M: Thang DNA 1kb; CPi: Đoạn CPi (0,294 kb) khuếch đại từ đoạn gen CPi –SM
3.2.1.2. Kết quả tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi-SM
Tiến hành thí nghiệm tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi- SMV với vector nhận pK7GWIWG2(II), bằng phản ứng LR tạo thành vector chuyển gen mang cấu trúc CPi –SMV (pK7GW-CPi-SMV). Biến nạp vector pK7GW-CPi-SMV vào tế bào E.coli One Shot và tiến hành chọn dòng. Sử dụng kỹ thuật PCR nhân bản đoạn gen CPi-SMV trực tiếp từ 3 dòng khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CP-Fi/SMV-CP-Ri để xác định sự có mặt của đoạn gen CPi-SMV trong vector pK7GWIWG2(II) và kết quả thu được băng điện di DNA có kích thước khoảng 0,29kb, đúng bằng kích thước của đoạn CPi-SMV (Hình 3.13A). Cùng với kết quả tách plasmid pK7GW-CPi-SMV từ những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR (Hình 3.13B) đã khẳng định kết quả dòng hóa thành công vector pK7GW-CPi-SMV trong vi khuẩn E.coli One Shot.
1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4
A B
Hình 3.13. A: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ pK7GW-CPi-SMVvới cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri(M; thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3: Các dòng khuẩn lạc phân tích); B: Kết quả điện di kiểm tra tách plasmid pK7GW-CPi-
SMV(1, 2, 3: Các dòng plasmid)
Sau khi tách chiết được plasmid tái tổ hợp, tiếp tục kiểm tra plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi-SMV bằng cách sử dụng enzyme giới hạn Xba I và Hind III để cắt plasmid tái tổ hợp, kết quả điện di thu được sản phẩm cắt gồm 3 đoạn DNA tương ứng với kích thước khoảng 8,1kb, 3,1kb và 0,85kb (Hình 3.14). Như vậy có thể kết luận đã thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi-SMV (pK7GW-CPi-SMV).
Hình 3.14.Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm cắt bằng Xba I và Hind III
Giếng 1-2-3-4: pK7GW-CPi (SMV-BYMV) cắt bằng XbaI và Hind III thu được 3 đoạn DNA, trong đó có đoạn với kích thước 0,85kb; M: thang DNA chuẩn 1 kb; giếng 5 là pK7GW gốc, cắt bằng Xba I và Hind III thu được 2 đoạn DNA khoảng 1463bp và 3310bp;
3310 1463 1463 3310 1463 0,29kb 0,2 kb0,3kb M 1 2 3 1 2 3 8,1kb 3,1kb 0,85kb 1 2 3 4 5 M 1,0kb 3,0kb 2,0kb 3310 1463 1 2 3 4 5 M 3310 1463