D: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ;
E: Hình thái rễ của cây thuốc lá chuyển gen trên môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen trồng trên bầu đất
F: Cây thuốc chuyển gen trồng trên bầu đất
A B C
Sau 2 lần biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào các mảnh lá thuốc lá với 30 mảnh lá/ lần, kết quả được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào
mảnh lá thuốc lá C9-1 Cấu trúc RNAi Số mảnh lá biến nạp Số mảnh lá sống sót Số cụm chồi tạo thành Số cây sống sót Số cây ra bầu đất Số cây trồng tại nhà lưới pK7GW-CPi (SMV-BYMV) 2 x 30 = 60 38 82 131 40 26 ĐC0* 30 0 - - - - ĐC1* 30 30 79 105 10 10
Ghi chú: * ĐC0: thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; * ĐC1: thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, với 60 mảnh lá cây thuốc lá C9-1 biến nạp sử dụng thí nghiệm có 38 mảnh sống sót, tạo ra 82 chồi và thu được 131 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung kháng sinh. Số cây ra bầu đất là 40 cây và có 26 cây trồng tại nhà lưới có biểu hiện xanh tốt, mập mạp. Trong khi đó, ở ĐC0 trong 30 mảnh lá không có mẫu nào sống sót; còn ở ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy lên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu được 105 cây sống, số cây ra bầu đất là 10 cây và đem cả 10 cây trồng ở nhà lưới.
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 3-4 tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.
3.3.2. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen
3.3.2.1. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) trong cây thuốc lá chuyển gen, chúng tôi tiến hành thu các mẫu lá non của 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 trồng tại nhà lưới sau 3 - 4 tuần ra cây. DNA tổng số từ các mẫu lá được tách chiết và điện di trên gel agarose (Hình 3.25).
Hình 3.25. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ các mẫu lá cây thuốc lá chuyển gen
(1-26: Băng DNA của 26 mẫu lá của 26 dòng thuốc lá chuyển gen)
Trên ảnh điện di ở hình 3.25, các băng DNA tổng số của 26 mẫu lá thu từ 26 dòng thuốc lá chuyển gen đều gọn, có độ nguyên vẹn và đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR.
Tiến hành kiểm tra sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy đoạn DNA thu được có kích thước là 573 bp (Hình 3.26).
Kết quả thể hiện ở hình 3.26 cho thấy, tất cả 26/26 dòng đều dương tính với phản ứng PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước 573bp, tương tự như kết quả ở mẫu đối chứng dương. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước của cấu trúc CPi (SMV-BYMV). Vì vậy, có thể
khẳng định cấu trúc CPi (SMV-BYMV) đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá giống C9-1.
Hình 3.26. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trong các dòng cây thuốc lá chuyển gen
1-26: 26 dòng thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dương là plasmid pK7GW-CPi (SMV- BYMV; (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ cây thuốc lá
không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific)
3.3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV của các dòng thuốc lá chuyển gen trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo thuốc lá chuyển gen trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo
Điều quan trọng nhất trong nghiên cứu này là việc tạo ra các dòng thuốc lá chuyển gen kháng đơn loài virus và kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. Do đó, để kiểm tra tính kháng đối với virus, 26 dòng thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR và 10 dòng đối chứng không chuyển gen được lây nhiễm nhân tạo với SMV và BYMV bằng dịch chứa virus qua ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau mỗi lần lây nhiễm, các dòng thuốc lá được quan sát sự biểu hiện của virus. Hình 3.27 thể hiện hình thái lá cây thuốc lá kháng bệnh, nhiễm bệnh của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen.
Kết quả đánh giá tính kháng bệnh virus khảm của 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen và 10 cây đối chứng được trình bày ở bảng 3.9. Số liệu thống kê ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ kháng hoàn toàn của các dòng thuốc lá chuyển
gen mang cấu trúc CPi (SMV-BYMV) khá cao (19 cây kháng/26 cây lây nhiễm, tương ứng với 73,08%).
Hình 3.27. Hình thái lá của một số dòng thuốc lá chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen
A. Dòng cây chuyển gen T0-5 kháng virus; B: Dòng cây chuyển gen T0-12 nhiễm nhẹ virus;