu trúc vector chứa đơn gen virus [24], [25], [26]. Điều này phụ thuộc vào một số gen virus có khả năng ức chế con đường hoạt động của RNAi. Ngoài ra còn một số loại cây trồng khác cũng đang được tiến hành nghiên cứu chuyển gen để tạo dòng cây kháng bệnh virus như đậu tương, cam, quýt, dưa hấu…
Chương 2