A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SM
Xuất phát từ chức năng của gen CP trong sự xâm nhập và hoạt động của SMV ở tế bào chủ, sự lan truyền của SMV giữa các tế bào trong cơ thể chủ và nguyên lý của kỹ thuật RNAi, vùng bảo thủ của gen CP đã được lựa chọn để thiết kế cấu trúc RNAi. So sánh các trình tự gen công bố trên Ngân hàng gen quốc tế, vùng tương đồng đã được xác định là cơ sở thiết kế cặp mồi PCR cho phân lập đoạn bảo thủ của gen CP từ các dòng SMV.Kết quả so sánh 96 trình tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI cho thấy các trình tự gen CP
khác nhau có độ tương đồng từ 94% đến 100%, kích thước vùng tương đồng có số lượng hơn 700 nucleotide. Dựa trên trình tự gen CP mang mã số X63771 trên Ngân hàng gen quốc tế chúng tôi đã thiết kế cặp mồi PCR SMVcp-F/SMVcp-R (Bảng 3.1) để nhân đoạn tương đồng của gen CP dự tính có kích thước là 720 nucleotide.
Bảng 3.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR được thiết kế sử dụng nhân bản đoạn gen CP
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide
SMVcp-F 5’-TTACCATCAGGCAAGGAGCAGGAAG -3’
RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá đậu tương nhiễm virus SMV thu được tại Sơn La và một số địa phương khác được kiểm tra bằng điện di trên gel argarose. Kết quả cho thấy sản phẩm RNA tổng số tách chiết được đảm bảo chất lượng cho phản ứng phiên mã ngược để tạo cDNA và tiến hành phản ứng PCR.
Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP với cặp mồi SMVcp-F/SMVcp-R được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel argarose, kết quả cho thấy chỉ có hai mẫu thu tại Sơn La (SL1, SL2) cho sản phẩm PCR như tính toán khi thiết kế cặp mồi (Hình 3.1), còn ở các mẫu khác phản ứng PCR không thu được kết quả.
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CP từ SMV (M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 : SL1; 2 : SL2.)
Hình 3.1 cho thấy một băng DNA đặc hiệu xuất hiện với kích thước khoảng 0,7kb, đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR.
Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel, tinh sạch và gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT sau đó được nhân dòng trong tế bào E. coli DH5. Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 0,7kb đúng như dự tính (Hình 3.2).
1kb
0,7kb
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc
(M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc SL1; 4, 5, 6: Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc SL2)
Những dòng khuẩn lạc dương tính với PCR đã được chọn để tách plasmid. Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen CP được thực hiện trên máy xác định trình tự. Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP
phân lập từ SMV dòng SL1 và SL2 gây bệnh khảm lá trên cây đậu tương thu tại Sơn La có 720 nucleotide (Hình 3.3).
Kết quả so sánh với trình tự của đoạn gen CP trên Ngân hàng gen quốc tế có mã số X63771 cho thấy đoạn gen CP mà chúng tôi phân lập được từ SMV dòng SL1 có độ tương đồng là 100%, còn trình tự đoạn gen CP phân lập từ dòng SL2 có độ tương đồng là 99,3%, và hai trình tự đoạn gen CP của dòng SL1 và SL2 có độ tương đồng là 99,3%. Như vậy có thể kết luận rằng trình tự cDNA mà chúng tôi phân lập được là đoạn gen CP mã hóa protein CP của SMV dòng SL1 và SL2.
Hai trình tự nucleotide của đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 và dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102 và HG965103.
1kb
0,7kb M 1 2 3 4 5 6
Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1, SL2 và X63771
Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.3 cho thấy trình tự
đoạn gen CP của dòng virus SL2 có sự sai khác so với trình tự đoạn gen CP
có mã số X63771 và với dòng SL1 ở 5 vị trí nucleotide: 31, 38, 686, 690, 694
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự mang mã số X63771 Vị trí nucleotide X63771 SL1 SL2 31 A A T 38 C C G 686 A A G 690 G G T 694 T T A
Protein CP mang mã số CAA45307 trên Ngân hàng gen quốc tế được
suy diễn từ trình tự gen đoạn CP mang mã số là X63771 ở virus SMV có 267 amino acid; còn protein suy diễn từ trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1 và SL2 mà chúng tôi phân lập có 240 amino acid, kết quả so sánh vùng tương
đồng của ba trình tự amino acid được trình bày ở hình 3.4.
Kết quả ở hình 3.4 cho thấy protein (mã số CAA45307) do đoạn gen
CP mã hóa có hệ số tương đồng so với protein suy diễn của dòng SL1 là 100% và so với ở dòng SL2 là 97,9%. Năm vị trí sai khác về trình tự amino
acid của protein suy diễn ở dòng SL2 so với protein CAA45307 và dòng SL1
Hình 3.4. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein CP của SMV dòng
SL1, SL2 và CAA45307
Bảng 3.3. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số CAA45307
Vị trí amino acid CAA45350 SL1 SL2
11 M M L
13 T T R
220 N N S
230 K K N
Poty-coat (Potyvirus coat protein) là trình tự amino acid của coat protein (CP) tương đồng giữa các loài virus thuộc nhóm Potyvirus. Vùng Poty-coat của CP ở SMV mã số CAA45307 có 232 amino acid, vùng Poty- coat của CP dòng SL1 và dòng SL2 có 208 amino acid. Kết quả so sánh vùng tương đồng về trình tự amino acid của vùng Poty-coat của CP dòng SL1 và dòng SL2 so với vùng Poty-coat của CP ở SMV có mã số CAA45307 cho thấy dòng SL2 có sự sai khác ở 3 vị trí amino acid (vị trí 198, 199, 200) so với CAA45307 và với dòng SL1 (Hình 3.5).
Hình 3.5. So sánh trình tự amino acid của vùng Poty-coat của dòng SL1, SL2 và của protein có mã số CAA45307