M: Thang DNA 1kb; CPi: Đoạn CPi khuếch đại từ đoạn CPi (SMV-BYMV)
3.2.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi (SMV-BYMV)
Trong thí nghiệm này, plasmid pEN-CPi (SMV-BYMV) tiếp tục tham gia phản ứng LR với vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) có xúc tác của hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM II để tạo vector chuyển gen nhị thể mang cấu trúc RNAi chứa đoạn CPi (SMV-BYMV). Kết quả tạo được vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) (Hình 3.21) theo cơ chế tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi (SMV-BYMV) với vector pK7GWIWG2(II).
Hình 3.21. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR;
LB: left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan: gen kháng kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị trí đoạn CPi chèn vào; vị trí cắt giới hạn của các enzyme tương ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồi tương ứng
Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) được dòng hóa vào tế bào E.coli One Shot®. Tiến hành phản ứng colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc chứa vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV), kết quả đã thu được các dòng khuẩn lạc dương tính với PCR. Cấu trúc này sẽ tạo ra dạng kẹp tóc
RNA sau khi được chuyển vào cây trồng và sẽ khởi động cơ chế RNAi để kháng lại các RNA của virus có trình tự tương đồng.
Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR đã được sử dụng để tách chiết plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi (SMV-BYMV). Plasmid pK7GW-CPi (SMV-BYMV) sau khi tách chiết được cắt bằng enzyme giới hạn Xba I và Hind III và điện di kiểm tra sản phẩm, kết quả được trình bày ở hình 3.22.
Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt Vector pK7GW bằng enzyme
Xba I và Hind III
M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1: pK7GW gốc cắt bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn DNA khoảng 1463bp và 3310bp; 2-3: pK7GW-CPi (SMV-BYMV) cắt bằng Xba I và Hind III thu khoảng 1463bp và 3310bp; 2-3: pK7GW-CPi (SMV-BYMV) cắt bằng Xba I và Hind III thu được 2 đoạn DNA khoảng 1,1kb và 3,0kb;
Trong nghiên cứu này, vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi (CPi- SMV) chứa đoạn gen CPi là vùng bảo thủ của gen CP ở các dòng SMV đã được thiết kế thành công để chuyển vào thực vật nhằm tạo cây kháng SMV. Cách tiếp cận nghiên cứu tạo cấu trúc RNAi từ gen CP của virus gây bệnh xoăn vàng lá (Tomato Yellow Leaf Curi Virus-TYLCV) cũng được thực hiện ở cà chua với cấu trúc vector đơn gen và hai gen để cải thiện khả năng kháng
1,4kb 1,1kb 2,0kb 1,0kb M 1 2 3 3,0kb
TYLCV ở cây cà chua [26] và cũng được Furutani và đtg (2007) đề cập đến trong nghiên cứu cải thiện tính kháng SMV ở cây đậu tương [70].
Trong thực tiễn vì cây có thể nhiễm đồng thời nhiều loại virus, cho nên nghiên cứu biện pháp nhằm giảm thiểu thiệt hại về năng suất và chất lượng hạt đậu tương được đặc biệt chú trọng. Chính vì vậy, vector chuyển gen chứa đoạn bảo thủ CPi của cả hai loài virus SMV và BYMV được phát triển cho mục đích tạo cây chuyển gen kháng được cả hai loài virus này. Dựa vào vùng bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV, ứng dụng kỹ thuật Gateway, chúng tôi đã phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa CPi từ hai loài virus SMV và BYMV (pK7GW-CPi [SMV-BYMV]). Hướng tiếp cận này cũng đã thành công trên cây thuốc lá trong nghiên cứu của Phạm Thị Vân và đtg (2009) khi thực hiện chuyển cấu trúc vector RNAi chứa đoạn gen CP của hai loài virus Tobacco mosaic virus và Cucumber mosaic virus [21].
Khi nghiên cứu biện pháp tăng cường quá trình phiên mã của gen chuyển trong cây chủ, các công trình đã tập trung tìm hiểu vùng điều khiển, đặc biệt là promoter, nhân tố khởi đầu sự phiên mã. Trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật, người ta thường sử dụng một số promoter như 35S, act, mas… trong đó 35S là một promoter mạnh. Trong nghiên cứu của chúng tôi, cấu trúc RNAi được thiết kế mang đoạn gen CPi và promoter 35S, thử nghiệm chuyển vào cây thuốc lá C9-1 với nhằm khảo sát mức độ biểu hiện tính kháng virus trên cây thuốc lá chuyển gen để đánh giá tính khả thi của nghiên cứu này.
Vector chuyển gen mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và tiếp tục chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri, kết quả được thể hiện ở hình 3.23. Kết quả đã thu được một băng điện di DNA có kích thước khoảng 0,5kb đúng bằng kích thước của đoạn CPi (SMV-BYMV). Những dòng A. tumefaciens sau khi kiểm tra được lưu giữ trong glycerol ở -84oC để phục vụ chuyển gen tạo cây kháng virus SMV và BYMV.
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc A.
tumefaciens
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: Sản phẩm PCR của 10 dòng khuẩn lạc)